CN104436305A - 以脱细胞生物膜为载体的心肌补片及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以脱细胞生物膜为载体的心肌补片及制备方法与应用。本发明首先通过对天然生物膜进行脱细胞处理；接着在脱细胞生物膜上交联营养物质；在交联有营养物质的脱细胞生物膜上种植目的细胞；对初步构建的细胞片进行培养后，得到以脱细胞生物膜为载体的心肌补片。本发明可获得具有良好增殖分化活性、力学强度及足够营养支持的心肌补片，不仅是组织工程的突破，也可运用于临床对心肌梗死的治疗。本发明原理可靠，重现性好，可用于标准化生产。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程领域，特别涉及一种以脱细胞生物膜为载体的心肌补片及制备方法与应用。
背景技术
目前对于心肌梗死疾病的治疗手段仅能消除血管阻塞，缓解心室重构，但不能逆转坏死心肌，使用各种来源的细胞治疗方案日益受到人们的重视并被认为是最具潜力的治疗方法。其中利用各种目的细胞制备心肌补片贴附于心肌梗死区的细胞输送方式，为治疗心肌梗死性疾病提供了更为有效的治疗策略。该类产品的优势在于：①可用于治疗更大面积的心肌梗死区；②细胞的初始存留率明显增加；③相同数量的细胞产生的临床治疗效果显著改善，可进一步改善左室射血分数，降低左心室收缩末期压，改善左室收缩功能；④可通过旁分泌的方式改善心肌细胞功能。
虽然，目前心肌补片产品还未达到临床应用阶段，国内外均无此类上市产品，但围绕该类产品的关键技术上已形成了以下几种可行的技术方案：①无载体心肌补片；②以合成材料为载体心肌补片；③以天然基质材料为载体的心肌补片。
理论分析和实验室阶段的研究显示：不同的心肌补片制备方法可得到不同力学强度和生物学性质的细胞片产品，并最终影响细胞片体内移植后的治疗效果。其中无载体心肌补片制备方法，将目的细胞种植在具备光敏、温敏、磁性或粗糙颗粒等特殊性质的培养材料表面，待目的细胞融合生长为所需细胞片结构时，通过改变物理学作用(改变入射光、温度、磁力或直接剥离)，实现构建心肌补片产品与培养容器的分离。该方案可得到排列紧密纯净细胞片，使用它们作为心肌补片时，可直接使用，无需缝合。但由于缺乏支持载体，这类心肌补片产品无法提供足够的力学强度，在实施心脏表面移植后，体内组织摩擦容易导致细胞片完整性破坏，治疗细胞丢失量较高。此外，手术操作难度较大。以合成材料为载体的心肌补片，是将目的细胞种植于高分子合成材料载体上，在进行体内移植时，将目的细胞和合成材料载体同时移植的一种方案。该方案使用的高分子合成材料载体为心肌补片产品提供了一定的力学强度，但该类材料移植后多存在较快的体内降解现象，同时也会存在诱发移植部位炎症等不良反应。以天然基质材料为载体的心肌补片产品，所使用的载体多来自包括肠系膜、羊膜等天然生物膜，此法的优点在于天然基质材料本身具备了黏附心脏表面的天然三维结构，能够提供更加适宜的生物力学支持(顺应性、粘弹性和张力性质均优于高分子合成材料)。此外天然基质材料所包含丰富细胞外基质成分维持目的细胞生物学功能提供了重要支持，理论上，该方案在制备心肌补片上具有一定优势。
但结合临床应用的实际情况，却不难发现上述技术还存在一个治疗瓶颈：体内移植后的早期，在心肌补片未与心梗区建立有效血供联系之前，体内环境无法提供维持目的细胞片生存所需的营养物质供应，加之移植的心肌补片产品直接面对受损心肌所诱发的包含缺血、炎症和各种促凋亡因子在内的恶劣应激微环境，移植后的心肌补片存活率较低。因此，本领域的相关产品都存在一个不易克服的共同缺陷：体内移植后存活率较低，使得移植的心肌补片无法发挥最大治疗效果。
综上所述，满足临床应用要求的心肌补片产品不但需要具有拟生理的生物力学强度和良好的体外生物学活性；还需保证移植的心肌补片在体内应激条件下具备足够的生存能力。如何保障制备的心肌补片产品能够维持较高的体内存活率是目前制约该类产品发展的关键问题。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种以脱细胞生物膜为载体的心肌补片的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的以脱细胞生物膜为载体的心肌补片。
本发明的再一目的在于提供所述以脱细胞生物膜为载体的心肌补片的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种以脱细胞生物膜为载体的心肌补片的制备方法，包含如下步骤：
(1)对天然生物膜进行脱细胞处理；
(2)在脱细胞生物膜上交联营养物质，目的是为了营养物质具有缓释作用；
(3)在交联有营养物质的脱细胞生物膜上种植目的细胞；
(4)对步骤(3)初步构建的细胞片进行培养后，得到以脱细胞生物膜为载体的心肌补片。
步骤(1)中所述的天然生物膜为异种、同种异体或自体的天然生物膜；可为心包膜、腹膜、羊膜、肠系膜和小肠粘膜等生物膜；
步骤(1)中所述的脱细胞处理优选包括如下步骤：利用制备脱细胞基质的方法中的至少一种对生物膜载体进行脱细胞处理；
所述的制备脱细胞基质的方法包含如下方法：通过物理方式破坏细胞得到脱细胞基质的物理法；通过化学试剂裂解细胞得到脱细胞基质的化学法；通过酶破坏细胞得到脱细胞基质的酶法；
所述的物理方式包括冷冻、高压、超声波和渗透压改变等；
所述的化学试剂包括酸、碱和表面活性剂等；
所述的酶包括蛋白酶、核酸酶和磷脂酶等；蛋白酶能水解细胞蛋白质成分，核酸酶能水解核酸，磷脂酶能破坏细胞结构；
所述的脱细胞处理更优选包括如下步骤：对天然生物膜进行预处理，使其处于无菌状态；接着利用制备脱细胞基质的方法中的至少一种对生物膜载体进行脱细胞处理；
所述的预处理包括如下的步骤A，或步骤A和步骤B，或步骤A～C：
A、用含抗生素的生理缓冲液对天然生物膜进行清洗、消毒、分离，有利于保持无菌状态；
B、用低渗或等渗溶液浸泡用抗生素处理过的天然生物膜，有利于让下一步骤的脱细胞液更好地作用于天然生物膜，提高脱细胞效率；
