CN104428672B - 测定和/或监测三维细胞培养物***的条件的方法和进行所述方法的光学传感器设备 - Google Patents

测定和/或监测三维细胞培养物***的条件的方法和进行所述方法的光学传感器设备 Download PDF

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Abstract

本发明涉及测定和/或监测包括至少一个生长区域的三维细胞培养物***的至少一个条件的方法，其中所述至少一个条件选自生理学条件、活力和代谢状态。本发明进一步涉及配置来进行所述方法的光学传感器设备。

Description

测定和/或监测三维细胞培养物***的条件的方法和进行所 述方法的光学传感器设备
本发明涉及测定和/或监测包括至少一个生长区域的三维细胞培养物***的至少一个条件的方法，其中至少一个条件选自生理学条件、活力和代谢状态。本发明进一步涉及配置为进行所述方法的光学传感器设备。
背景技术
迄今，三维细胞培养物仍不常见。它们需要连续的供给，并且因此，仅仅在动态的，例如连续注入的生物反应器中建立。已经付出努力开发测定和/或监测现有三维细胞培养物例如芯片上器官(OC)设备、芯片上多器官(MOC)设备或循环***中的物理条件、活力和代谢状态的方法。现有三维细胞培养物的尺寸仅仅支持存在少量的流体，例如少量流体通过所述***的循环。这导致难以测定或监测所述***的物理条件。
另外，在三维细胞培养物中，测定或监测活力或代谢状态相比观察仅仅包括单层细胞的细胞培养物是复杂的，尤其用普通的光学装置，例如荧光阅读器。
而且，例如监测所述培养物中代谢状态的已知光学传感器不能非接触和非侵入式工作。例如，所述传感器必须引入或并入三维培养物，从而不能避免直接干扰三维细胞培养物***的环境。这可导致污染或破坏所述培养物中敏感的或无菌的气氛，这不是期望的。
因此，需要新的方法，其允许测定或监测三维细胞培养物的物理条件、活力和代谢状态和可用于这些方法的新的光学传感器。
本发明的发明人已经开发了新的方法，其允许基于红细胞作为探测剂测定三维细胞培养物的物理条件。红细胞作为探测剂用途的优势在于，机械测量不是必需的。这意味着不必向三维细胞培养物引入可能污染或破坏其中敏感的和/或无菌的气氛的外来物质。
此外，本发明的发明人已经开发了允许测定所述培养物中活力和代谢状态的方法。
此外，本发明的发明人已经开发了配置为允许非接触和非侵入进行测定和/或监测三维细胞培养物的物理条件、活力和代谢状态的方法的光学传感器。因此，所述光学传感器的使用避免了直接干扰所述培养物的无菌的和/或敏感的环境。所述光学传感器进一步配置为允许在三维细胞培养物中和不仅仅在单层细胞中进行上述方法。
发明内容
在第一方面中，本发明涉及一种方法，其用于测定和/或监测包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)的或包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)中的至少一个条件，其中至少一个条件选自
(i)生理学条件，
(ii)活力，和
(iii)代谢状态，
其中使用红细胞作为所述条件的探测剂测定生理学条件，通过测量活细胞荧光染料测定和/或监测活力，以及通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比，测定和/或监测代谢状态。
在第二方面中，本发明涉及光学传感器设备(1)，其配置为进行根据第一方面测定和/或监测包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)的至少一个条件的所述方法，其中至少一个条件选自
(i)生理学条件，
(ii)活力，和
(iii)代谢状态，
其中使用红细胞作为所述条件的探测剂测定生理学条件，通过测量活细胞荧光染料测定和/或监测活力，和通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比，测定和/或监测代谢状态。
在第三方面中，本发明涉及根据第二方面的光学传感器设备(1)用于测定和/或监测包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)中的至少一个条件中的用途，其中至少一个条件选自
(i)生理学条件，
(ii)活力，和
(iii)代谢状态，
其中使用红细胞作为所述条件的探测剂测定生理学条件，通过测量活细胞荧光染料测定和/或监测活力，和通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比，测定和/或监测代谢状态。
在第四方面中，本发明涉及根据第二方面的光学传感器设备(1)用于监测测试化合物的作用和/或测定效力、副作用、生物安全性、代谢物、作用模式或器官再生的用途。
本发明内容没有必要描述本发明的所有特征。
发明详述
在下面详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于本文所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些是可改变的。也应理解，本文使用的术语仅仅为了描述具体实施方式的目的，并且不旨在限制本发明的范围，该范围仅仅由所附的权利要求限定。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有如本领域技术人员通常理解的相同意思。
优选地，本文使用的术语的定义如在“A multilingual glossary ofbiotechnological terms：(IUPAC Recommendations)”，Leuenberger，H.G.W，Nagel,B.和Klbl,H.eds.(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland中描述，以及如在Axel Kleemann和Jurgen Engel的“Pharmaceutical Substances：Syntheses，Patents，Applications”，Thieme Medical Publishing，1999；“Merck Index：AnEncyclopedia of Chemicals，Drugs,and Biologicals”，Susan Budavari等编辑，CRC出版社，1996年，和美国药典-25/National Formulary-20，美国药典协会公司出版，RockvilleMd.，2001中描述。
遍及本说明书和所附的权利要求，除非上下文另外需要，词语“包括(comprise)”和变型比如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将理解为暗示包括陈述的特征、整数或步骤或特征、整数或步骤的组，但不排除任何其他特征、整数或步骤或整数或步骤的组。在下述段落中，更详细限定本发明的不同方面。如此限定的每个方面可与任何其他一个方面或多个方面组合，除非清楚地相反指出。尤其，指示为优选的或有利的任何特征可与指示为优选的或有利的任何其他一种特征或多种特征组合。
术语“大约”，当结合数值使用时，意思是包括在下限比指示的数值小5％和上限比指示的数值大5％的范围中的数值。
遍及本说明的文本，引用了数篇文件。本文引用的每篇文件(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指导等)，无论上文或下文，通过引用以它们的整体并入。本文绝不解释为认可本发明由于之前发明而无权占先于这些公开内容。
下面，提供在本说明书中频繁使用的术语的一些定义。这些术语在说明书的剩余部分中其使用的每种情况下将具有各自定义的意思和优选的意思：
术语“细胞”，如本文所使用，意思是脊椎动物或无脊椎动物的细胞系或原代细胞。
术语“类器官(organoids)”，如本文所使用，意思是体外人工从头产生的不同类型细胞的功能细胞聚集，其显示至少一种器官或组织功能，优选地显示大部分或基本上所有的器官或组织功能。
术语“器官”，如本文所使用，意思是体外人工从头产生的不同类型细胞的功能细胞聚集，其显示天然器官的所有功能。
术语“组织”，如本文所使用，表示取自患者或动物的活组织检查材料或外植体，或体外产生的组织。
术语“细胞生长”，如本文所使用，指细胞群体的生长，其中一个细胞(“母细胞”)生长并且***以产生两个“子细胞”(M期)并且指细胞质和细胞器体积的增加(G1期)，以及复制之前遗传物质的增加(G2期)。在细胞生长和分化期间，
术语“分化”，如本文所使用，意思是培养细胞的组织特异性功能的发展。
术语“维持”，如本文所使用，描述在给定细胞培养过程中保持给定组织所有功能不变的能力，优选地没有明显的细胞死亡和/或细胞凋亡的迹象。
术语“培养基(medium)”(复数形式：“培养基(media)”)，如本文所使用，意思是具有用于培养细胞的养分和物质的生长支持液体。适当的培养基的例子包括DMEM、Ham’s F12和RPMI。
术语“补充剂”，如本文所使用，描述添加至培养基以便诱导或修饰细胞功能的物质，其可具有确定的组分，例如纯化的或重组的细胞因子或生长因子，或不确定的组分，例如血清。
术语“基质”，如本文所使用，意思是物质或物质的混合物，其维持细胞、细胞聚集、组织、类器官和/或器官的活力、增强增殖、分化和功能。优选地，以可适于填充生长区域(3)空间的形式提供基质材料。在本发明的背景下可用的基质可采用各种形状，包括，例如水凝胶、泡沫、织物或非织造织物。基质材料可包括天然存在的基质物质，如细胞外基质蛋白，优选地胶原、层粘连蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白、小基质细胞蛋白、小整联蛋白-结合糖蛋白、生长因子或蛋白聚糖，或可包括人工基质物质，如非降解的聚合物，比如聚酰胺纤维、甲基纤维素、琼脂糖或藻酸盐凝胶，或降解聚合物，例如聚乳酸。
为了克服与现有技术相关的问题，在第一方面中，本发明提供了测定和/或监测包括或由至少一个生长区域(3)组成的三维细胞培养物***(2)的或包括或由至少一个生长区域(3)组成的三维细胞培养物***(2)中的至少一个条件、优选地两个或三个条件的(体外)方法，其中所述至少一个条件、优选地两个或三个条件选自
(i)生理学条件，
(ii)活力，和
(iii)代谢状态，
其中使用红细胞作为所述条件的探测剂测定生理学条件，通过测量活细胞荧光染料测定和/或监测活力，和通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比，测定和/或监测代谢状态。
测定和/或监测上面提到的至少一个条件，例如至少一个、两个或三个条件的上述方法优选地非接触和非侵入式进行，尤其避免了直接干扰三维细胞培养物***(2)例如无菌的独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)的环境。另外，所述方法不需要操作和/或修饰三维细胞培养物***(2)，例如无菌的独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)。非接触和非侵入式测定和/或监测至少一个条件，例如至少一个、两个或三个条件——其不需要操作和/或修饰三维细胞培养物***(2)——尤其使用光学装置、具体地使用根据本发明第二方面的光学传感器设备(1)进行。在该方面中，进一步优选的是三维细胞培养物***(2)，优选地三维细胞培养物***(2)的主体，由透明材料例如由玻璃比如碳酸钙/碳酸氢钠玻璃或石英玻璃或塑料制造。这允许非接触和非侵入式观察三维细胞培养物***(2)，尤其使用光学装置，更尤其使用根据本发明第二方面的光学传感器设备(1)。尤其，其允许从外部分析三维细胞培养物***(2)。
术语“三维细胞培养物***(2)”，如本文所使用，指被培养细胞的三维(3D)集群(assembly)。术语“细胞培养”指在控制条件下使得细胞生长、分化和/或维持细胞的复杂过程，通常在它们自然环境的外部。所述细胞的三维集群优选地由多个各自结构化的和/或微结构化的细胞层形成，所述层彼此流体密封连接并且尤其能够提供流体密封环境，并且因此，优选地提供无菌的环境。所述细胞的三维集群优选地指多层细胞集群、细胞聚集、组织、类器官或器官。培养期间，多层细胞集群或细胞聚集可例如通过细胞生长和/或分化进一步发育成类器官或器官。优选地，三维细胞培养物***(2)的尺寸设定为用于标准高通量设置，例如具有标准微量滴定板或条带的尺寸。因此，优选地宽度为2至10cm之间，优选地1、2、3、4、5、6、7、8、9或10cm，和/或长度为3和15cm之间，优选地3、4、5、6、7、8、9、10、11、1、12、13、14或15cm，和/或高度为0.2和10mm之间，更优选地1和4mm之间，即0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0mm。为了与标准微量滴定板规格一致，宽度与长度优选地比例为大约1:3。尤其优选的是2.5cm宽度、7.5cm长度和3mm高度的尺寸。
优选的材料包括SiO2、玻璃和合成聚合物。优选的合成聚合物包括聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、聚酰胺(PA)、聚酰亚胺(PI)、聚醚醚酮(PEEK)、聚苯硫醚(PPSE)、环氧树脂(EP)、不饱和聚酯(UP)、酚醛树脂(PF)、聚硅氧烷例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、蜜胺树脂(MF)、氰酸酯(CA)、聚四氟乙烯(PTFE)和其混合物。尤其优选的合成聚合物是光学透明的并且包括例如聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)和聚硅氧烷，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
以其最简单的形式，三维细胞培养物***(2)由至少一个生长区域(3)组成。这种三维细胞培养物***(2)可具有细胞培养管或细胞培养孔的形式。但是，尤其优选的是生长区域(3)是包括在三维细胞培养物***(2)中的微结构化的区域。