C、震荡和调节洗涤温度，超声波处理，作用同步骤B；
步骤(2)中所述的交联的方法优选为物理交联法和化学交联法中的一种或两种；
步骤(2)中所述的营养物质包含生长因子、微量元素、诱导分化剂、糖类和蛋白质中的至少一种；
所述在脱细胞生物膜上交联营养物质包括直接将营养物质交联到脱细胞生物膜上或将营养物质包裹为微球，再交联到脱细胞生物膜上；
所述直接将营养物质交联到脱细胞生物膜上是指利用交联剂将营养物质交联到脱细胞生物膜上；
所述将营养物质包裹为微球指的是利用可降解材料制备微球包裹营养物质并交联在脱细胞生物膜上；
所述的微球的制备方法主要有溶剂挥发法、乳化交联法等；
所述的可降解材料主要是指天然生物大分子或高分子材料；天然生物大分子包括胶原等；高分子材料包括天然的高分子材料和人工合成的高分子材料；天然高分子材料可为明胶、天然多糖水凝胶等；人工合成高分子材料主要指聚乳酸、聚羟基乙酸和乳酸-羟基乙酸共聚物；从中任选一种或结合两种以上可降解材料使用；
为了使得目的细胞能顺利地接种于交联有营养物质的脱细胞生物膜上，交联有营养物质的脱细胞生物膜在制备过程中严格保持无菌，优选的除菌处理包括如下的步骤①～③中的至少一步：
①对天然生物膜进行脱细胞处理前，用含抗生素的溶液对天然生物膜进行处理；
②对天然生物膜进行脱细胞处理后、且在用交联剂处理脱细胞生物膜前，用含抗生素的溶液对脱细胞生物膜进行处理；
③用交联剂处理脱细胞生物膜后、且在交联营养物质前，用钴60进行处理；
步骤(3)中所述的种植的步骤如下：将目的细胞和凝胶混匀后得到的液态混悬液置于脱细胞生物膜上，并将混悬液凝固；
所述的凝胶包含有纤维蛋白胶、细胞外基质胶、胶原凝胶、纳米多肽凝胶和天然生物凝胶中的至少一种；
步骤(3)中所述的目的细胞是指经过体外培养扩增或是从组织块中新鲜分离的体细胞，可为骨髓间充质干细胞、诱导性多潜能干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、心肌祖细胞、成肌细胞、骨骼肌细胞、心肌成纤维细胞和血管内皮细胞中的至少一种；
步骤(4)中所述的培养是指利用目的细胞的培养液进行培养，培养的方式包括静态培养、气液相界面培养和连续灌注培养中的一种或至少两种；
一种以脱细胞生物膜为载体的心肌补片，通过上述方法制备得到；
所述的以脱细胞生物膜为载体的心肌补片在制备医疗器械中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.有良好的生物相容性：载体脱细胞后，得到的天然脱细胞基质具备了天然基质微环境，为细胞提供了在生长支持微环境，不仅移植入机体不造成免疫排斥反应，而且由于心肌补片类似替代梗死区外膜，其天然基质成分能较好的与梗死区缝合部位融合。
2.为心肌补片提供足够的力学强度：由于受损心肌梗死区外膜薄弱，甚至降解消失，且移植的部位是心脏表面，移植后将接受不断地摩擦，因此，对细胞片的整体强度要求非常高。脱细胞后的天然脱细胞基质具有良好的三维构型，可为细胞片提供足够的力学支持。
3.为细胞提供各种营养物质：提供营养物质不仅是指在体外构建的细胞片时，细胞片能得到载体的支持，更重要的是在心肌补片移植入梗死区后，本发明制备的心肌补片能够为细胞提供足够、稳定的的营养支持。在未建立起新的血管结构和供血***时，面对梗死区受损心肌诱发的包含缺血、炎症和各种促凋亡因子在内的恶劣微环境，本发明制备的心肌补片上交联着具有缓释效果的营养物质，在移植进梗死区后，在体内微环境的影响下缓慢释放营养物质，使细胞能够得到持续、稳定的营养物质供应，利于细胞在恶劣体内环境中长期生长、增殖或被诱导分化。
4.便于手术操作：因所用载体来自天然膜性组织，解剖学结构与心脏外膜类似，因此在移植手术过程中，取材及缝合过程都能相对简便可行。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中，EDC中文名为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，MES的中文名称为2-(N-***啉)乙磺酸，NHS的中文名称为N-羟基琥珀酰亚胺，Span-20的中文名称为单十二酸脱水山梨醇酯，HEPES缓冲液中文名为羟乙基哌嗪乙硫磺酸。
实施例1制备以脱细胞羊膜为载体的骨髓间充质干细胞心肌补片
一、以下处理过程均为无菌操作，所用的试剂均通过除菌处理。
I、制备本实施例的以脱细胞羊膜为载体的骨髓间充质干细胞心肌补片
(1)对天然生物膜进行脱细胞处理
在室温，常规无菌操作下，将新鲜羊膜(25cm2)用无菌生理盐水反复擦洗，清除血块和浆液至干净，置于无菌方盘中，使用含抗生素(100U/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH＝9.0～9.6)浸泡5次，每次10分钟。将羊膜置入无菌纯水中，在37℃水浴中浸泡60分钟。浸泡后将其置入10ml无菌磷脂酶溶液(使用0.05mol/L碳酸盐缓冲液配制，pH＝8～9；磷脂酶A1＝200U/ml，磷脂酶A2＝250U/ml)中，在37℃水浴中震荡处理(转速＝185rpm)6小时。后置入50ml含抗生素(100U/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH＝9.0～9.6)中，在25℃水浴中震荡(转速＝185rpm)冲洗6次，每次60分钟，得到脱细胞羊膜。
(2)在脱细胞生物膜上交联具有缓释效果的营养物质