术语“生长区域(3)”，如本文所使用，指为细胞、细胞聚集、组织、类器官和/或器官生长、分化和/或维持提供整个微环境的区域。生长区域(3)优选地包括微入口，例如培养基和/或血液入口，和/或微出口，例如培养基和/或血液出口，其容纳形成各自细胞聚集、组织、类器官和/或器官的大部分细胞，和/或开放表面，其可以基本上流体密封和气体可渗透的或流体密封和气体可渗透的方式由适当的装置在细胞、细胞聚集、组织、类器官和/或器官装载到生长区域(3)中后覆盖，所述适当的装置包括膜如PTFE膜、纤维蛋白薄片、其上喷药的邦迪创伤贴薄片(spray-on band aid sheets)和/或凝结产品薄片(sheets ofcoagulation products)，或通过覆盖开口的柔性薄片覆盖，例如由柔性材料如聚硅氧烷例如PDMS制造的唇状物。在优选的实施方式中，这种柔性薄片覆盖整个生长区域并且具有切口，使得通过切口到达各个细胞、细胞聚集、组织、类器官和/或器官。柔性薄片的优势在于，生长区域仍可进入而不必在进入之后重新密封膜。优选地，覆盖的表面是流体密封但是气体可渗透的，并且因此，使得生长区域(3)中的细胞和环境之间O2和CO2交换。优选地，生长区域(3)具有基本上圆形或圆形形式，例如扁平圆柱的形式。生长区域(3)的直径与高度的比例优选地在2:1至6:1之间，更优选地在3:1至5:1之间。优选地，生长区域(3)具有0.1至3cm2，优选地0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0cm2的表面，尤其优选的生长区域(3)的表面积在0.3至0.7cm2之间，优选地0.56cm2。如果生长区域(3)具有圆形形状，优选地其直径在0.1和1cm之间，优选地0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0，最优选地0.6cm。三维细胞培养物***(2)优选地包括或由多于一个生长区域(3)组成。在每个生长区域(3)具有指出的优选尺寸下，可能在一个三维细胞培养物***(2)上装配大量的独立的生长区域(3)。优选地，一个三维细胞培养物***(2)包括或由2和2000之间的生长区域(3)组成，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、30、36、48、60、72、84、96、100、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240或更多个生长区域(3)。在优选的微量滴定板样规格中，2、4、6、24、96、384或甚至1536个生长区域(3)以2:3矩形矩阵排列在三维细胞培养物***(2)上。
至少一个生长区域(3)优选地填充基质，其为生长区域(3)中形成的或将通过在生长区域(3)中生长细胞例如内皮细胞形成的毛细血管提供生长支架。关于术语“基质”的定义，参考上述。因此，优选地，基质包括微通道、结构和/或网络，其允许和支持通过细胞，例如通过内皮细胞形成毛细血管。优选地，这些结构本身没有稍后毛细血管的形状，而是仅仅为形成的毛细血管提供附着点和/或引导。优选地，生长区域(3)包括或由半固体、生物可降解的和/或生物相容的基质组成。可选地，单独或嵌入如上阐释的基质提供生物相容的中空纤维。中空纤维、微通道、结构和/或网络优选地在一侧连接至微入口和在另一侧连接至微出口，从而引导细胞例如内皮细胞的生长。
生长区域(3)优选地包括称为“生长腔”的腔，其容纳大部分细胞，即至少80％，优选地85％、90％、95％、98％或更多的在生长区域(3)中包括的细胞。生长腔优选地具有适当的尺寸、形状和营养用于每个具体的细胞聚集、组织、类器官和/或器官。其优选地提供通路，以引入微构造和微环境另外必要的元件和/或用细胞悬液、细胞培养物和/或组织切片装载三维细胞培养物***(2)，这根据具体情况而定。优选地，其被涂布适当的材料和/或包含基质，以引导/吸引/维持细胞。
生长区域(3)优选地进一步包括毛细管外流体和/或废物收集器/储器。通过毛细管内压差驱动毛细管外流体的排出。这用于从细胞聚集、组织、类器官和/或器官例如分泌毛细管外流体的胰腺、肾、内脏排出流体的目的。优选地，废物收集器与上述基质和/或中空纤维以一种方式分开，所述方式防止血液细胞和/或组织或类器官细胞从生长区域(3)流出。优选地，毛细管外流体和/或废物收集器与其余的生长区域(3)通过细胞保留膜或通过细胞排除通道分开，所述细胞保留膜即平均孔径小于三维细胞培养物***(2)中生长的细胞平均尺寸的膜，所述细胞排除通道的尺寸设定为排除三维细胞培养物***(2)中生长的细胞。
优选地，三维细胞培养物***(2)包括两个或更多个生长区域(3)，优选地包括生长腔，从而每个生长区域(3)可为不同的细胞聚集、组织、类器官和/或器官提供适当的微环境，例如一个神经细胞的生长区域、一个心脏组织的生长区域、一个软骨的生长区域、一个骨的生长区域和/或一个血管化皮肤的生长区域。这样例如可能同时评估一种具体的测试化合物对数个/不同的细胞聚集、组织、类器官和/或器官的作用。可选地，三维细胞培养物***(2)可包括两个或更多个生长区域(3)，优选地包括生长腔，为相同类型的细胞聚集、组织、类器官和/或器官提供适当的微环境，例如神经细胞、心脏组织、软骨、骨或血管皮肤的生长区域。这允许例如以更高的统计显著性通过使从平行的两个、三个、四个或更多个生长区域(3)获得的结果平均测定给定测试化合物的作用。另外，一个生长区域(3)，优选地其包括生长腔，可包括可用作每个测量的标准的特定细胞类型的细胞。
生长区域(3)中的生长腔的容积通常在1×102至0.01mm3之间，优选地100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06和0.05mm3，优选地1mm3。
优选地三维细胞培养物***(2)是独立式的***。也优选地，三维细胞培养物***(2)是循环***。更优选地，三维细胞培养物***(2)是独立式和循环***。
术语“独立式”指下述事实：从三维细胞培养物***(2)提供细胞、细胞聚集、组织、类器官和/或器官在至少一个生长区域(3)中分化和维持需要的培养基、血液和补充剂。为了该目的，至少一个流体储器比如培养基和/或血液储器优选地包括在三维细胞培养物***(2)中。至少一个流体储器比如培养基和/或血液储器优选地通过三维细胞培养物***(2)中的至少一个微流体通道连接至至少一个生长区域(3)。因此，没有从外部流体储器提供流体的流体连接。因此，独立式三维细胞培养物***(2)可掌控和移动而没有污染至少一个生长区域(3)中培养基、血液并因此细胞、细胞聚集、组织、类器官和/或器官的危险。另外，优选地，以被动方式，即通过经膜或生物相容的聚合物箔从环境扩散进入培养基，为至少一个生长区域(3)提供气态培养基，例如O2/CO2。该膜或聚合物箔优选地是流体密封的。再一次，这是优选的以允许掌控三维细胞培养物***(2)。优选地，膜或箔覆盖至少部分、更优选地全部生长区域(3)，因此使得O2/CO2扩散进入流体，比如流过微流体通道和/或流过至少一个生长区域(3)的培养基或血液。在优选的实施方式中，膜在细胞、细胞聚集、组织、类器官和/或器官已经装载入生长区域(3)之后形成或附着，或其形成三维细胞培养物***(2)的整体部分。因此，在优选的实施方式中三维细胞培养物***(2)不包括至外部气态培养基供应的连接器和/或不包括用于主动使培养基通气的设备。
流体流动通过独立式三维细胞培养物***(2)的微流体***可通过重力或毛细管力实现。但是，为了确保培养基通过***的流动，优选地培养基或血液储器和/或废物储器包括亲水材料，其一旦被湿润，吸收培养基，并且因此，提供适于提供流体流动的吸引力。可选地，微泵可布置在三维细胞培养物***(2)中，例如在至少一种培养基和/或血液储器之间和在至少一个生长区域(3)之间。
优选的三维细胞培养物***(2)，优选地“独立式”三维细胞培养物***(2)，被描述在WO 2009/146911 A2第2页第22行至第3页第4行、第11页第25行至第36页第35行和第38页第24行至第39页第15行以及权利要求1至32，并且显示在WO 2009/146911 A2的图1至8中(见第4页第4行至第9页第3行的图例)。生产这种优选的“独立式”三维细胞培养物***(2)的方法进一步描述在WO 2009/146911 A2第3页第6至20行、第37页第1至38页第2行和第38页第24行至第39页第15行以及权利要求33和38至42。WO 2009/146911 A2的公开内容通过引用并入本文。
术语“循环”指下述事实：三维细胞培养物***(2)中的流体例如培养基和/或血液在所述细胞培养物***中循环。优选的循环三维细胞培养物***(2)包括至少一个生长区域(3)和至少一个方向泵送设备。在这种***中，流体例如培养基和/或血液优选地在至少一个生长区域(3)和至少一个方向泵送设备之间循环，具体地经一个或多个微流体通道。优选地，流体例如培养基和/或血液在上述“独立式”三维细胞培养物***(2)中循环。在该情况下，流体例如培养基和/或血液优选地在至少一个流体储器比如培养基和/或血液储器和至少一个生长区域(3)之间循环，具体地经一个或多个微流体通道。这种“独立式”“循环”三维细胞培养物***(2)优选地进一步包括至少一个方向泵送设备。在该情况下，“独立式”“循环”三维细胞培养物***(2)中的流体在至少一个方向泵送设备、至少一个生长区域(3)和至少一个流体储器比如培养基和/或血液储器之间循环，具体地经一个或多个微流体通道。
优选的“独立式”“循环”三维细胞培养物***(2)描述在WO 2012/016711 A1第3页第6至13行、第5页第20行至第14页第34行、第16页第19行至第19页第9行和第20页第5至23行以及权利要求1至17中并且显示在WO 2012/016711 A1的图1至5(见第20页第24行至第21页第31行的图例)。生产这种优选的“独立式”“循环”三维细胞培养物***(2)的方法进一步描述在WO 2012/016711 A1第3页第14至21行、第15页第1行至第16页第14行、第19页第10至33行、第20页第5至23行和第22页第1行至第23页第8行以及权利要求18至20中。WO 2012/016711 A1的公开内容通过引用并入本文。
在三维细胞培养物***(2)的操作期间，在两个、三个、四个、五个或更多个生长区域(3)，优选地在所述生长区域(3)包括的两个、三个、四个、五个或更多个生长腔中单独地形成或维持的两种、三种、四种、五种或更多种相同的或不同的细胞聚集、组织、类器官或器官可彼此相互作用。相互作用可发生在生长区域(3)之间，优选地在生长腔之间，通过例如神经和/或微毛细血管从一个生长区域(3)、尤其是生长腔生长至另一生长区域(3)、尤其生长腔。这种相互作用可通过在不同的生长区域(3)、尤其生长腔之间单独提供的连接通道和/或开孔发生。所述连接通道和/或开孔可根据需要打开或关闭。
尽管可能通过光学装置、尤其是用光学传感器、更尤其用根据本发明第二方面的光学传感器设备(1)，评定包括在至少一个生长区域(3)中的、具体在其中包括的至少一种生长腔中的细胞聚集、组织、类器官和/或器官的数个性质，但优选地，三维细胞培养物***(2)，例如独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)是显微镜可观察的。最后，三维细胞培养物***(2)的每个部分可由光学透明的材料制造。优选地，至少一个生长区域(3)、其中包括的至少一个生长腔、至少一个微流体通道、流体储器例如血液和/或培养基储器和/或废物储器是显微镜可观察的。
独立式三维细胞培养物***(2)中可包括的培养基或血液储器容纳对于至少一个生长区域(3)中细胞聚集、组织、类器官或器官分化和/或维持必要的培养基、血液和/或补充剂。由数个参数确定独立式三维细胞培养物***(2)中包括的培养基或血液储器的尺寸，包括：(i)需要的独立式培养时间和(ii)需要的培养基变化速度。通常，培养基或血液储器包括培养基和如果需要包括补充剂，培养基超过每一天培养的一个生长腔容积乘以培养的天数。在优选的实施方式中，独立式培养时间是至少3天、7天、14天、21天、28天、90天180天、365天、或更长。在典型的实施方式中，独立式芯片上器官设备中包括的培养基或血液储器的容积介于5μl和5000μl之间，优选地容积介于20μl和200μl之间。
血液储器包括血液，尤其是全血或血液组分，比如血浆、血清、或血液细胞(也称为造血细胞)，例如来自脊椎动物比如哺乳动物，比如人，或无脊椎动物。术语“造血细胞”指成熟的细胞类型及其不成熟的前体，其可通过形态或主要通过细胞表面标记物的独特图案识别。该术语用于将这些细胞与在身体中出现的其他细胞类型区分并且也包括T-细胞和不同的子集，其是唯一不在骨髓中产生的造血细胞。优选地，血液细胞是红细胞、白细胞和/或血小板。更优选地，血液储器包括全血或血液血浆(都包括红细胞)。血液细胞，例如红细胞，也可包括在培养基储器中包括的培养基中。血液，优选地全血的使用，确保强的缓冲液***，为组织提供所有必需的血浆蛋白质，支持通过红细胞的氧运输和通过白细胞提供抗污染微生物的免疫活性。
如上提到，独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)可包括至少一个微流体通道。优选地，所述至少一个微流体通道流体连接至少一个培养基或血液储器与至少一个生长区域(3)，流体连接至少一个方向泵送设备与至少一个生长区域(3)或彼此流体连接至少一种培养基或血液储器、至少一个生长区域(3)和至少一个方向泵送设备。微流体通道的直径优选地在100nm至1mm之间，优选地在0.5μm至200μm之间，更优选地1μm至100μm。优选地，微流体通道设置有另外的出口，其允许单独施用补充剂和/或测试化合物至生长区域(3)。
优选地，方向泵送设备是生物泵、水力泵、压电泵、蠕动泵、气动泵、电磁泵或磁力泵。生物泵例如由心肌细胞形成，该心肌细胞优选地种植在形状为在心肌细胞收缩时支撑脉动流的弹性聚合物上(Tanaka等，2006，Lab Chip，6，362-386)。心肌细胞的颤搐提供泵送动作所需的收缩。
三维细胞培养物***(2)可进一步包括注入和/或排出端口。术语“注入端口”指允许注入材料的开孔，例如物质比如养分、流体比如培养基和/或血液、测试化合物、化学品比如活性荧光染料。术语“排出端口”指允许排出材料的开孔，例如流体，比如培养基和/或血液。在优选的实施方式中，端口配置为允许注入和排出材料二者，例如以便移出/交换三维细胞培养物***(2)中包括的流体，例如培养基和/或血液。注入和/或排出端口优选地位于微流体运输通道中或连接至三维细胞培养物***(2)的至少一个生长区域(3)。例如，如果物质例如养分、流体比如培养基和/或血液、测试化合物、化学品比如活性荧光染料必须在温育过程期间补充或添加至三维细胞培养物***(2)，则优选地通过注入端口不连续地供应这些物质，所述注入端口优选地位于微流体运输通道中或连接至至少一个生长区域(3)。
优选地，“循环”三维细胞培养物***(2)的尺寸支持在5和5000μl之间、更优选地在20和200μl之间的血液或培养基通过所述***的连续循环。上述“独立式”和/或“循环”三维细胞培养物***(2)优选地允许连续养分供应和废物移除。
如上提到，在第一方面中，本发明涉及测定和/或监测包括或由至少一个生长区域(3)组成的三维细胞培养物***(2)或包括或由至少一个生长区域(3)组成的三维细胞培养物***(2)中的至少一个条件、优选地两个或三个条件的(体外)方法，其中所述至少一个条件、优选地两个或三个条件选自
(i)生理学条件，
(ii)活力，和
(iii)代谢状态，
其中使用红细胞作为所述条件的探测剂测定生理学条件，通过测量活细胞荧光染料测定和/或监测活力，和通过测量NADH(NADH＝还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)自发荧光和/或FAD(FAD＝氧化形式的黄素腺嘌呤二核苷酸)和/或通过测定NADH/NAD+(NAD+＝氧化形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和/或NADH/FAD比，测定和/或监测代谢状态。
优选地，测定和/或监测的(两个或三个)条件是(i)生理学条件和活力，(ii)生理学条件和代谢状态，(iii)活力和代谢状态，或(iv)生理学条件、活力和代谢状态，其中使用红细胞作为所述条件的探测剂测定生理学条件，通过测量活细胞荧光染料测定和/或监测活力，和通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比，测定和/或监测代谢状态。
术语“细胞活力”，如本文所使用，意思是细胞的生活力，特征在于进行某些关键的功能比如生长、增殖、一些形式的反应和适应性的能力。在本发明的方法中，三维细胞培养物***(2)的、尤其是三维细胞培养物***(2)中包括的多层细胞集群/多个多层细胞集群、细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的活力通过测量活细胞荧光染料进行测定和/或监测。
术语“细胞代谢”，如本文所使用，意思是在活细胞中发生的导致生长、产能、消除废物质和外部物质解毒的所有化学过程的总和。在本发明的方法中，三维细胞培养物***(2)的、尤其是三维细胞培养物***(2)中包括的多层细胞集群/多个多层细胞集群、细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的代谢状态通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比测定和/或监测。
术语“生理学条件”，如本文所使用，指细胞内环境的条件，例如pH、氧浓度和/或葡萄糖浓度。生理学条件优选地是三维细胞培养物***(2)中的或三维细胞培养物***(2)的流速、生理学重量摩尔渗透压浓度和/或耗氧，例如流过、在其中循环或灌注三维细胞培养物***(2)的流体比如血液和/或血浆的流速，流体比如三维细胞培养物***中包括的、具体是在三维细胞培养物***(2)的至少一个生长区域(3)包括的灌注多层细胞集群/多个多层细胞集群、细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的血液和/或血浆的生理学重量摩尔渗透压浓度，和/或三维细胞培养物***(2)的至少一个生长区域(3)中包括的多层细胞集群/多个多层细胞集群、细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的耗氧。
在本发明的方法中，三维细胞培养物***(2)中或三维细胞培养物***(2)的、尤其是三维细胞培养物***(2)的至少一个生长区域(3)中包括的多层细胞集群/多个多层细胞集群、细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的生理学条件，使用红细胞作为所述条件的探测剂测定。优选地，红细胞用作探测剂用于测定三维细胞培养物***(2)中的或三维细胞培养物***(2)的流速、生理学重量摩尔渗透压浓度和/或耗氧，例如(i)流速和生理学重量摩尔渗透压浓度，(ii)流速和耗氧，(iii)生理学重量摩尔渗透压浓度和耗氧，或(iv)流速、生理学重量摩尔渗透压浓度和耗氧。例如，红细胞可用作探测剂用于测定流过、在其中循环或灌注三维细胞培养物***(2)的流体比如血液和/或血浆的流速，流体比如三维细胞培养物***中包括的、尤其是三维细胞培养物***(2)的至少一个生长区域(3)中包括的灌注多层细胞集群/多个多层细胞集群、细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的血液和/或血浆的生理学重量摩尔渗透压浓度，和/或三维细胞培养物***(2)的至少一个生长区域(3)包括的多层细胞集群/多个多层细胞集群、细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的耗氧。
在优选的实施方式中，使用红细胞作为探测剂测定三维细胞培养物***(2)中流速的方法包括下述步骤：
(i)提供包括至少一个生长区域(3)的可灌注的三维细胞培养物***(2)，
(ii)至少在两个不同的时间点为所述细胞培养物***中的红细胞拍照，例如2、3或4个不同的时间点(并且从而获得至少两个照片，例如2、3或4个照片)，
(iii)选择至少一个红细胞，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100红细胞，和测定至少一个红细胞例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100个红细胞在至少两个照片上例如2、3或4个照片上的位置，
(iv)为所述至少一个红细胞，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100个红细胞，分派运动矢量，代表在至少两个照片例如2、3、或4照片上所述至少一个红细胞例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100个红细胞的位置变化，和
(v)基于运动矢量测定所述细胞培养物***中的流速。
测定三维细胞培养物***(2)中流速的方法优选地非接触和非侵入式进行，尤其是避免直接干扰三维细胞培养物***(2)例如无菌的独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)的环境。流速的非接触和非侵入式测定尤其使用光学装置进行。
使用红细胞作为测定三维细胞培养物***(2)中流速的探测剂的优势在于，不需要机械测量。这意味着没有可能污染或破坏所述***中敏感的和/或无菌的气氛的外来物质必须引入三维细胞培养物***(2)。另外，独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)的尺寸支持少量的流体例如血液或培养基通过所述***的连续循环，优选地4至15μl和更优选地4至8μl流体例如血液或培养基，使得使用常规的机械测量工具是复杂的。但是，红细胞为血液的一部分，已经包括在独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)的优选的实施方式中并且可用光学装置检测。另外，红细胞，作为器官***的天然组分，也可容易添加至灌注三维细胞培养物***(2)的培养基而不破坏所述***敏感的环境。在优选的实施方式中，三维细胞培养物***(2)中包括的细胞、多层细胞集群/多个多层细胞集群、细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)经天然包括红细胞的血液被提供了所有必需的关键组分。血液是强的缓冲液***。其为细胞、多层细胞集群/多个多层细胞集群、细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)提供所有必需的血浆蛋白，通过红细胞支持氧运输，和通过白细胞提供抗污染微生物的免疫活性。另外，为了测定所述***中的流速，在三维细胞培养物***(2)中使用红细胞的优势在于没有可能对细胞有毒害或可能具有副作用的外来物质例如化学品必须引入三维细胞培养物***(2)。而且，红细胞是红色的，并且因此，例如使用显微镜比如荧光显微镜清楚可见。
“可灌注”三维细胞培养物***(2)是可被流体比如血液或培养基注入的三维细胞培养物***。本领域技术人员应清楚，流体比如血液或培养基至少在进行测定流速的时间点注入所述***。
可灌注的三维细胞培养物***(2)以其最简单形式由下述组成：至少一个生长区域(3)，其具有微入口，通过其包含红细胞的流体例如血液和/或培养基可流入，例如培养基和/或血液入口，和具有微出口，通过其包含红细胞的流体可流出，例如培养基和/或血液出口。这种可灌注的三维细胞培养物***(2)可具有细胞培养管或细胞培养孔的形式。但是，优选地可灌注的三维细胞培养物***(2)是包括至少一个生长区域(3)的***，所述至少一个生长区域(3)具有微入口，通过其包含红细胞的流体例如血液和/或培养基可流入，例如培养基和/或血液入口，和具有微出口，通过其包含红细胞的流体可流出，例如培养基和/或血液出口。这种可灌注的三维细胞培养物***(2)优选地进一步包括与生长区域(3)的入口连接的微流体通道和与生长区域(3)的出口连接的微流体通道。尤其优选地，可灌注的三维细胞培养物***(2)是如上述的独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)。
进一步优选的是“可灌注”三维细胞培养物***(2)，尤其是“可灌注”三维细胞培养物***(2)的主体，由透明材料例如玻璃比如碳酸钙/碳酸氢钠玻璃或石英玻璃或塑料制造。这允许用上述光学装置非接触和非侵入式观察三维细胞培养物***(2)。尤其，其允许从外部分析三维细胞培养物***(2)。
可在三维细胞培养物***(2)的或三维细胞培养物***(2)中的不同区域，例如在微流体通道中，生长区域(3)中，尤其是生长区域(3)中包括的生长腔中，生长区域(3)的微入口中，生长区域(3)的微出口中，生长区域(3)的微流体入口通道中，或生长区域(3)的微流体出口通道中，测定流速。当测定流速时，可在第一时间点拍照区域的第一照片和可在第二时间点拍照同区域的第二照片。可选地，可在第一时间点拍照区域的第一照片，可在第二时间点拍照同区域的第二照片和可在第三时间点拍照同区域的第三照片，或可在第一时间点拍照区域的第一照片，可在第二时间点拍照同区域的第二照片和可在第三时间点拍照同区域的第三照片和可在第四时间点拍照同区域的第四照片。优选地当测定流速时，可在第一时间点拍照区域的第一照片和可在第二时间点拍照同区域的第二照片。两个时间点之间的间隔优选地等于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0秒。可用光学装置拍照。优选地，用显微镜，更优选地用荧光显微镜拍照。也可能从录像带产生相同区域不同时间点的两个照片。分派给至少一个红细胞代表所述至少一个红细胞在至少两个照片上位置改变的运动矢量和基于运动矢量测定所述细胞培养物***中的流速被描述在Adrian，R.J.；Westerweel，J.(2011).Particle ImageVelocimetry，剑桥大学出版社，ISBN 978-0-521-44008-0中。优选地，用URAPIV开源PIV软件分析照片。如果在三维细胞培养物***(2)中测定不止一个红细胞的流速，则基于所有的测量数据计算三维细胞培养物***(2)中的平均流速。优选地，血液，尤其是全血或血液组分，比如血浆或红细胞，或包含红细胞的培养基，灌注三维细胞培养物***(2)。
在另一优选的实施方式中，使用红细胞作为探测剂测定三维细胞培养物***(2)中生理学重量摩尔渗透压浓度的方法包括下述步骤：
(i)提供包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)，和
(ii)在培养所述细胞培养物***期间的时间点，确定所述细胞培养物***中至少一个红细胞例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100个红细胞的形状。
测定三维细胞培养物***(2)中生理学重量摩尔渗透压浓度的方法优选地非接触和非侵入式进行，尤其是避免了直接干扰三维细胞培养物***(2)例如无菌的独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)的环境。非接触和非侵入式测定生理学重量摩尔渗透压浓度尤其使用光学装置进行。
术语“生理学重量摩尔渗透压浓度”，如本文所使用，指正常的生理学环境例如血液中存在的溶质颗粒例如盐和/或糖颗粒造成的典型的平均渗透压。这种生理学重量摩尔渗透压浓度也应出现在三维细胞培养物***(2)、尤其三维细胞培养物***(2)包括的流体例如培养基或血液中。这种环境是尤其期望的以允许三维细胞培养物***(2)中细胞聚集、组织、类器官和/或器官的理想生长、分化和/或维持。
使用红细胞作为探测剂测定三维细胞培养物***(2)中生理学重量摩尔渗透压浓度的优势在于机械测量不是必需的。例如，重量摩尔渗透压浓度可在称为渗透压计的分析工具上测量。这意味着可能污染或破坏所述***中敏感的和/或无菌的气氛的外来物质不是必须引入三维细胞培养物***(2)。另外，独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)的尺寸支持少量的流体例如血液或培养基通过所述***的连续循环，优选地5和5000μl之间和更优选地20和200μl之间的流体例如血液或培养基，使得常规机械测量工具的使用是复杂的。但是，红细胞作为血液的一部分，已经包括在独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)的优选的实施方式中并且可用光学装置检测。另外，红细胞，作为器官***的天然组分，也可容易添加至三维细胞培养物***(2)中包括的培养基而不破坏所述***敏感的环境。
在优选的实施方式中，三维细胞培养物***(2)包括的细胞、多层细胞集群/多个多层细胞集群、细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)经天然包括红细胞的血液而被提供有必需的关键组分。另外，为了测定所述***中的生理学重量摩尔渗透压浓度，在三维细胞培养物***(2)中使用红细胞的优势在于可能毒害细胞或可能具有副作用的外来物质例如化学品不必须引入三维细胞培养物***(2)。此外，红细胞天然是血液、尤其是血浆的重量摩尔渗透压浓度的指示剂(见下述)。此外，红细胞是红色的，并且因此，例如使用显微镜比如荧光显微镜清楚可见。
三维细胞培养物***(2)可以是如上述的三维细胞培养物***。优选地，三维细胞培养物***(2)可以是如上述的可灌注的三维细胞培养物***。尤其优选地，可灌注的三维细胞培养物***(2)是如上述的独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)。更尤其优选地，三维细胞培养物***(2)，尤其是三维细胞培养物***(2)的主体，由透明材料例如玻璃比如碳酸钙/碳酸氢钠玻璃或石英玻璃或塑料制造。这允许用上述光学装置非接触和非侵入式观察三维细胞培养物***(2)。尤其，其允许从外部分析三维细胞培养物***(2)。
尤其优选地，血液，尤其全血或血液组分，比如血浆或红细胞，或包含红细胞的培养基，灌注三维细胞培养物***(2)。
如上提到，红细胞天然是血液、尤其是血浆重量摩尔渗透压浓度的指示剂。包括红细胞的培养基的重量摩尔渗透压浓度或血液、尤其血浆的重量摩尔渗透压浓度影响红细胞的体积和形状。红细胞，尤其是哺乳动物的红细胞，通常形状为两面凹的盘状：中间扁平和凹陷，具有哑铃状横截面，并且在盘的边缘有花托形边。这与众不同的两面凹的形状使得血液在大血管中的流动性质最佳，比如层流最大化和血小板散布最小化，这抑制那些大血管中其导致动脉粥样硬化的活性。红细胞形状的维持通常依赖于细胞内以及外部环境的因素。如果这些改变，细胞可变成球形。已经描述了至少三组导致球形形状的环境情况：渗透(低渗)膨胀、盘状红细胞-刺毛状红细胞转化、和盘状红细胞-胃形红细胞转化。到达某个点，所有三种类型的形状改变是可逆的。当红细胞悬浮在低渗溶液中时，出现渗透膨胀。在此类情况下，细胞获取水并且膨胀，首先变成杯形并且然后变成球形。这些改变与体积的增加同时细胞表面积保持相同或仅仅稍微增加相关。随着接近球形形状，细胞直径下降，这是表明膜的弹性性质的一个观察现象。当细胞内腺苷三磷酸(ATP)耗尽时，当细胞内钙增加时，当细胞暴露于储存血浆、高pH、阴离子去污剂、溶血卵磷脂或脂肪酸时，发生盘状红细胞-刺毛状红细胞转化。当红细胞暴露于低pH阳离子去污剂时，发生盘状红细胞-胃形红细胞转化。随着改变进行，细胞在一侧丢失凹陷，并且对侧凹痕深度增加，产生杯形细胞。因为在固定涂片上，此类细胞好像具有嘴状“气孔”而不是中央苍白的圆形区域，它们称为胃形红细胞。该细胞也可采取圆齿状形式。渗透(高渗)收缩可导致圆齿状形式。