在室温下，常规无菌操作下，用直径12mm的环钻钻取12mm直径脱细胞羊膜材料，将其浸入到2mL含10mg/mL肝素、3mmol/LEDC和5mmol/L NHS的MES缓冲液(0.1mol/L、pH＝6.0)中，在摇床上(转速＝40rpm)反应24～72小时后，得到肝素化的脱细胞羊膜。依次用磷酸氢二钠溶液(0.1mol/L)清洗6次，每次30分钟；氯化钠溶液(4mol/L)清洗6次，每次30分钟；蒸馏水轻柔清洗6次，每次30分钟。清洗后的肝素化脱细胞羊膜密封于无菌塑料袋中，用钴60(15kGy)照射灭菌后，4℃下保存备用。在4℃无菌条件下，使用4mL含2μg/mL转化生长因子-α(TGF-α)和2μg/mL碱性成纤维生长因子(bFGF)的氯化钠溶液(质量分数＝0.9％)浸泡灭菌后的肝素化脱细胞羊膜过夜，将溶液吸出后，结合有生长因子的脱细胞羊膜放于超净台中自然风干，4℃下保存备用。
(3)在交联有营养物质的脱细胞生物膜上种植目的细胞；
准备目的细胞：骨髓间充质细胞取材于三周龄雄性SD大鼠股骨，常规原代培养并传代至P3代，向(9～10)×106骨髓间充质干细胞中加入20μL 20％(w/w)蔗糖溶液混悬后，再加入20μL纳米多肽凝胶(acetyl-(Arg-Ala-Asp-Ala)4-amide.4HCL，BD Biocaot PuraMatrix肽段水凝胶)溶液，充分混合均匀后滴加于交联有生长因子的脱细胞羊膜表面，加入骨髓间充质干细胞培养液，静置5分钟，液态混悬液凝固成固态凝胶。
(4)培养获取以脱细胞生物膜为载体的心肌补片
将初步构建的心肌补片转移至连续灌注培养***培养24小时(培养液：骨髓间充质干细胞培养液(DMEM基础培养液，10％(v/v)胎牛血清+1％(w/v)谷氨酰胺+100U/ml青霉素G+100μg/ml硫酸链霉素)；培养参数：使用梯度增加的流体剪切力，对样品的上、下界面同时进行灌注培养；流体剪切力：6小时2N，12小时4N；培养液氧分压：80mm Hg；灌注泵：Ismatec pump；Ismatec,Glattbruch-Zurich,Switzerland；灌注培养室和气体交换装置：Minucells,Regensburg,Germany)，然后再转移至动态气-液界面培养***培养24小时(培养液：骨髓间充质干细胞培养液(DMEM基础培养液，10％(v/v)胎牛血清+1％(w/v)谷氨酰胺+100U/ml青霉素G+100μg/ml硫酸链霉素)；培养参数：上界面：气液间隔时间为1次/分钟，氧分压为155mm Hg；下界面：流体压力为10mmHg，氧分压为80mm Hg)使得骨髓间充质干细胞心肌补片达到可移植强度，得到以脱细胞羊膜为载体的骨髓间充质干细胞心肌补片。
II、制备对照组：
(1)天然羊膜心肌补片：按步骤I(1)取新鲜羊膜清洗干净、用抗生素处理并在无菌纯水中浸泡洗净后，用环钻钻取12mm直径羊膜材料钴60(15kGy)照射灭菌。接着按步骤I(3)和(4)在灭菌后的天然羊膜上种植骨髓间充质干细胞并培养，得到天然羊膜载体心肌补片。
(2)无载体骨髓间充质干细胞心肌补片：按文献“Narita T et al.The Use of Scaffold-freeCell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure.MolTher 21:860-867(2013).Rat”制备，为将步骤I(3)制备的骨髓间充质干细胞种植于表面交联有温敏聚合物-聚N-异丙基丙烯酰胺的培养皿中，37℃下培养直至细胞间连接紧密，改变温度至25℃，得到无载体骨髓间充质干细胞心肌补片(简称为无载体细胞片)。
二、检测方法
(1)结构：按文献“Q Lu et al.Delivery of basic fibroblast growth factors from heparinizeddecellularized adipose tissue stimulates potent de novo adipogenesis.Journal of Controlled Release174(2014)43–50”所述方法制备本实施例制备所得心肌补片的冰冻切片，利用核荧光染料DAPI对冰冻切片进行免疫荧光染色确定心肌补片的结构。
(2)缓释能力：
①体外检测：按文献“Q Lu et al.Delivery of basic fibroblast growth factors from heparinizeddecellularized adipose tissue stimulates potent de novo adipogenesis.Journal of Controlled Release174(2014)43–50”所述方法，即通过对交联有TGF-α和bFGF的脱细胞羊膜心肌补片进行骨髓间充质干细胞培养液孵育，ELISA检测转化因子-α(TGF-α)和碱性成纤维生长因子(bFGF)缓释能力。
②体内检测：按文献“Narita T et al.The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique toRefine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure.Mol Ther 21:860-867(2013).Rat”方法，将本实施例制备的心肌补片移植入SD大鼠心梗模型中，心肌补片贴附于心肌梗死区表面，术后常规处理。分别于术后一周和四周取出心肌补片，按文献“Q Lu et al.Deliveryof basic fibroblast growth factors from heparinized decellularized adipose tissue stimulates potentde novo adipogenesis.Journal of Controlled Release 174(2014)43–50”所述方法，即通过对心肌补片进行骨髓间充质干细胞培养液孵育，ELISA检测转化因子-α(TGF-α)和碱性成纤维生长因子(bFGF)的量，所得数值为心肌补片上剩余生长因子的量，用心肌补片交联生长因子总量减去剩余量，即可得到生长因子释放量。