基于上述，红细胞是三维细胞培养物***(2)中——尤其是三维细胞培养物***(2)包括的流体，例如通过或在三维细胞培养物***(2)中循环灌注的例如培养基或血液的——生理学重量摩尔渗透压浓度的适当指示剂。尤其，甚至重量摩尔渗透压浓度仅仅10％改变对光学参数具有剧烈的影响，这显示与对于10％的血细胞比容和氧饱和改变具有相同量级。
因此，优选地，至少一个红细胞的球形形状指示生理学重量摩尔渗透压浓度下降(低渗条件，过低浓度的溶质颗粒，例如盐和/或糖颗粒)，至少一个红细胞的圆齿状形状指示生理学重量摩尔渗透压浓度升高(高渗条件，过高浓度的溶质颗粒，例如盐和/或糖颗粒)，或至少一个红细胞的两面凹的形状指示生理学重量摩尔渗透压浓度稳定(等渗条件)。
当生理学重量摩尔渗透压浓度下降时，低渗条件出现在三维细胞培养物***(2)，尤其三维细胞培养物***(2)包括的流体例如培养基或血液中。换句话说，溶质颗粒例如盐和/或糖颗粒的浓度过低。此外，当生理学重量摩尔渗透压浓度升高时，高渗条件出现在三维细胞培养物***(2)，尤其三维细胞培养物***(2)包括的流体例如培养基或血液中。换句话说，溶质颗粒例如盐和/或糖颗粒的浓度过高。此外，当生理学重量摩尔渗透压浓度稳定时，等渗条件出现在三维细胞培养物***(2)，尤其三维细胞培养物***(2)包括的流体例如培养基或血液中。换句话说，盐浓度是正常的/理想的。
所述细胞培养物***中至少一个红细胞的形状可在所述细胞培养物***的培养期间的任何时间点测定。术语“培养”指允许细胞在控制条件下、一般在它们自然环境外部在三维细胞培养物***(2)中生长、分化和/或维持的复杂过程。优选地，在培养期间的周期性的时间点例如每小时或每天测定所述细胞培养物***中至少一个红细胞的形状。尤其优选地，在培养基/血液改变之后，在添加补充剂之后，和/或在添加测试化合物之后测定至少一个红细胞的形状(见下述)。
可用光学装置分析至少一个红细胞的形状。优选地，用显微镜，更优选地用荧光显微镜，分析至少一个红细胞的形状。所以，优选地使用探测软件。如果在三维细胞培养物***(2)中测定不止一个红细胞的形状，可计算三维细胞培养物***(2)中红细胞的平均形状，例如基于所有测量数据使用适当的计算机程序。
在进一步优选的实施方式中，使用红细胞作为探测剂测定三维细胞培养物***(2)中耗氧的方法包括下述步骤：
(i)提供包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)，
(ii)测定在所述细胞培养物***中的第一位置和第二位置红细胞的平均血红蛋白饱和度，和
(iii)基于在不同位置的平均血红蛋白饱和度计算所述细胞培养物***中的耗氧。
测定三维细胞培养物***(2)中耗氧的方法优选地非接触和非侵入式进行，尤其避免了直接干扰三维细胞培养物***(2)例如无菌的独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)的环境。耗氧的非接触和非侵入式测定尤其使用光学装置进行。
三维细胞培养物***(2)可以是如上述三维细胞培养物***。优选地，三维细胞培养物***(2)可以是如上述的可灌注的三维细胞培养物***。尤其优选地，可灌注的三维细胞培养物***(2)是如上述的独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)。更尤其优选地，三维细胞培养物***(2)，尤其是三维细胞培养物***(2)的主体，由透明材料例如玻璃比如碳酸钙/碳酸氢钠玻璃或石英玻璃或塑料制造。这允许用上述光学装置非接触和非侵入式观察三维细胞培养物***(2)。尤其，其允许从外部分析三维细胞培养物***(2)。
尤其优选地，血液，尤其是全血或血液组分，比如血浆或红细胞，或包含红细胞的培养基，灌注三维细胞培养物***(2)。
为了三维细胞培养物***(2)包括的、尤其是生长区域(3)包括的细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的理想的生长、分化和/或维持，必须提供气态培养基，例如O2/CO2。气态培养基，例如O2/CO2，可以以主动或被动方式提供。例如，气态培养基可经外部气体源例如O2/CO2提供至三维细胞培养物***(2)，尤其提供至其中包括的至少生长区域(3)。但是，优选地以被动方式，例如通过经气体可渗透的膜或聚合物箔和/或经微流体通道从环境扩散进入生长区域(3)，将气态培养基例如O2/CO2提供至三维细胞培养物***(2)，尤其提供至其中包括的至少一个生长区域(3)。该膜或聚合物箔优选地是流体密封的。气体例如O2/CO2直接聚集在三维细胞培养物***(2)包括的、尤其是生长区域(3)包括的细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)中，和/或溶解在***(2)包括的、尤其是所述***的微流体通道包括的流体例如血液或培养基中。为了提供最佳培养条件，非常期望观察三维细胞培养物***(2)的耗氧。高耗氧指示例如需氧能量供应，低耗氧指示例如通过糖酵解的能量供应。
如上提到，基于在三维细胞培养物***(2)中不同位置的平均血红蛋白饱和度，可计算所述细胞培养物***中的耗氧。
血红蛋白是几乎所有脊椎动物的红细胞中含铁的氧-运输金属蛋白。血液中的血红蛋白从呼吸器官(肺或鳃)携带氧至身体的其他部分(即组织)，在那里其释放氧以燃烧养分，提供能量以驱动生物体的功能，并且收集产生的二氧化碳，将其带回呼吸器官，从生物体分散。血红蛋白可以是氧分子饱和的(氧合血红蛋白)，或氧分子不饱和的(去氧血红蛋白)。
一般而言，红细胞的平均血红蛋白饱和度可在三维细胞培养物***(2)中的任何位置例如微流体通道中测定。但是，优选地，在至少一个生长区域(3)的上游位置和在至少一个生长区域(3)的下游位置测定红细胞的平均血红蛋白饱和度。尤其，为了测定三维细胞培养物***(2)的生长区域(3)包括的细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)、或器官(一个或多个)的耗氧，优选地在至少一个生长区域(3)的上游位置和在至少一个生长区域(3)的下游位置测定红细胞的平均血红蛋白饱和度。换句话说，红细胞的平均血红蛋白饱和度优选地在(富氧)流体例如血液或包含红细胞的培养基流入至少一个生长区域(3)之前的位置，例如在至少一个生长区域(3)的微入口或微流体入口通道，和在(富氧)流体例如血液或包含红细胞的培养基流出至少一个生长区域(3)之后的位置，例如在至少一个生长区域的微出口或微流体出口通道测量。
可使用光学装置测量血红蛋白饱和度。优选地，使用红外光源和红色光源，例如使用具有红光和红外光源的发光器比如具有红光和红外光LED的发光器，和光检测器，测量血红蛋白饱和度。在优选的实施方式中，三维细胞培养物***(2)由透明材料制造，从而具有红光和红外光源的发光器，例如LED，照射穿过测量位。如上提到，测量位在三维细胞培养物***(2)内的第一和第二位置，优选地在至少一个生长区域(3)上游的位置和在至少一个生长区域(3)下游的位置。优选地，光穿过测量位经传播和反射方法发送。在传播方法中，发光器和光检测器可彼此相对，测量位介于中间。然后光可穿过该位。在反射方法中，发光器和光检测器也可在测量位的上方或下面，优选地在下面，彼此靠近。光从发射器跨过该位反射回至探测剂。
血红蛋白饱和度测量进一步基于氧合和去氧血红蛋白的红光和红外光吸收特征。具体地，氧合血红蛋白吸收更多的红外光并且允许更多的红光穿过。去氧(或还原的)血红蛋白吸收更多的红光并且允许更多的红外光穿过。为了在三维细胞培养物***(2)中的第一和第二位置例如在至少一个生长区域(3)上游的位置和在至少一个生长区域(3)下游的位置测定血红蛋白饱和度，所述位置优选地用红外光和红光照射。红光优选地以600-750nm的波长发射和/或红外光的吸收优选地以850-1000nm的波长发射。这尤其基于下述事实：红光在600-750nm波带吸收和红外光在850-1000nm波带吸收。在传播或反射的红光(R)和红外光(IR)信号穿过三维细胞培养物***(2)中的第一和第二位置，例如在至少一个生长区域(3)上游的位置和在至少一个生长区域(3)下游的位置并且被光检测器收到之后，优选地计算R/IR比。优选地，将在三维细胞培养物***(2)的第一位置和第二位置例如在至少一个生长区域(3)上游的位置和在至少一个生长区域(3)下游的位置测定的R/IR比与(由经验公式构成的)“查询”表或校准曲线比较，将该比转换成血红蛋白饱和度值。血红蛋白饱和度的测定随后允许计算耗氧。
更优选地，血红蛋白饱和度用根据本发明第二方面的光学传感器设备(1)测量。所述光学传感器设备(1)优选地包括至少一个光激发纤维(4)和至少一个发光纤维(5)，尤其是红外发射纤维(9)。就所述光学传感器设备(1)的优选的实施方式而言，参考本发明的第二方面。再次，测定血红蛋白饱和度随后允许计算耗氧。
此外，在优选的实施方式中，通过测量活细胞荧光染料测定和/或监测三维细胞培养物***(2)活力的方法包括下述步骤：
(i)提供包括装载有活细胞荧光染料的至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)，和
(iia)在所述细胞培养物***的培养期间在第一时间点和在第二时间点测量所述细胞培养物***的至少一个生长区域(3)的至少一部分的平均荧光强度，并且比较在第二时间点的平均荧光强度和在第一时间点的平均荧光强度，和/或
(iib)在培养所述细胞培养物***期间的时间点，测量所述细胞培养物***的至少一个生长区域(3)的至少一部分的平均荧光强度，并且比较在所述时间点的平均荧光强度与至少一种对照细胞培养物***的平均荧光强度。
测定和/或监测三维细胞培养物***(2)的活力的方法优选地非接触和非侵入式进行，尤其避免了直接干扰三维细胞培养物***(2)例如无菌的独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)的环境。非接触和非侵入式测定和/或监测活力尤其使用光学装置进行。
三维细胞培养物***(2)可以是如上述的三维细胞培养物***。优选地，三维细胞培养物***(2)可以是如上述的可灌注的三维细胞培养物***。尤其优选地，可灌注的三维细胞培养物***(2)是如上述的独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)。尤其更优选地，三维细胞培养物***(2)，尤其是三维细胞培养物***(2)的主体，由透明材料例如玻璃比如碳酸钙/碳酸氢钠玻璃或石英玻璃或塑料制造。这允许用上述光学装置非接触和非侵入式观察三维细胞培养物***(2)。尤其，其允许从外部分析三维细胞培养物***(2)。
尤其优选地，血液，尤其是全血或血液组分，比如血浆或红细胞，或包含红细胞的培养基，灌注三维细胞培养物***(2)。
如上提到，在所述细胞培养物***的至少一个生长区域(3)的至少一部分，优选地在整个至少一个生长区域(3)，测定平均荧光强度。至少一个生长区域(3)的所述部分优选具有代表整个至少一个生长区域(3)的活力状态并且因此代表三维细胞培养物***(2)、尤其是其中包含的细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的活力状态的尺寸。至少一个生长区域(3)的所述部分可以是一层细胞、多层细胞(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多层细胞的区域)，或50×50×50μm、100×100×100μm、150×150×150μm、200×200×200μm、250×250×250μm、300×300×300μm、350×350×350μm、400×400×400μm、450×450×450μm或500×500×500μm的区域。
术语“活性荧光染料”，如本文所使用，指通过数代保留在活的和有活力的细胞中的荧光分子，例如QTracker活性荧光染料被子细胞继承至少六代。在细胞融合之后子细胞继承活性荧光染料并且不转移至群体中相邻的细胞。所述活性荧光染料仅仅保留在具有完整膜的活细胞中。将死亡的细胞或死亡的细胞没有完整的细胞膜，并且因此，不能结合活性荧光染料。将死亡的或死亡的细胞的细胞膜，例如，由于其中的孔和裂缝是泄露的或可渗透的。所述细胞不再是活的或具有降低的活力。一般而言，在造成细胞溶解例如细胞凋亡的所有条件下，活性荧光染料快速丢失。因此，在培养期间的不同时间点测量的活性荧光染料的荧光强度代表三维细胞培养物***(2)的、尤其其中包括的细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的活力的重要指示(见下述)。
通过将试剂添加至其中包括的流体例如血液或培养基，活性荧光染料可装载入三维细胞培养物***(2)。例如，通过将试剂添加至流体储器比如血液或培养基储器，活性荧光染料可装载入三维细胞培养物***(2)。也优选地，三维细胞培养物***(2)，例如独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)，经注入端口装载荧光染料。如上提到，三维细胞培养物***(2)，例如独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)，可包括注入端口，通过其可在温育期间不连续地施用物质，例如测试化合物、养分、流体、化学品比如活性荧光染料。所述注入端口优选地位于微流体运输通道中或连接至至少一个生长区域(3)。
活性荧光染料可自由通过细胞膜，但是一旦在细胞内，它们转化成不可透过细胞的反应产物。尤其优选CellTracker活性荧光染料。例如，CellTracker活性荧光染料包含例如在谷胱甘肽S-转移酶介导的反应中与巯基反应的氯甲基或溴甲基。在大部分细胞中，谷胱甘肽水平高(达10mM)并且谷胱甘肽S-转移酶普遍存在。所述染料优选地转化成不可透过细胞的荧光染料-硫醚加合物，其荧光可被检测。CellTracker活性荧光染料包括氨基、羟基和二氟羟基香豆素的蓝色荧光氯甲基衍生物(CMAC、CMHC和CMF2HC)，二醋酸荧光素的绿色荧光氯甲基衍生物(CMFDA)和染料，橙色荧光CMTMR和CMRA以及红色荧光CMTPX。CellTrackerTM蓝色CMAC、CMHC和CMF2HC，CellTrackerTM紫色，香豆素的紫色荧光溴甲基衍生物(BMQC)，CellTrackerTM绿色BODIPY，CellTrackerTM橙色CMTMR，和CellTrackerTM红色CMTPX，不需要酶切割来激活它们的荧光，而绿色CMFDA和橙色CMRA的确需要酶切割。
另一优选的活性荧光染料是钙荧光素AM。荧光指示剂的乙酰氧甲基(AM)酯衍生物和螯合剂组成另一有用的化合物组，用于细胞活力的研究。用AM酯基团修饰羧酸产生不带电荷的可透过细胞膜的分子。一旦在细胞内，亲脂封闭基团被非特异性酯酶切割，产生带电荷的形式，其从细胞的渗漏远比其母体化合物更慢。钙荧光素AM保留在具有完整膜的细胞中。其不标记死亡的细胞，并且在造成细胞溶解的条件下快速丢失。该特性允许对细胞活力进行流式细胞术或基于荧光的试验。
Qtracker活性荧光染料也是优选的。一旦在细胞内，Qtracker活性荧光染料提供强烈的、稳定的荧光，其可追踪数代，并且不转移至群体中相邻的细胞。
CellMask分子或FluoSpheres也可用于染色活细胞。
优选地，通过测量活细胞荧光染料监测三维细胞培养物***(2)活力的方法包括下述步骤：
(i)提供包括装载有活细胞荧光染料的至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)，和
(ii)在所述细胞培养物***的培养期间在第一时间点和在第二时间点测量所述细胞培养物***的至少一个生长区域(3)的至少一部分的(所述活细胞荧光染料的)平均荧光强度，并且比较在第二时间点的平均荧光强度和在第一时间点的平均荧光强度。
两个时间点之间，即培养期间第一时间点和第二时间点之间的间隔，优选地等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23小时，1、2、3、4、5、6天，1、2、3周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11月，或1年。术语“培养”指允许细胞在控制条件下，一般在它们的自然环境外部在三维细胞培养物***(2)中生长、分化和/或维持的复杂过程。
尤其优选地，当与在第一时间点的平均荧光强度比较时在第二时间点的平均荧光强度的下降指示所述细胞培养物***(2)的活力下降。
也尤其优选地，当与在第一时间点的平均荧光强度比较时在第二时间点的平均荧光强度的保持指示维持了所述细胞培养物***(2)的活力。
可将三维细胞培养物***(2)，尤其是其中包括的细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)，进一步暴露于测试化合物，尤其暴露于一个或多个测试化合物或测试化合物组合物，例如以便进行测试化合物长期暴露研究。这允许例如测定所述测试化合物(一个或多个)或测试化合物组合物是否对三维细胞培养物***(2)的活力，尤其对其中包括的细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的活力具有影响，例如测试化合物(一个或多个)或测试化合物组合物是否具有副作用，例如是否抑制细胞的生长和/或分化，或对细胞有毒。
例如，施加测试化合物至微流体回路(circuit)可类似于静脉内施用测试化合物，施加测试化合物至生长区域(3)中包括的皮肤可类似于真皮施用测试化合物，施加测试化合物至肺代表通过吸入施用测试化合物，和施加测试化合物至肠可代表口服施用测试化合物。
因此，进一步/另外优选地，所述细胞培养物***(2)用测试化合物、尤其用一个或多个测试化合物或用测试化合物组合物处理。
术语“测试化合物”，如本文所使用，意思是适于药学递送的任何化合物。测试化合物优选地选自细胞、病毒、细菌、基因修饰的细胞、核酸(例如包括转基因的载体)、蛋白质、肽、激素、抗体、RNA，优选siRNA或dsRNA，小分子比如小的有机或无机分子，优选大约800道尔顿，更优选大约500道尔顿，药物、药学上活性物质、代谢物、天然化合物，或土壤、植物或海来源的样品。测试化合物可被具体设计或可源自已经可用的文库。术语“文库”，如本文所使用，指样品的集合。优选地，以化学化合物文库的形式提供测试化合物。化学化合物文库包括多个化学化合物并且已经由任何多个来源组装，包括化学合成分子或天然产品，或已经由组合化学技术产生。它们尤其适于高通量筛选并且可由具体结构的化学化合物或具体生物体比如植物的化合物组成。例如，合成化合物文库是商业上可得自MaybridgeChemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、ChemBridge Corporation(San Diego，CA)，或Aldrich(Milwaukee，WI)。例如，天然化合物文库可获得自TimTecLLC(Newark，DE)。可选地，可以使用以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的文库。测试化合物优选地选自皮肤试剂、心血管试剂、肝脏试剂、肠试剂和神经毒剂。皮肤试剂更优选地选自化妆品成分和消费者产品化学品，心血管试剂更优选地选自心肌收缩剂和心肌松弛剂，肝脏试剂更优选地选自代谢I期调节试剂或代谢II期调节试剂，肠试剂更优选地选自食品添加剂，并且神经毒剂更优选地选自周围神经***神经毒剂和中枢神经***神经毒剂。
测试化合物，尤其是一个或多个测试化合物或测试化合物组合物，可通过将测试化合物，尤其一个或多个测试化合物或测试组合物，添加至流体储器比如血液或培养基储器，载入三维细胞培养物***(2)。也优选地，三维细胞培养物***(2)，例如独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)，经注入端口装载测试化合物，尤其是一个或多个测试化合物或测试化合物组合物。如上提到，三维细胞培养物***(2)，例如独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)，可包括注入端口，通过其物质例如测试化合物、养分、流体、化学品比如活性荧光染料可在温育期间不连续地施加。所述注入端口优选地位于微流体运输通道中或连接至至少一个生长区域(3)。
尤其优选地，测试化合物，尤其是一个或多个测试化合物或测试化合物组合物，在第二时间点测定平均荧光强度之前载入三维细胞培养物***(2)，例如在或恰好在第二时间点测定平均荧光强度之前8、7、6、5、4、3、2、1个月，3、2、1周，6、5、4、3、2、1天，24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1小时。也尤其优选地，测试化合物，尤其是一个或多个测试化合物或测试化合物组合物，在第一时间点测定平均荧光强度之后载入三维细胞培养物***(2)，例如在或恰好在第一时间点测定平均荧光强度之后8、7、6、5、4、3、2、1月，3、2、1周，6、5、4、3、2、1天，24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1小时，优选地恰好在第一时间点测定平均荧光强度之后。这样，可研究测试化合物、尤其是一个或多个测试化合物对三维细胞培养物***的影响。
测试化合物可对活性荧光染料的平均荧光强度有或没有影响。活性荧光染料的平均荧光强度的改变或保持可指示所述细胞培养物***(2)的活力。
尤其优选地，当与在第一时间点的平均荧光强度比较时在第二时间点的平均荧光强度的下降，指示所述细胞培养物***(2)的活力下降。
也尤其优选地，当与在第一时间点的平均荧光强度比较时在第二时间点的平均荧光强度的保持，指示维持所述细胞培养物***(2)的活力。
另外或可选地，也优选地，通过测量活细胞荧光染料确定三维细胞培养物***(2)活力的方法包括下述步骤：
(i)提供包括装载活细胞荧光染料的至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)，和
(ii)在培养所述细胞培养物***期间的时间点，测量所述细胞培养物***的至少一个生长区域(3)的至少一部分的(所述活细胞荧光染料的)平均荧光强度，并且比较在所述时间点的平均荧光强度与至少一种对照细胞培养物***的平均荧光强度。
平均荧光强度可在下述时间点测量：开始三维细胞培养物***(2)的培养过程之后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23小时，1、2、3、4、5、6天，1、2、3周，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11月或1年。术语“培养”指允许细胞在控制条件下、一般在它们的自然环境外部在三维细胞培养物***(2)中生长、分化和/或维持的复杂过程。
对照细胞培养物***可以是通过比较其平均荧光强度与三维细胞培养物***(2)的平均荧光强度就三维细胞培养物***(2)的活力允许表达主张的任何***。对照细胞培养物***优选地没有装载活细胞荧光染料，优选地没有装载如上提到的具体活细胞荧光染料。优选地，没有装载活细胞荧光染料的对照细胞培养物***是如上述的三维细胞培养物***，例如如上述的独立式和/或循环三维细胞培养物***。更优选地，对照细胞培养物***与步骤(i)中提供的三维细胞培养物***相同但是没有装载活细胞荧光染料。
尤其优选地，与对照细胞培养物***的平均荧光强度相比在所述时间点的平均荧光强度的增加，指示所述细胞培养物***(2)是有活力的。
也尤其优选地，在所述时间点的平均荧光强度与对照细胞培养物***的平均荧光强度的相似性，指示所述细胞培养物***(2)没有活力。
如上提到，三维细胞培养物***(2)，尤其其中包括的细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)，可进一步暴露于测试化合物，尤其暴露于一个或多个测试化合物或暴露于测试化合物组合物，例如以便进行测试化合物长期暴露研究。这允许例如以便测定所述测试化合物(一个或多个)或测试化合物组合物是否对三维细胞培养物***(2)的活力、尤其对其中包括的细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的活力具有影响，例如测试化合物(一个或多个)或测试化合物组合物是否具有副作用，例如是否抑制细胞的生长和/或分化，或对细胞有毒。
因此，进一步/另外优选地所述细胞培养物***(2)用测试化合物、尤其用一个或多个测试化合物或用测试化合物组合物处理，并且对照细胞培养物***没有用测试化合物、尤其是一个或多个测试化合物或测试化合物组合物处理。
关于术语“测试化合物”和“文库”的定义、“测试化合物”优选的实施方式以及关于装载入三维细胞培养物***(2)的“测试化合物”的具体形式，参考上述定义和阐释。
没有用测试化合物处理的对照细胞培养物***优选地是三维细胞培养物***。优选地，没有用测试化合物处理的对照细胞培养物***是如上述的三维细胞培养物***，例如如上述的独立式和/或循环三维细胞培养物***。更优选地，所述对照细胞培养物***与步骤(i)中提供的三维细胞培养物***相同，但是没有用测试化合物处理。最优选地，上面提到的对照细胞培养物***没有装载活细胞荧光染料，优选地没有装载如上提到的活细胞荧光染料。
测试化合物对活性荧光染料的平均荧光强度可有或可没有影响。活性荧光染料的平均荧光强度的改变或保持可指示所述细胞培养物***(2)的活力。
尤其优选地，与对照细胞培养物***(尤其没有装载测试化合物和/或没有装载活细胞荧光染料)的平均荧光强度相比在所述时间点的平均荧光强度的增加指示所述细胞培养物***(2)是有活力的。
也尤其优选地，在所述时间点的平均荧光强度与对照细胞培养物***(尤其没有装载测试化合物和/或没有装载活细胞荧光染料)的平均荧光强度的相似性指示所述细胞培养物***(2)没有活力。
优选地，上述对照细胞培养物***和三维细胞培养物***(2)的培养条件相同和/或两个***中的测量时间彼此一致以便改善测量数据的可比性。
优选地，测定/测量平均自发荧光强度通过光谱测定法(例如UV/VIS光谱测定法)，优选地使用荧光计、荧光阅读器和/或荧光显微镜进行。更优选地，平均自发荧光强度使用根据本发明第二方面的光学传感器设备(1)测定/测量。所述光学传感器设备(1)优选地包括至少一个光激发纤维(4)和至少一个发光纤维(5)，尤其是荧光发射纤维(8)。就所述光学传感器设备(1)的优选的实施方式而言，参考本发明的第二方面。
此外，在优选的实施方式中，通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比测定和/或监测三维细胞培养物***(2)的代谢状态的方法包括下述步骤：
(i)提供包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)，
(ii)激活所述细胞培养物***的所述至少一个生长区域(3)中包括的NADH和/或FAD(优选地用紫外光)，和
(iiia)在所述细胞培养物***的至少一个生长区域(3)的至少一部分中，在所述细胞培养物***的培养期间第一时间点和在第二时间点，测量NADH的平均自发荧光强度，测量FAD的平均自发荧光强度，测定NADH/NAD+比和/或测定NADH/FAD比，和
比较在第二时间点的NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比与在第一时间点的NADH的平均荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比，和/或
(iiib)在培养所述细胞培养物***期间的时间点，在所述细胞培养物***的至少一个生长区域(3)的至少一部分中测量NADH的平均自发荧光强度，测量FAD的平均自发荧光强度，测定NADH/NAD+比和/或测定NADH/FAD比，和
比较在所述时间点的NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比与对照细胞培养物***的NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比。
测定和/或监测三维细胞培养物***(2)的代谢状态的方法优选地非接触和非侵入式进行，尤其避免直接干扰三维细胞培养物***(2)例如无菌的独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)的环境。代谢状态的非接触和非侵入式测定和/或监测尤其使用光学装置进行。
三维细胞培养物***(2)可以是如上述的三维细胞培养物***。优选地，三维细胞培养物***(2)可以是如上述的可灌注的三维细胞培养物***。尤其优选地，可灌注的三维细胞培养物***(2)是如上述的独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)。尤其更优选地，三维细胞培养物***(2)，尤其是三维细胞培养物***(2)的主体，由透明材料例如玻璃比如碳酸钙/碳酸氢钠玻璃或石英玻璃或塑料制造。这允许用上述光学装置非接触和非侵入式观察三维细胞培养物***(2)。尤其，其允许从外部分析三维细胞培养物***(2)。
尤其优选地，血液，尤其是全血或血液组分，比如血浆或红细胞，或包含红细胞的培养基，灌注三维细胞培养物***(2)。
如上提到，平均荧光强度在所述细胞培养物***的至少一个生长区域(3)的至少一部分、优选地在整个至少一个生长区域(3)中测定。至少一个生长区域(3)的所述部分优选具有这样的尺寸——其代表整个至少一个生长区域(3)的活力状态，并且因此代表三维细胞培养物***(2)、尤其是其中包含的细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的活力状态。至少一个生长区域(3)的所述部分可以是一层细胞、多层细胞(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多层细胞的区域)，或50×50×50μm、100×100×100μm、150×150×150μm、200×200×200μm、250×250×250μm、300×300×300μm、350×350×350μm、400×400×400μm、450×450×450μm或500×500×500μm的区域。
术语“细胞代谢”，如本文所使用，意思是在活细胞中发生的导致生长、产能、废物质消除和外部物质解毒的所有化学过程的总和。在本发明的方法中，三维细胞培养物***(2)、尤其是三维细胞培养物***(2)中包括的多层细胞集群/多个多层细胞集群、细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的代谢状态通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比进行测定和/或监测。