(3)力学强度：按文献“Wilshaw SP et al.Production of an Acellular Amniotic MembraneMatrix for Use in Tissue Engineering.TISSUE ENGINEERING:10.1089/ten.2006.12.2117”方法，将脱细胞羊膜置入Howden拉力测试机(London,UK)进行力学检测。
(4)移植后细胞存活率：按文献“Narita T et al.The Use of Scaffold-free Cell SheetTechnique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure.Mol Ther21:860-867(2013).Rat”所述的荧光标记活体成像技术检测术后(手术方法同检测方法(2)体内检测)一周和四周，骨髓间充质干细胞在体内存活率。
三、检测结果
(1)结构：本实施例获得的心肌补片结构紧密，形成8～9层细胞结构，细胞片强度能够用于细胞片移植。
(2)缓释能力：
①体外：TGF-α和bFGF 24小时内释放量均小于9.5％。7天，生长因子释放量：TGF-α：32.7％，bFGF：34.6％；28天，生长因子释放量：TGF-α：63.5％，bFGF：67.1％；缓释时长超过42天。
②体内：术后一周，生长因子释放量：TGF-α：40.5％，bFGF：45.1％；术后四周，生长因子释放量：TGF-α：69.6％，bFGF：72.4％。
(3)力学强度：脱细胞羊膜破坏应力：0.814MPa，与天然羊膜拉伸强度比较无统计学差异。
(4)移植后细胞存活率：术后一周，本实施例制备的心肌补片细胞的存活率为83.6％，无载体细胞片的存活率为47.2％，天然羊膜载体心肌补片的存活率为25.7％；移植术后四周，本实施例制备的心肌补片细胞的存活率为78.3％，无载体细胞片的存活率为10.2％，天然羊膜载体心肌补片的存活率为5.8％。
注：本实施例所用的磷脂酶溶液可以包含有磷脂酶A1、A2、B1、B2、C和D中的任一种或至少两种。其效果是相同的。
实施例2制备以脱细胞心包膜为载体的心脏干细胞心肌补片
一、以下处理过程均为无菌操作，所用的试剂均通过除菌处理。
I、制备本实施例的以脱细胞心包膜为载体的心脏干细胞心肌补片
(1)对天然生物膜进行脱细胞处理
在室温，常规无菌操作下，将新鲜猪心包膜(25cm2)用无菌生理盐水反复擦洗，清除血块和浆液至干净，置于无菌方盘中，使用含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH＝9.0～9.6)浸泡2次，每次5分钟。将心包膜置入无菌纯水中，在37℃水浴中浸泡30分钟。浸泡后置入10ml含0.3％(w/v)十二烷基硫酸钠的无菌PBS盐溶液(0.01mol/L、pH＝6～8)中，在37℃水浴中震荡处理(转速＝185rpm)10～12小时。后置入50ml含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH＝9.0～9.6)中，在25℃水浴中震荡(转速＝185rpm)冲洗6次，每次60分钟，得到洗净后的脱细胞猪心包膜。
(2)在脱细胞生物膜上交联具有缓释效果的营养物质；
用直径12mm的环钻钻取12mm直径脱细胞猪心包膜材料，将其浸泡在含EDC(24mg/mL)和NHS(60mg/mL)的PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH＝7～8)中反应20分钟，用蒸馏水轻柔清洗6次，每次30分钟。清洗后的脱细胞心包膜密封于无菌塑料袋中，用钴60(15kGy)照射灭菌后，4℃下保存备用。4℃无菌条件下，将其浸泡在4mL含3μmol/L诱导分化剂血管紧张素(AngⅡ)和2μg/mL碱性成纤维生长因子(bFGF)的PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH＝7～8)中2小时，同时在摇床上轻轻振荡(转速＝40rpm)。将溶液吸出后，结合有AngⅡ和bFGF的脱细胞心包膜放于超净台中自然风干，得到交联有Ang Ⅱ和bFGF的脱细胞猪心包膜。4℃下保存备用。
(3)在交联有营养物质的脱细胞生物膜上种植目的细胞；
准备目的细胞：取三周龄雄性SD大鼠心脏，使用组织块培养基(complete explant medium，CEM：Ham’S F-12+10％(v/v)胎牛血清+0.2mmol/mL L-谷氨酰胺+10ng/mL Humanβ-FGF)常规原代组织块培养并传代至P3代，获取得到(7～8)×106个心脏干细胞，置于离心管内，离心去除培养液，将此心脏干细胞作为目的细胞备用。向其中加入40μL Matrigel基质胶溶液(BD Biocoat Matrige)，充分混合均匀滴加于交联有AngⅡ的脱细胞猪心包膜表面，放入培养箱中静置3分钟后，置入心脏干细胞培养液(即上述的CEM培养液)中，静置5分钟，液态混悬液凝固成固态凝胶。
(4)培养获取以脱细胞生物膜为载体的心肌补片
将初步构建的心肌补片静态培养24小时(培养液：CEM培养液；培养参数：将心肌补片浸入培养液中，放入培养箱内培养)后，转移至动态气-液界面灌注培养***培养48小时(培养液：CEM培养液；培养参数：上界面：气液间隔时间为1次/分钟，氧分压为155mm Hg；下界面：流体压力为10mmHg，氧分压为80mm Hg)，使得心脏干细胞心肌补片达到可移植强度，得到以脱细胞猪心包膜为载体的心脏干细胞心肌补片。
II、制备对照组：
(1)天然猪心包膜载体心肌补片：按步骤I(1)取新鲜猪心包膜清洗干净、用抗生素处理并在无菌纯水中浸泡洗净后，，用环钻钻取12mm直径心包膜材料钴60(15kGy)照射灭菌。按步骤I(3)和(4)在灭菌后的天然猪心包膜片上种植心脏干细胞并培养，得到天然猪心包膜载体心肌补片。