术语“自发荧光”，如本文所使用，意思是当它们吸收光时，生物结构比如线粒体和溶酶体自然发光。最常观察到的自发荧光分子是NADPH(NADH＝还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和FAD(FAD＝氧化形式的黄素腺嘌呤二核苷酸)。细胞内并因此细胞聚集、组织、类器官或器官中的代谢可由NADH/NAD+比(NAD+＝氧化形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和/或NADH/FAD比表征。所述分子以产能的基础机制起作用，比如糖酵解、柠檬酸循环和作为电子转运蛋白的呼吸链以便在氧化磷酸化期间允许腺苷-二磷酸(ADP)转化成腺苷-三磷酸(ATP)。氧化还原对NADH/NAD+和FAD/FADH2(FADH2＝还原形式的黄素腺嘌呤二核苷酸)取决于它们的氧化态具有不同的荧光行为。在氧化还原对NADH/NAD+中，如果在大约320和350nm之间发生激发，NADH通常在大约400和490nm之间发荧光。与NADH相反，NAD不发荧光。在氧化还原对FAD/FADH2中，如果在大约300和380nm之间或在大约430和480nm之间发生激发，FAD通常在大约500和560nm之间发荧光。与FAD相反，FADH2不发荧光。因为仅NADH具有而NAD+没有该发荧光行为，可能区别这两个氧化还原组分，并且因为仅FAD具有而FADH2没有该发荧光行为，可能区别这两个氧化还原组分。细胞内NAD+与NADH的比通常等于0.05。由于NADH和NAD+以及FAD和FADH2在细胞功能中的重要位置，基于NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比，已经可能关于细胞内氧化还原势以及关于产能状态并因此关于细胞代谢作出判断。例如，高的NADH浓度相当于线粒体呼吸链降低的效率。另外，仅NADH/NAD+比显示取决于线粒体产能的特定改变。
NADH/NAD+比或NADH/FAD比优选地用光谱测定法测定，例如用UV光源比如UV激光器和UV/VIS分光计。为了该目的，可使用接触测定位、连接至UV/VIS分光计的发光器。对于NADH，在测量位的区域中的细胞可用波长为337nm的UV激光器激发。NADH的自发荧光可在450或460nm的波长下使用光电倍增管测量。对于FAD，测量位的区域中的细胞可用波长为330nm(第一吸收峰)的UV激光器激发。FAD的自发荧光可在520或530nm的波长下使用光电倍增管测量。对于FAD，测量位的区域中的细胞可进一步用波长为450nm(第二吸收峰)的UV激光器激发。FAD的自发荧光也可在520或530nm波长下使用光电倍增管测量。
NADH优选地以在大约320和350nm之间、更优选地在大约320和340nm之间和最优选地在337nm的波长例如使用UV光源激活，以及NADH的自发荧光优选地在大约400和490nm之间、更优选地大约420和460nm之间的波长下和最优选地在450或460nm的波长下例如使用UV/VIS分光计测量。FAD优选地在大约300和380nm之间、更优选地大约330和360nm之间的波长下和最优选地在330nm的波长或在大约430和480nm之间、更优选地在大约440和460nm之间的波长和最优选地在450nm的波长下，例如使用UV光源激活，以及FAD的自发荧光优选地在大约500和560nm之间、更优选地大约520和540nm之间的波长和最优选地在520或530nm的波长下，例如使用UV/VIS分光计测量。
尤其优选地，使用根据本发明第二方面的光学传感器设备(1)测量NADH和/或FAD的平均自发荧光强度和/或确定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比。所述光学传感器设备(1)优选地包括至少一个光激发纤维(4)和至少一个发光纤维(5)。更优选地，所述光学传感器设备(1)包括(i)UV光激发纤维，(ia)其尤其允许在大约320和350nm之间的波长下，例如在337nm下活化NADH，(ib)其尤其允许在大约300和380nm之间的波长下，例如在330nm下，和/或在大约430和480nm之间的波长下，例如在450nm下活化FAD，或(ic)其尤其允许在大约320和350nm之间的波长下，例如在337nm下活化NADH，和其尤其允许在大约300和380nm之间的波长下，例如在330nm下，和/或在大约430和480nm之间的波长，例如在450nm下活化FAD，(ii)NADH发射纤维(6)，其尤其允许在大约400和490nm之间的波长，例如在450或460nm下探测NADH的自发荧光，和/或(iii)FAD发射纤维(7)，其尤其允许在大约500和560nm之间的波长，例如在520或530nm下探测FAD的自发荧光。关于所述光学传感器设备(1)的优选的实施方式，参考本发明的第二方面。
优选地，通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比监测三维细胞培养物***(2)代谢状态的方法包括下述步骤：
(i)提供包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)，
(ii)(用紫外光)激活所述细胞培养物***的所述至少一个生长区域(3)中包括的NADH和/或FAD，和
(iii)在所述细胞培养物***的至少一个生长区域(3)的至少一部分中，在所述细胞培养物***的培养期间在第一时间点和在第二时间点，测量NADH的平均自发荧光强度，测量FAD的平均自发荧光强度，测定NADH/NAD+比和/或测定NADH/FAD比，和
比较在第二时间点的NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比与在第一时间点的NADH的平均荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比。
两个时间点之间即培养期间第一时间点和第二时间点之间的间隔优选地等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23小时，1、2、3、4、5、6天、1、2、3周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11月，或1年。术语“培养”指允许细胞在控制条件下、一般在它们的自然环境外部在三维细胞培养物***(2)中生长、分化和/或维持的复杂过程。
尤其优选地，当与在第一时间点的NADH的平均荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比相比较时，在第二时间点保持NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比，指示所述细胞培养物***(2)的代谢稳定。
进一步尤其优选地
(i)当与在第一时间点的NADH的平均荧光强度相比较时，在第二时间点NADH的平均自发荧光强度的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，
(ii)当与在第一时间点的NADH/NAD+比相比较时，在第二时间点的NADH/NAD+比的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，
(iii)当与在第一时间点的NADH/FAD比相比较时，NADH/FAD比在第二时间点的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，和/或
(iv)当与在第一时间点的FAD的平均荧光强度相比较时，在第二时间点FAD的平均自发荧光强度的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加。
也尤其优选地，
(i)当与在第一时间点的NADH的平均荧光强度相比较时，在第二时间点NADH的平均自发荧光强度的增加，指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，
(ii)当与在第一时间点的NADH/NAD+比相比较时，在第二时间点的NADH/NAD+比的增加，指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，
(iii)当与在第一时间点的NADH/FAD比相比较时，在第二时间点NADH/FAD比的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，和/或
(iv)当与在第一时间点的FAD的平均荧光强度相比较时，在第二时间点FAD的平均自发荧光强度的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降。
三维细胞培养物***(2)，尤其是其中包括的细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)，可进一步暴露于测试化合物，尤其暴露于一个或多个测试化合物或测试化合物组合物，例如以进行测试化合物长期暴露研究。这允许例如测定所述测试化合物或测试化合物组合物对三维细胞培养物***(2)的代谢，尤其对其中包括的细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的代谢是否具有影响，例如测试化合物(一个或多个)或测试化合物组合物对NADH、FAD、NADH/FAD比和/或NADH/NAD+比是否具有影响。
例如，施加测试化合物至微流体回路可类似于静脉内施用测试化合物，施加测试化合物至生长区域(3)中包括的皮肤可类似于真皮施用测试化合物，施加测试化合物至肺表示通过吸入施用测试化合物，和施加测试化合物至肠可表示口服施用测试化合物。
因此，进一步/另外优选地，所述细胞培养物***(2)用测试化合物、尤其用一个或多个测试化合物或用测试化合物组合物处理。
关于术语“测试化合物”和“文库”的定义、“测试化合物”优选的实施方式和关于装载入三维细胞培养物***(2)的“测试化合物”的具体形式，参考上述定义和阐释。
尤其优选地，在第二时间点，测量NADH的平均自发荧光强度之前，测量FAD的平均自发荧光强度之前，测定NADH/NAD+比之前和/或测定NADH/FAD比之前，例如在或恰好在第二时间点测量NADH的平均自发荧光强度之前、测量FAD的平均自发荧光强度之前、测定NADH/NAD+比之前和/或测定NADH/FAD比之前的8、7、6、5、4、3、2、1月，3、2、1周，6、5、4、3、2、1天，24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1小时，将测试化合物、尤其是一个或多个测试化合物或测试化合物组合物装载入三维细胞培养物***(2)。也尤其优选地，在第一时间点测量NADH的平均自发荧光强度之后，测量FAD的平均自发荧光强度之后，测定NADH/NAD+比之后和/或测定NADH/FAD比之后，例如在或恰好在第一时间点测量NADH的平均自发荧光强度之后、测量FAD的平均自发荧光强度之后、测定NADH/NAD+比之后和/或测定NADH/FAD比之后的8、7、6、5、4、3、2、1月，3、2、1周，6、5、4、3、2、1天，24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1小时，优选地恰好在第一时间点的上述测量(一种或多种)和/或测定(一种或多种)之后，将测试化合物、尤其是一个或多个测试化合物或测试化合物组合物装载入三维细胞培养物***(2)。这样，可研究测试化合物、尤其是一个或多个测试化合物对三维细胞培养物***的作用。
测试化合物可对NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比有或没有影响。所述平均自发荧光强度和/或所述比(一个或多个)的改变可指示所述细胞培养物***(2)的代谢状态。
尤其优选地，
(i)当与在第一时间点的NADH的平均荧光强度相比较时，在第二时间点NADH的平均自发荧光强度的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，
(ii)当与在第一时间点的NADH/NAD+比相比较时，在第二时间点的NADH/NAD+比的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，
(iii)当与在第一时间点的NADH/FAD比相比较时，NADH/FAD比在第二时间点的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，和/或
(iv)当与在第一时间点的FAD的平均荧光强度相比较时，在第二时间点FAD的平均自发荧光强度的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加。
也尤其优选地，
(i)当与在第一时间点的NADH的平均荧光强度相比较时，在第二时间点NADH的平均自发荧光强度的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，
(ii)当与在第一时间点的NADH/NAD+比相比较时，在第二时间点的NADH/NAD+比的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，
(iii)当与在第一时间点的NADH/FAD比相比较时，在第二时间点NADH/FAD比的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，和/或
(iv)当与在第一时间点的FAD的平均荧光强度相比较时，在第二时间点FAD的平均自发荧光强度的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降。
另外或可选地，也优选的是通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比测定三维细胞培养物***(2)的代谢状态方法包括下述步骤：
(i)提供包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)，
(ii)(用紫外光)激活所述细胞培养物***的所述至少一个生长区域(3)包括的NADH和/或FAD，和
(iii)在培养所述细胞培养物***期间的时间点，在所述细胞培养物***的至少一个生长区域(3)的至少一部分中测量NADH的平均自发荧光强度，测量FAD的平均自发荧光强度，测定NADH/NAD+比和/或测定NADH/FAD比，和
将在所述时间点的NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比与对照细胞培养物***的NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比进行比较。