(2)无载体心脏干细胞心肌补片：按文献“Alshammary S，et al.Impact of cardiac stem cellsheet transplantation on myocardial infarction.Journal of artificial organs,2013；16(3):386-8”制备，为将步骤I(3)制备的心脏干细胞种植于温敏培养皿(35mm UpCell,CellSeed,Tokyo,Japan)中，37℃下培养直至细胞间连接紧密，改变温度至25℃，得到无载体心脏干细胞心肌补片(简称为无载体细胞片)。
(3)未交联Ang Ⅱ的脱细胞猪心包膜心脏干细胞心肌补片：按步骤I(1)取新鲜猪心包膜进行脱细胞处理，制备得到脱细胞猪心包膜。接着按照步骤I(2)对脱细胞猪心包膜进行交联处理，并用钴60(15kGy)照射灭菌。灭菌后的脱细胞猪心包膜浸泡在只含有bFGF的PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH＝7～8)中，其余所有实验条件均不改变。按步骤I(3)和(4)在灭菌后的脱细胞猪心包膜片上种植心脏干细胞并培养，得到未交联Ang Ⅱ的脱细胞猪心包膜载体心肌补片。
二、检测方法
(1)结构：检测方法同实施例1。
(2)缓释能力：
①体外检测：检测方法同实施例1，区别仅在于对交联有Ang Ⅱ和bFGF的脱细胞心包膜进行CEM培养液孵育。
②体内检测：检测方法同实施例1，区别仅在于对交联有Ang Ⅱ和bFGF的脱细胞心包膜进行CEM培养液孵育。
(3)力学强度：将样品裁剪为30mm(长)×5mm(宽)大小的样品，固定后置入到机电拉伸测量仪(Instron 4411)中并浸入装有PBS溶液(0.01mol/L，pH＝7.2～7.4)的恒温槽(Unitronic 6320200)中37℃下测量
(4)移植后细胞存活率：检测方法同实施例1。
(5)分化率：术后(手术方法同检测方法(2)体内检测)四周，将心肌补片取出，使用0.25％胰酶溶液将心肌补片上细胞消化，离心收集，加入鼠抗人cTnI抗体,室温孵育1h后，再加入FITC标记的羊抗鼠IgG，通过流式细胞仪测定FITC阳性标记细胞占细胞总数百分比，确定心脏干细胞向心肌样细胞分化率。
三、检测结果
(1)结构：本实施例获得的心肌补片结构紧密，形成6～7层细胞结构，细胞片强度能够用于细胞片移植。
(2)缓释能力：
①体外：Ang Ⅱ和bFGF 24小时内释放量均小于10％。7天内，Ang Ⅱ和bFGF释放量：Ang Ⅱ：38.6％，bFGF：35.9％；28天内，Ang Ⅱ和bFGF释放量：Ang Ⅱ：68.2％，bFGF：66.4％；缓释时长超过42天。
②体内：术后一周，Ang Ⅱ和bFGF释放量：Ang Ⅱ：43.6％，bFGF：40.1％；术后四周，Ang Ⅱ和bFGF释放量：Ang Ⅱ：62.7％，bFGF：65.8％。
(3)力学强度：脱细胞猪心包膜拉伸强度：0°：12.2MPa，90°：22.8MPa，与天然猪心包膜拉伸强度比较无统计学差异。
(4)移植后细胞存活率：术后一周，本实施例制备的心肌补片细胞的存活率为76.4％，无载体细胞片的存活率为42.3％，天然猪心包膜载体心肌补片的存活率为11.4％；移植术后四周，本实施例制备的心肌补片细胞的存活率为71.5％，无载体细胞片的存活率为8.7％，天然猪心包膜载体心肌补片的存活率为4.3％。
(5)分化率：术后4周，分化率为52.3±7.5％；未交联AngⅡ的脱细胞猪心包膜心脏干细胞心肌补片的分化率为25.7±4.6％。
实施例3制备以脱细胞猪肠系膜为载体的脂肪干细胞心肌补片
一、以下处理过程均为无菌操作，所用的试剂均通过除菌处理。
I、制备本实施例的以脱细胞猪肠系膜为载体的脂肪干细胞心肌补片
(1)对天然生物膜进行脱细胞处理
在室温，常规无菌操作下，将新鲜猪肠系膜(25cm2)用无菌生理盐水反复擦洗，清除血块和浆液至干净，置于无菌方盘中，使用含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH＝9.0～9.6)浸泡5次，每次10分钟。将猪肠系膜反复冰冻融解(-80℃冷冻，37℃解冻)3次，每次1小时。置入10mL0.05％(w/v)胰蛋白酶-EDTA溶液中37℃水浴中震荡(转速＝185rpm)过夜，后用PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH＝7.4)清洗3次，每次30分钟。再次置入10mL0.05％(w/v)胰蛋白酶-EDTA溶液中37℃水浴中震荡处理(转速＝185rpm)2小时，重复相同清洗步骤。清洗后将其置入含50U/mL核糖核酸酶A的PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH＝7.4)中37℃水浴中震荡(转速＝185rpm)过夜。后置入50ml含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH＝9.0～9.6)中，在25℃水浴中震荡(转速＝185rpm)冲洗6次，每次60分钟，得到脱细胞猪肠系膜。
(2)在脱细胞生物膜上交联具有缓释效果的营养物质
在室温下，常规无菌条件下，将10mL1％(w/v)胶原(胶原蛋白I型，sigma)溶液乳化于50mL含0.3％(w/v)表面活性剂Span 20(Sigma-Aldrich)的液体石蜡溶液中，并用高速搅拌机搅拌(转速＝700rpm)5分钟。加入1mL 50％(v/v)EDC水溶液，持续搅拌(转速＝700rpm)1小时，以形成胶原微球。后加入50mL 50％(v/v)乙醇溶液搅拌(转速＝700rpm)5分钟，分离出胶原微球。3500rpm离心5分钟，弃去上清，加入PBS盐缓冲液(0.01mol/L，pH＝7.4)，混匀并离心(3500rpm，5分钟)；重复以上步骤3次，得到纯化的胶原微球。冻干呈粉末状-80℃储存备用。
用直径12mm的环钻钻取直径12mm的脱细胞猪肠系膜材料，将其浸泡在含有10mg胶原微球以及4mmol/L EDC的PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH＝7.4)中，摇床上震荡(转速＝40rpm)处理24小时后，将交联有微球的脱细胞猪肠系膜密封于无菌塑料袋中，用钴60(15kGy)灭菌处理。
在无菌条件下，将灭菌后的脱细胞猪肠系膜浸泡在4mL含0.7mol/L葡萄糖及5mmol/L维生素C的PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH＝7～8)中，4℃下过夜。将溶液吸出后，结合有葡萄糖和维生素C的脱细胞猪肠系膜放于超净台中自然风干，4℃下保存备用。
(3)在交联有营养物质的脱细胞生物膜上种植目的细胞
准备目的细胞：取8-10周龄雄性SD大鼠腹股沟脂肪，Ⅰ型胶原酶消化分离，使用SD大鼠脂肪干细胞培养液(a-MEM基础培养液+10％(v/v)胎牛血清+100U/ml青霉素G+100μg/ml硫酸链霉素)常规原代培养并传代至P3代，获取的(7～8)×106个脂肪干细胞，置于离心管内，离心去除培养液，将此脂肪干细胞作为目的细胞备用。向其中加入30μL纤维蛋白溶液(75mg/mL，用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基配制并预温至37℃；F8630Fibrinogen，Sigma)和15μl凝血酶(100U/mL，用40mmol/L氯化钙超纯水溶液配制；Thrombin凝血酶，Sigma)，充分混合均匀迅速滴加于交联有营养物质的脱细胞猪肠系膜表面。放于培养箱内静置2分钟，加入脂肪干细胞培养液，液态混悬液凝固成固态凝胶。
(4)培养获取以脱细胞生物膜为载体的心肌补片
将初步构建的心肌补片静态培养24小时(培养液：脂肪干细胞培养液；培养参数：将心肌补片浸入培养液中，放入培养箱内培养)后，转移至连续灌注培养***培养48小时(培养液：脂肪干细胞培养液，培养参数：使用梯度增加的流体剪切力，对样品的上、下界面同时进行灌注培养。流体剪切力：12小时2N，24小时4N；培养液氧分压：80mm Hg；灌注泵：Ismatecpump；Ismatec,Glattbruch-Zurich,Switzerland；灌注培养室和气体交换装置：Minucells,Regensburg,Germany)，使得脂肪干细胞心肌补片达到可移植强度，得到以脱细胞猪肠系膜为载体的脂肪干细胞心肌补片。
II、制备对照组：
(1)天然猪肠系膜载体心肌补片：按步骤I(1)取新鲜猪肠系膜清洗干净、用抗生素处理并在无菌纯水中浸泡洗净后，用环钻钻取12mm直径猪肠系膜材料钴60(15kGy)照射灭菌。接着按步骤I(3)和(4)在灭菌后的天然猪肠系膜上种植脂肪干细胞并培养，得到天然猪肠系膜载体心肌补片。
(2)无载体脂肪干细胞心肌补片：按文献“Wang YH，et al.Characterization and evaluationof the differentiation ability of human adipose-derived stem cells growing in scaffold-freesuspension culture.Cytotherapy,2014；16(4):485-95”制备，为将步骤I(3)制备的脂肪干细胞种植于ULASPs(No.3471；Corning,Corning,NY,USA)中，利用此培养皿的超低吸附作用，悬浮培养得到无载体脂肪干细胞心肌补片(简称为无载体细胞片)。
二、检测方法
(1)结构：检测方法同实施例1。
(2)缓释能力：
①体外检测：检测方法同实施例1，区别仅在于对交联有葡萄糖和维生素C的脱细胞猪肠系膜浸没于PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH＝7.4)，37℃下孵育。
②体内检测：检测方法同实施例1，区别仅在于对交联有葡萄糖和维生素C的脱细胞猪肠系膜浸没于PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH＝7.4)，37℃下孵育。
(3)力学强度：检测方法同实施例2。
(4)移植后细胞存活率：检测方法同实施例1。
三、检测结果
(1)结构：本实施例获得的心肌补片结构紧密，形成6～7层细胞结构，细胞片强度能够用于细胞片移植。
(2)缓释能力：
①体外：葡萄糖和维生素C 24小时内释放量均小于5.7％。7天内，葡萄糖和维生素C释放量：葡萄糖：21.6％，维生素C：23.8％；28天内，葡萄糖和维生素C释放量：葡萄糖：53.2％，维生素C：55.5％；缓释时长超过49天。
②体内：术后一周，葡萄糖和维生素C释放量：葡萄糖：25.7％，维生素C：28.8％；术后四周，葡萄糖和维生素C释放量：葡萄糖：57.0％，维生素C：59.5％。
(3)力学强度：脱细胞猪肠系膜拉伸强度：0°：0.8MPa，90°：1.5MPa，与天然脱细胞猪肠系膜拉伸强度比较无统计学差异。
(4)移植后细胞存活率：术后一周，本实施例制备的心肌补片细胞的存活率为89.7％，无载体细胞片的存活率为43.5％，天然猪肠系膜载体心肌补片的存活率为8.5％；移植术后四周，本实施例制备的心肌补片细胞的存活率为80.4％，无载体细胞片的存活率为8.5％，天然猪肠系膜载体心肌补片的存活率为1.1％。
实施例4制备以脱细胞腹膜为载体的血管内皮细胞心肌补片
一、以下处理过程均为无菌操作，所用的试剂均通过除菌处理。
I、制备本实施例的以脱细胞腹膜为载体的血管内皮细胞心肌补片
(1)对天然生物膜进行脱细胞处理