可在下述时间点测量NADH的平均荧光强度、测量FAD的平均荧光强度、测定NADH/NAD+比和/或测定NADH/FAD比：开始三维细胞培养物***(2)的培养过程之后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23小时，1、2、3、4、5、6天，1、2、3周，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11月，或1年。术语“培养”指允许细胞在控制条件下、一般在它们的自然环境外部在三维细胞培养物***(2)中生长、分化和/或维持的复杂过程。
对照细胞培养物***优选地是代表在培养开始点或在培养期间任何其他感兴趣的点——例如流体如血液或培养基适应之前/之后的点、或改变培养条件比如温度、压力和/或pH之前/之后的点——的代谢状态的***。优选地所述对照细胞培养物***是如上述的三维细胞培养物***，例如如上述的独立式和/或循环三维细胞培养物***。更优选地，对照细胞培养物***与步骤(i)中提供的例如代表在培养开始点的代谢状态的三维细胞培养物***相同。
尤其优选地，在所述时间点的NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比与对照细胞培养物***的NADH的平均荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比的相似性指示所述细胞培养物***(2)的代谢稳定。
也尤其优选地，
(i)与对照细胞培养物***的NADH的平均自发荧光强度相比较，在所述时间点NADH的平均自发荧光强度的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，
(ii)与对照细胞培养物***的NADH/NAD+比相比较，在所述时间点NADH/NAD+比的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，
(iii)与对照细胞培养物***的NADH/FAD比相比较，在所述时间点NADH/FAD比的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，和/或
(iv)与对照细胞培养物***的FAD的平均自发荧光强度相比较，在所述时间点FAD的平均自发荧光强度的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加。
进一步尤其优选地
(i)与对照细胞培养物***的NADH的平均自发荧光强度相比较，在所述时间点的NADH的平均自发荧光强度的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，
(ii)与对照细胞培养物***的NADH/NAD+比相比较，所述时间点的NADH/NAD+比的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，
(iii)与对照细胞培养物***的NADH/FAD比相比较，在所述时间点NADH/FAD比的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，和/或
(iv)与对照细胞培养物***的FAD的平均自发荧光强度相比较，在所述时间点的FAD的平均自发荧光强度的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降。
如上提到，三维细胞培养物***(2)，尤其是其中包括的细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)，可进一步暴露于测试化合物，尤其暴露于一个或多个测试化合物或暴露于测试化合物组合物，例如以进行测试化合物长期暴露研究。这允许例如测定所述测试化合物或测试化合物组合物对三维细胞培养物***(2)的代谢，尤其对其中包括的细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)的代谢是否具有影响，例如测试化合物(一个或多个)或测试化合物组合物对NADH、FAD、NADH/FAD比和/或NADH/NAD+比是否具有影响。
因此，进一步/另外优选地，所述细胞培养物***(2)用测试化合物、尤其用一个或多个测试化合物或用测试化合物组合物处理，并且对照细胞培养物***没有用测试化合物、尤其没有用一个或多个测试化合物或测试化合物组合物处理。
关于术语“测试化合物”和“文库”的定义、“测试化合物”的优选实施方式和关于装载入三维细胞培养物***(2)的“测试化合物”的具体形式而言，参考上述定义和阐释。
没有用测试化合物处理的对照细胞培养物***优选地是三维细胞培养物***。优选地，没有用测试化合物处理的对照细胞培养物***是如上述的三维细胞培养物***，例如如上述的独立式和/或循环三维细胞培养物***。更优选地，所述对照细胞培养物***与步骤(i)中提供的三维细胞培养物***相同，但是没有用测试化合物处理。
测试化合物可对NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比有或没有影响。所述平均自发荧光强度和/或所述比(一个或多个)的改变或保持可指示所述细胞培养物***(2)的代谢状态。
尤其优选地，在所述时间点的NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比与对照细胞培养物***的NADH的平均荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比的相似性指示所述细胞培养物***(2)的代谢稳定。
也尤其优选地，
(i)与对照细胞培养物***的NADH的平均自发荧光强度相比较，在所述时间点NADH的平均自发荧光强度的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，
(ii)与对照细胞培养物***的NADH/NAD+比相比较，在所述时间点NADH/NAD+比的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，
(iii)与对照细胞培养物***的NADH/FAD比相比较，在所述时间点NADH/FAD比的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，和/或
(iv)与对照细胞培养物***的FAD的平均自发荧光强度相比较，在所述时间点FAD的平均自发荧光强度的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加。
进一步尤其优选地
(i)与对照细胞培养物***的NADH的平均自发荧光强度相比较，在所述时间点的NADH的平均自发荧光强度的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，
(ii)与对照细胞培养物***的NADH/NAD+比相比较，所述时间点的NADH/NAD+比的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，
(iii)与对照细胞培养物***的NADH/FAD比相比较，在所述时间点NADH/FAD比的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，和/或
(iv)与对照细胞培养物***的FAD的平均自发荧光强度相比较，在所述时间点的FAD的平均自发荧光强度的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降。
优选地，上述对照细胞培养物***和三维细胞培养物***(2)的培养条件相同和/或两个***中的测量时间彼此一致以便改善测量数据的可比性。
优选地，平均自发荧光强度的测量通过光谱测定法(例如UV/VIS光谱测定法)，优选地使用荧光计、荧光阅读器或荧光显微镜进行。如上面已经提到，尤其优选地，使用根据本发明第二方面的光学传感器设备(1)测量NADH和/或FAD的平均自发荧光强度和/或测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比。
上述方法可尤其用于体外分析神经细胞/神经细胞聚集，例如神经节/神经节聚集。为了确立神经细胞例如神经节中的动作电位，需要大量的能量资源。经钠(Na+)在细胞外区域中的主动运输和钾(K+)在胞质溶胶中的主动运输，结合膜的Na+/K+ATP酶建立激发电势。该运输需要的能量经ADP的去磷酸化实现。为了再生能量载体，NADH在呼吸链中氧化。因此，就测定NADH+/NAD比，如上述，可能关于神经细胞/神经细胞聚集例如神经节/神经节聚集在三维细胞培养物***(2)、尤其是在如本文所描述的独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)中的激发电势进行陈述。因此，利用上述方法可能监测包括神经细胞/神经细胞聚集例如神经节/神经节聚集的三维细胞培养物***(2)，尤其是在施加测试化合物之后。
在上述方法中，优选地，至少一个生长区域(3)包括多层细胞集群、细胞聚集、组织、类器官或器官。更优选地，细胞聚集是神经细胞聚集，尤其是神经节聚集。进一步更优选地，类器官是肝小叶、肾的肾单位、皮肤的真皮和/或表皮、内脏粘膜、胰腺的胰岛、脑皮质和小脑的灰质和白质，或成年促静止干细胞小生境。也更优选地，器官是微肺、微心脏、微皮肤、微内脏、微脑、微骨髓、微骨、微脾、微胰腺、微睾丸或微肝。尤其更优选地，三维细胞培养物***(2)包括多于一个生长区域(3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个生长区域(3)，其中每个生长区域(3)包括相同的多层细胞集群、细胞聚集、组织、类器官或器官。例如，每个生长区域(3)可包括选自肝小叶、肾的肾单位、皮肤的真皮和/或表皮、内脏粘膜、胰腺的胰岛、脑皮质和小脑的灰质和白质以及成年促静止干细胞小生境的类器官。每个生长区域(3)也可包括选自微肺、微心脏、微皮肤、微内脏、微脑、微骨髓、微骨、微脾、微胰腺、微睾丸和微肝的器官。也尤其更优选地，三维细胞培养物***(2)包括多于一个生长区域(3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个生长区域(3)，其中每个生长区域(3)包括另一多层细胞集群、细胞聚集、组织、类器官或器官。例如，每个生长区域(3)可包括(独立地)选自肝小叶、肾的肾单位、皮肤的真皮和/或表皮、内脏粘膜、胰腺的胰岛、脑皮质和小脑的灰质和白质以及成年促静止干细胞小生境的类器官。每个生长区域(3)也可包括(独立地)选自微肺、微心脏、微皮肤、微内脏、微脑、微骨髓、微软骨、微骨、微脾、微胰腺、微睾丸和微肝的器官。因此，在最优选的实施方式中，三维细胞培养物***(2)是多细胞聚集、多组织、多类器官和/或多器官三维细胞培养物***(2)，例如多类器官三维细胞培养物***(2)，其中类器官(独立地)选自肝小叶、肾的肾单位、皮肤的真皮和/或表皮、内脏粘膜、胰腺的胰岛、脑皮质和小脑的灰质和白质以及成年促静止干细胞小生境，或多器官三维细胞培养物***(2)，其中器官(独立地)选自微肺、微心脏、微皮肤、微内脏、微脑、微骨髓、微软骨、微骨、微脾、微胰腺、微睾丸和微肝。多器官三维细胞培养物***(2)也可称为多器官芯片(MOC)。
在第二方面中，本发明涉及光学传感器设备(1)，其配置为根据本发明的第一方面进行测定和/或监测包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)的或包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)中的至少一个条件、优选地两个或三个条件的方法，其中至少一个条件、优选地两个或三个条件选自
(i)生理学条件，
(ii)活力，和
(iii)代谢状态，
其中使用红细胞作为所述条件的探测剂测定生理学条件，通过测量活细胞荧光染料测定和/或监测活力，和通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比，测定和/或监测代谢状态。
优选地，测定和/或监测的(两个或三个)条件是(i)生理学条件和活力，(ii)生理学条件和代谢状态，(iii)活力和代谢状态，或(iv)生理学条件、活力和代谢状态，其中使用红细胞作为所述条件的探测剂测定生理学条件，通过测量活细胞荧光染料测定和/或监测活力，和通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比，测定和/或监测代谢状态。
关于术语“细胞活力”、“细胞代谢”、“生理学条件”的定义，参考本发明的第一方面。
生理学条件优选地是三维细胞培养物***(2)中的或三维细胞培养物***(2)的流速、生理学重量摩尔渗透压浓度和/或耗氧。优选地红细胞用作探测剂，用于测定三维细胞培养物***(2)中的或三维细胞培养物***(2)的流速、生理学重量摩尔渗透压浓度和/或耗氧，例如(i)流速和生理学重量摩尔渗透压浓度，(ii)流速和耗氧，(iii)生理学重量摩尔渗透压浓度和耗氧，或(iv)流速，生理学重量摩尔渗透压浓度和耗氧。
关于所述方法的优选实施方式，参考本发明的第一方面。
光学传感器设备(1)优选地配置为进行上面提到的非接触和非侵入式测定和/或监测上面提到的至少一个条件例如至少一个、两个或三个条件的方法，尤其为了避免直接干扰三维细胞培养物***(2)例如无菌的独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)的环境。因此，光学传感器设备(1)优选地配置为允许从三维细胞培养物***(2)的外部测量，例如，直接穿过可以是透明的三维细胞培养物***(2)的主体，并且例如在光学传感器设备(1)和三维细胞培养物***(2)之间没有直接接触，例如不将光学传感器设备(1)***三维细胞培养物***(2)、尤其***至少一个生长区域(3)包括的细胞聚集(一个或多个)、组织(一个或多个)、类器官(一个或多个)和/或器官(一个或多个)中。
此外，所述光学传感器设备(1)优选地不需要操作和/或修饰三维细胞培养物***(2)，例如无菌的独立式和/或循环三维细胞培养物***(2)，以进行上述测定和/或监测上面提到的至少一个条件例如至少一个、两个或三个条件的方法。这种处理优选地降低污染的风险并且保持三维细胞培养物***(2)中的无菌环境。这尤其重要，因为三维细胞培养物***(2)非常复杂和脆弱。
此外，光学传感器设备(1)优选地允许自动进行上述方法，尤其是连续监测上面提到的至少一个条件，例如至少一个、两个或三个条件。