在室温，常规无菌操作下，将新鲜猪腹膜(25cm2)用无菌生理盐水反复擦洗，清除血块和浆液至干净，置于无菌方盘中，使用含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH＝9.0～9.6)浸泡5次，每次10分钟。将猪腹膜置入无菌纯水中，在37℃水浴中浸泡60分钟。浸泡后将其置入10ml无菌磷脂酶溶液(使用0.05mol/L碳酸盐缓冲液配制，pH＝8～9；磷脂酶A1＝250U/ml，磷脂酶A2＝200U/ml)中，在37℃水浴中震荡处理(转速＝185rpm)6小时。后置入50ml含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH＝9.0～9.6)中，在25℃水浴中震荡(转速＝185rpm)冲洗6次，每次60分钟，得到脱细胞猪腹膜。
(2)在脱细胞生物膜上交联具有缓释效果的营养物质
同实施例3步骤I(2)，得到纯化的胶原微球。冻干呈粉末状-80℃储存备用。
用直径12mm的环钻钻取直径12mm的脱细胞猪腹膜材料，将其浸泡在含有10mg胶原微球以及4mmol/L EDC的PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH＝7.4)中，摇床上震荡(转速＝40rpm)处理24小时后，将交联有微球的脱细胞猪腹膜密封于无菌塑料袋中，用钴60(15kGy)灭菌处理。
在无菌条件下，将灭菌后的脱细胞猪腹膜浸泡在4mL含2μg/mL血管内皮细胞生长因子(VEGF)和300U/mL***(EPO)的PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH＝7～8)中，4℃下孵育24小时。将溶液吸出后，结合有VEGF和EPO的脱细胞猪腹膜放于超净台中自然风干，保存于4℃下备用。
(3)在交联有营养物质的脱细胞生物膜上种植目的细胞；
准备目的细胞：取8-10周龄雄性SD大鼠胸主动脉血管，使用血管内皮细胞培养液(DMEM完全培养液(含10％FBS，1000μg/ml肝素钠)+谷氨酰胺+100U/ml青霉素G+100μg/ml硫酸链霉素)常规原代组织块培养并传代至P3代，获取的(8～9)×106个血管内皮细胞，置于离心管内，离心去除培养液，将此血管内皮细胞作为目的细胞备用。向其中加入20μL胶原凝胶溶液(取700μl 0.3％(w/v)胶原(胶原蛋白I型，sigma)溶液，用100μl的HEPES缓冲液(0.01mol/L，pH＝7.2～7.4)中和后，加入280μL 1.5％的藻朊酸盐溶液(用0.15mol/L的氯化钠溶液配制)混合均匀制备得到胶原凝胶溶液)，充分混合均匀滴加于交联有VEGF和EPO的脱细胞猪腹膜表面，再在表面均匀加入20μL Matrigel基质胶溶液(BD Biocoat Matrige)，放入培养箱中静置3分钟，加入血管内皮细胞培养液，液态混悬液凝固成固态凝胶。
(4)培养获取以脱细胞生物膜为载体的心肌补片
将初步构建的心肌补片转移至连续灌注培养***培养24小时(培养液：血管内皮细胞培养液，培养参数：使用梯度增加的流体剪切力，对样品的上、下界面同时进行灌注培养。流体剪切力：6小时2N，12小时4N；培养液氧分压：80mm Hg；灌注泵：Ismatec pump；Ismatec,Glattbruch-Zurich,Switzerland；灌注培养室和气体交换装置：Minucells,Regensburg,Germany)，然后再转移至动态气-液界面培养***培养24小时(培养液：血管内细胞培养液，培养参数：上界面：气液间隔时间为1次/分钟，氧分压为155mm Hg；下界面：流体压力为10mmHg，氧分压为80mm Hg)使得血管内皮细胞心肌补片达到可移植强度，得到以脱细胞猪腹膜为载体的血管内皮细胞心肌补片。
II、制备对照组：
(1)天然猪腹膜载体心肌补片：按步骤I(1)取新鲜猪腹膜清洗干净、用抗生素处理并在无菌纯水中浸泡洗净后，用环钻钻取12mm直径猪腹膜材料钴60(15kGy)照射灭菌。接着按步骤I(3)和(4)在步骤II(1)得到的猪腹膜片上种植血管内皮细胞并培养，得到天然猪腹膜载体心肌补片。
(2)无载体血管内皮细胞心肌补片：将血管内皮细胞接种于ULASPs(No.3471；Corning,Corning,NY,USA)中悬浮培养，直至细胞间连接紧密，得到无载体血管内皮细胞心肌补片(简称为无载体细胞片)。
二、检测方法
(1)结构：检测方法同实施例1。
(2)缓释能力：
①体外检测：检测方法同实施例1，区别仅在于对交联有VEGF和EPO的脱细胞猪腹膜浸没于PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH＝7.4)，37℃下孵育。
②体内检测：检测方法同实施例1，区别仅在于对交联有VEGF和EPO的脱细胞猪腹膜浸没于PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH＝7.4)，37℃下孵育。
(3)力学强度：检测方法同实施例2。
(4)移植后细胞存活率：检测方法同实施例1。
三、检测结果
(1)结构：本实施例获得的心肌补片结构紧密，形成7～8层细胞结构，细胞片强度能够用于细胞片移植。
(2)缓释能力：
①体外：VEGF和EPO24小时内释放量均小于5.6％。7天内，VEGF和EPO释放量：VEGF：21.2％，EPO：23.1％；28天内，VEGF和EPO释放量：VEGF：51.4％，EPO：53.7％；缓释时长超过49天。
②体内：术后一周，VEGF和EPO释放量：VEGF：26.8％，EPO：25.2％；术后四周，VEGF和EPO释放量：VEGF：59.8％，EPO：57.1％。
(3)力学强度：0°：0.4MPa，90°：1.1MPa，与天然猪腹膜拉伸强度比较无统计学差异。
(4)移植后细胞存活率：术后一周，本实施例制备的心肌补片细胞的存活率为91.3％，无载体细胞片的存活率为50.4％，天然猪腹膜载体心肌补片的存活率为7.8％；移植术后四周，本实施例制备的心肌补片细胞的存活率为86.8％，无载体细胞片的存活率为13.7％，天然猪腹膜载体心肌补片的存活率为1.4％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种以脱细胞生物膜为载体的心肌补片的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)对天然生物膜进行脱细胞处理；
(2)在脱细胞生物膜上交联营养物质；
(3)在交联有营养物质的脱细胞生物膜上种植目的细胞；
(4)对步骤(3)初步构建的细胞片进行培养后，得到以脱细胞生物膜为载体的心肌补片。
2.根据权利要求1所述以脱细胞生物膜为载体的心肌补片的制备方法，其特征在于：所述的天然生物膜为心包膜、腹膜、羊膜、肠系膜和小肠粘膜中的至少一种。
3.根据权利要求1所述以脱细胞生物膜为载体的心肌补片的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的脱细胞处理包括如下步骤：利用制备脱细胞基质的方法中的至少一种对生物膜载体进行脱细胞处理；
所述的制备脱细胞基质的方法包含如下方法：通过物理方式破坏细胞得到脱细胞基质的物理法；通过化学试剂裂解细胞得到脱细胞基质的化学法；通过酶破坏细胞得到脱细胞基质的酶法。
4.根据权利要求3所述以脱细胞生物膜为载体的心肌补片的制备方法，其特征在于：
所述的物理方式为冷冻、高压、超声波和渗透压改变中的至少一种；
所述的化学试剂为酸、碱和表面活性剂中的至少一种；
所述的酶为蛋白酶、核酸酶和磷脂酶中的至少一种。
5.根据权利要求1所述以脱细胞生物膜为载体的心肌补片的制备方法，其特征在于：所述的脱细胞处理包括如下步骤：对天然生物膜进行预处理，使其处于无菌状态；接着利用制备脱细胞基质的方法中的至少一种对生物膜载体进行脱细胞处理；
所述的预处理包括如下的步骤A，或步骤A和步骤B，或步骤A～C：
A、用含抗生素的生理缓冲液对天然生物膜进行清洗、消毒、分离；
B、用低渗或等渗溶液浸泡用抗生素处理过的天然生物膜；
C、震荡和调节洗涤温度，超声波处理。
6.根据权利要求1所述以脱细胞生物膜为载体的心肌补片的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的交联的方法为物理交联法和化学交联法中的一种或两种；
步骤(2)中所述的营养物质为生长因子、微量元素、诱导分化剂、糖类和蛋白质中的至少一种；
所述在脱细胞生物膜上交联营养物质包括直接将营养物质交联到脱细胞生物膜上或将营养物质包裹为微球，再交联到脱细胞生物膜上。
7.根据权利要求1所述以脱细胞生物膜为载体的心肌补片的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的种植的步骤如下：将目的细胞和凝胶混匀后得到的液态混悬液置于脱细胞生物膜上，并将混悬液凝固；
所述的凝胶为纤维蛋白胶、细胞外基质胶、胶原凝胶、纳米多肽凝胶和天然生物凝胶中的至少一种；
步骤(3)中所述的目的细胞是指经过体外培养扩增或是从组织块中新鲜分离的体细胞，为骨髓间充质干细胞、诱导性多潜能干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、心肌祖细胞、成肌细胞、骨骼肌细胞、心肌成纤维细胞和血管内皮细胞中的至少一种。
8.根据权利要求1所述以脱细胞生物膜为载体的心肌补片的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的培养是指利用目的细胞的培养液进行培养，培养的方式为静态培养、气液相界面培养和连续灌注培养中的一种或至少两种。
9.一种以脱细胞生物膜为载体的心肌补片，通过权利要求1～8任一项所述的制备方法得到。
10.权利要求9所述的以脱细胞生物膜为载体的心肌补片在制备医疗器械中的应用。
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Inventor after: Wu Zheng Inventor after: Qin Junwen Inventor after: Qi Xufeng Inventor after: Yu Yanhong Inventor after: Lin Xi Inventor after: Zhang Jianhua Inventor after: Zhou Qing Inventor after: Cai Dongqing Inventor after: Qin Zixi Inventor after: Wang Yingwei Inventor after: Zhang Zhongxia Inventor after: Fan Zepei Inventor before: Wu Zheng Inventor before: Yu Yanhong Inventor before: Lin Xi Inventor before: Zhang Jianhua Inventor before: Cai Dongqing Inventor before: Qin Zixi Inventor before: Wang Yingwei Inventor before: Zhang Zhongxia Inventor before: Qin Junwen Inventor before: Qi Xufeng |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: WU ZHENG LIN XI ZHANG JIANHUA CAI DONGQING QIN ZIXI WANG YINGWEI ZHANG ZHONGXIA QIN JUNWEN QI XUFENG YU YANHONG TO: WU ZHENG LIN XI ZHANG JIANHUA ZHOU QING CAI DONGQING QIN ZIXI WANG YINGWEI ZHANG ZHONGXIA FAN ZEPEI QIN JUNWEN QI XUFENG YU YANHONG |
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