而且，光学传感器设备(1)的优势在于，其允许在三维细胞培养物***(2)中并且不仅仅在单层细胞中进行上述方法。正如其名，三维细胞培养物***(2)是细胞的三维(3D)集群，例如细胞聚集、组织、类器官或器官。如上提到，细胞的三维(3D)集群例如细胞聚集、组织、类器官或器官优选地包括在是三维细胞培养物***(2)的一部分的至少一个生长区域(3)中。所述生长区域(3)或所述生长区域(3)的至少一部分——其包括例如细胞聚集、组织、类器官或器官——优选地用光学传感器设备(1)测量。尤其，光学传感器设备(1)允许在至少50×50×50μm、100×100×100μm、150×150×150μm、200×200×200μm、250×250×250μm、300×300×300μm、350×350×350μm、400×400×400μm、450×450×450μm或500×500×500μm的区域，更尤其在至少500×500×500μm的区域进行上述方法，例如测定该区域包括的所有活性荧光染料的平均荧光强度，测定该区域包括的所有细胞的平均荧光强度，和测定该区域中的NADH和/或FAD的自发荧光。该区域优选地位于三维细胞培养物***(2)中并且不在所述***的表面，尤其是深度为至少50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μm，更尤其深度为至少500μm。更具体地，光学传感器设备(1)允许在至少50×50×50μm、100×100×100μm、150×150×150μm、200×200×200μm、250×250×250μm、300×300×300μm、350×350×350μm、400×400×400μm、450×450×450μm或500×500×500μm，最尤其在至少500×500×500μm的区域，和在至少50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μm的深度，最尤其至少500μm的深度进行上述方法。这基于下述事实：光学传感器设备(1)包括至少一个激发纤维(4)，其配置为激发位于这些深度和/或这些区域中的该细胞中包括的细胞或分子，例如NADH和/或FAD，和至少一个发射纤维(5)，其配置为检测位于这些深度和/或这些区域中的该细胞中包括的细胞或分子例如NADH和/或FAD发射的所有信号。与其对照，现有技术仅仅允许例如使用荧光阅读器探测在单层细胞培养物中的荧光细胞或荧光分子，例如活性荧光染料。
因此，光学传感器设备(1)优选地包括至少一个光激发纤维(4)，例如至少1、2、3、4、5或更多个光激发纤维(4)，和至少一个发光纤维(5)，例如至少1、2、3、4、5或更多个发光纤维(5)。优选的包括一个光激发纤维(4)和一个发光纤维(5)的光学传感器设备(1)显示在图1A中。
术语“光激发纤维(4)”，如本文所使用，指配置为接收激发光，尤其是从光源，和/或提供至少一部分激发光至光学样品的纤维。术语“发光纤维(5)”，如本文所使用，指配置为接收来自光学样品的光和/或将其提供至光探测剂的纤维。
进一步优选的是至少一个光激发纤维(4)是紫外(UV)光激发纤维、VIS光激发纤维、NIR光激发纤维、UV/VIS光激发纤维、UV/NIR光激发纤维、VIS/NIR光激发纤维或UV/VIS/NIR光激发纤维。术语“UV光激发纤维”，如本文所使用，指配置为接收UV光，尤其从光源比如从激光器或发光二极管(LED)，并且提供至少一部分UV光至光学样品的纤维。UV光是波长比可见光短但是比X射线长的电磁辐射，范围介于大约10nm至400nm之间，能量从3eV至124eV。UV光激发纤维更优选地配置为接收并且提供波长在大约320和350nm之间，甚至更优选地大约320和340nm之间和最优选地在337nm，例如在320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350nm的光，所述波长是适于激活NADH的波长。各光源优选地是激光器，更优选地氮激光器(337nm，30Hz)，或发光二极管(LED)。在另一实施方式中，UV光激发纤维更优选地配置为接收和提供波长在大约300和380nm之间，甚至更优选地在大约330和360nm之间和最优选地在330nm，例如在300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375或380nm的光，和/或UV光激发纤维更优选地配置为接收并且提供波长在大约430和480nm之间，甚至更优选地在大约440和460nm之间，和最优选地在450nm，例如在430。435。440。445。450。455。460。465。470。475或480nm的光，其是适于激活FAD的波长。各光源优选地是激光器，更优选地是氮激光器或发光二极管(LED)。UV光激发纤维最优选地配置为接收并且提供波长在大约320和350nm之间例如在337nm的光，其是适于激活NADH的波长，以及接受和提供波长在大约300和380nm之间例如在330nm和/或波长在大约430和480之间例如在450nm的光，其是适于激活FAD的波长。关于优选的光源，参考上面。
术语“VIS光激发纤维”指配置为接收、尤其从光源接收VIS光谱范围的激发光并且提供至少一部分激发光至光学样品的纤维。
术语“NIR光激发纤维”指配置为接收、尤其从光源接收NIR光谱范围的激发光并且提供至少一部分激发光至光学样品的纤维。
术语“UV/VIS光激发纤维”指配置为接收、尤其从光源接收UV和VIS光谱范围的激发光并且提供至少一部分激发光至光学样品的纤维。
术语“UV/NIR光激发纤维”指配置为接收、尤其从光源接收UV和NIR光谱范围的激发光并且提供至少一部分激发光至光学样品的纤维。
术语“VIS/NIR光激发纤维”指配置为接收、尤其从光源接收VIS和NIR光谱范围的激发光并且提供至少一部分激发光至光学样品的纤维。
术语“UV/VIS/NIR光激发纤维”指配置为接收、尤其从光源接收UV、VIS和NIR光谱范围的激发光并且提供至少一部分激发光至光学样品的纤维。
另外或可选地，也优选的是至少一个发光纤维(5)选自
(i)NADH发射纤维(6)，
(ii)FAD发射纤维(7)，
(iii)荧光发射纤维(8)，和
(iv)红外发射纤维(9)。
优选的光学传感器设备(1)包括光激发纤维(4)、NADH发射纤维(6)、FAD发射纤维(7)、荧光发射纤维(8)和红外发射纤维(9)，显示在图1B中。
更优选地，光学传感器设备(1)包括
(i)NADH发射纤维(6)和FAD发射纤维(7)，
(ii)NADH发射纤维(6)和荧光发射纤维(8)，
(iii)NADH发射纤维(6)红外发射纤维(9)，
(iv)FAD发射纤维(7)和荧光发射纤维(8)，
(v)FAD发射纤维(7)和红外发射纤维(9)
(vi)荧光发射纤维(8)和红外发射纤维(9)，
(vi)NADH发射纤维(6)、FAD发射纤维(7)和荧光发射纤维(8)，
(vii)NADH发射纤维(6)、荧光发射纤维(8)和红外发射纤维(9)，
(viii)NADH发射纤维(6)、FAD发射纤维(7)和红外发射纤维(9)，
(ix)NADH发射纤维(6)、FAD发射纤维(7)和红外发射纤维(9)，
(x)FAD发射纤维(7)、荧光发射纤维(8)和红外发射纤维(9)，和
(xi)NADH发射纤维(6)、FAD发射纤维(7)、荧光发射纤维(8)和红外发射纤维(9)。
光学传感器设备(1)最优选地是包括光激发纤维(4)、NADH发射纤维(6)和FAD发射纤维(7)的至少一个的组合设备。
术语“NADH发射纤维(6)”，如本文所使用，指配置为接收来自光学样品的NADH光(或NADH自发荧光)和将其提供至光探测剂的纤维。NADH发射纤维(6)更优选地配置为接收和提供波长在大约400和490nm之间，甚至更优选地在大约420和460nm之间，和最优选地在450nm或460nm，例如在400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485或490nm的光(或自发荧光)。如上面已经提到，NADH可在大约320和350nm之间的波长例如在337nm被激活，NADH的自发荧光可在大约400和490nm之间的波长例如在450或460nm测量。
术语“FAD发射纤维(7)”，如本文所使用，指配置为接收来自光学样品的FAD光(或FAD自发荧光)和将其提供至光探测剂的纤维。FAD发射纤维(7)更优选地配置为接收并且提供波长在大约500和560nm之间，甚至更优选地在大约520和540nm之间和最优选地在520或530nm，例如在500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550或560nm的光(或自发荧光)。如上面已经提到(见本发明的第一方面)，FAD可在大约300和380nm之间的波长或在大约430和480nm之间的波长激活并且FAD的自发荧光可在大约500和560nm之间的波长例如在520或530nm测量。
术语“荧光发射纤维(8)”，如本文所使用，指配置为接收来自光学样品的荧光和将其提供至光探测剂的纤维。荧光是已经吸收光或其他电磁辐射的光学样品发射的光。其是发光的形式。在大部分情况下，发射的光比吸收的辐射具有更长的波长，并且因此具有更低的能量。发射光谱主要是254nm的短波紫外线，伴随着436nm(蓝色)、546nm(绿色)和579nm(橙黄色)的可见光。荧光发射纤维(8)更优选地配置为接收在500和620nm之间波长、优选地在517或602nm波长的光。
术语“红外(IR)发射纤维(9)”，如本文所使用，指配置为接收来自光学样品的红外(IR)光和将其提供至光探测剂的纤维。红外(IR)光是比可见光的具有更长波长的电磁辐射，从在0.74微米(μm)的可见光谱名义上红光边缘扩展至300μm。该范围的波长对应于约1至400THz的频率范围，并且包括大部分由接近室温的物体发射的热辐射。IR发射纤维(9)最优选地配置为接收接近IR光谱的光。
光源优选地是激光器或发光二极管(LED)。更优选地，激光器是氮激光器、氩激光器或TiSa激光器。
光探测剂优选地是分光计，更优选地是UV分光计、VIS分光计、NIR分光计、UV/VIS分光计、UV/NIR分光计、VIS/NIR分光计或UV/VIS/NIR分光计，最优选地是UV/VIS/NIR分光计。
光学样品优选地是三维细胞培养物***(2)，尤其是其一部分，例如至少一个微流体通道、至少一个流体储器，例如培养基和/或血液储器，三维细胞培养物***(2)中包括的至少一个生长区域(3)或其至少一部分。至少生长区域(3)优选地包括细胞聚集、组织、类器官或器官。
进一步优选的是至少一个光激发纤维(4)和至少一个发光纤维(5)具有圆形或正方形形状。使用具有正方形形状的光激发纤维(一个或多个)(4)和发光纤维(一个或多个)(5)的优势在于可实现光学传感器设备(1)的在不变周长下的更高纤维密度。
优选地或可选地，进一步优选的是圆形光激发纤维比圆形发光纤维具有更小的直径，和/或正方形光激发纤维比正方形发光纤维具有更小的边长。这样的优势在于全面探测发射信号是可能的。因此，数据的传递更精确。
光学传感器设备(1)包括的(发射和/或激发)纤维优选地平行排列。再次，这样的优势在于其增加光学传感器设备(1)的包装密度。
优选地或可选地，也优选的是将纤维涂布隔离层(10)，优选地铝或环氧树脂胶隔离层，或将纤维之间的空间填充隔离材料(11)，优选地环氧树脂胶隔离材料。
包括光激发纤维(4)、NADH发射纤维(6)、FAD发射纤维(7)、荧光发射纤维(8)和红外发射纤维(9)——其中每个纤维涂布了隔离层(10)——的优选光学传感器设备(1)显示在图1C中。
此外，包括光激发纤维(4)、NADH发射纤维(6)、FAD发射纤维(7)、荧光发射纤维(8)和红外发射纤维(9)——其中纤维之间的空间填充隔离材料(11)——的优选光学传感器设备(1)显示在图1D中。
在优选的实施方式中，光学设备(1)包括在用于自动操作包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)的装置(12)中。
优选地，装置(12)包括载体平台(13)，其配置为接收至少一个三维细胞培养物***(2)，更优选地1至500个，甚至更优选地25至200个，和最优选地25至150个三维细胞培养物***(2)，例如至少1、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多个三维细胞培养物***(2)，其包括至少一个生长区域(3)，更优选地1至2000个生长区域(3)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、30、36、48、60、72、84、96、100、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240或更多个生长区域(3)。在优选的微量滴定板样规格中，2、4、6、24、96、384或甚至1536个生长区域(3)以2:3矩形矩阵排列在三维细胞培养物***(2)上。
优选地，载体平台(13)包括至少一个开孔，更优选地1至500个，甚至更优选地25至200个，和最优选地25至150个开孔，例如至少1、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多个开孔，和/或至少一个安装元件，更优选地1至500个，甚至更优选地25至200个，和最优选地25至150个安装元件，例如至少1、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多个安装元件，其配置为接收至少一个三维细胞培养物***(2)。
关于术语“三维细胞培养物***(2)”和“生长区域(3)”的定义和关于“三维细胞培养物***(2)”和“生长区域(3)”的优选实施方式，参考本发明的第一方面。尤其优选地，至少一个三维细胞培养物***(2)，尤其是至少一个三维细胞培养物***(2)的主体，由透明材料例如由玻璃比如碳酸钙/碳酸氢钠玻璃或石英玻璃或塑料制造。这允许非接触和非侵入观察至少一个三维细胞培养物***(2)，尤其用光学传感器设备(1)。尤其，其允许从外部分析至少一个三维细胞培养物***(2)。
载体平台(13)优选地是可调温的。这允许容易调整至少一个三维细胞培养物***(2)的培养温度，这可通过载体平台(13)实现。培养温度优选地是37℃。
优选地，载体平台(13)——其尤其包括配置为接收至少一个三维细胞培养物***(2)的至少一个安装元件——也由透明材料优选地玻璃、更优选地碳酸钙/碳酸氢钠玻璃或石英玻璃、或塑料制造。载体平台(13)使用透明材料利于观察和/或分析至少一个三维细胞培养物(2)***，这可通过载体平台(13)用光学传感器设备(1)实现。
优选地载体平台(13)包括配置为接收至少一个三维细胞培养物***(2)的第一表面(14)和与第一表面(14)相对放置的第二表面(15)。尤其优选地，光学传感器设备(1)位于载体平台(13)的第二表面(15)上或第一表面(14)上。
优选地，装置(12)进一步包括功能单元(16)。尤其优选地，功能单元(16)位于载体平台(13)的第一表面(14)或第二表面(15)上。
更尤其优选地，功能单元(16)位于与光学传感器设备(1)不同的表面上。最优选地，光学传感器设备(1)位于载体平台(13)的第二表面(15)上，而功能单元(16)位于载体平台(13)的第一表面(14)上。
功能单元(16)优选地配置为允许装载、交换和/或施加材料。优选地，功能单元(16)包括注入***(17)、排出***(18)或其组合(17/18)。注入***(17)配置为允许提供/施加材料，例如流体供应比如培养基或血液供应，施加物质比如养分，施加测试物质或活细胞荧光染料，例如经作为三维细胞培养物***(2)一部分的注入端口，和/或排出***(18)配置为允许材料移除，例如流体移除比如培养基或血液移除，例如经作为三维细胞培养物***(2)一部分的排出端口。在优选的实施方式中，注入和/或排出***(17/18)是移液管(例如多通道移液管)。优选地，三维细胞培养物***(2)包括允许注入以及排出材料、例如移除/交换流体比如培养基和/或血液的端口。
在优选的实施方式中，装置(12)包括至少一个、优选2个或3个把持元件例如单桥(一个或多个)(26)和/或双桥(一个或多个)(23)和/或底板(basis plate)(22)。优选地至少一个、优选2个或3个把持元件例如单桥(一个或多个)(26)和/或双桥(一个或多个)(23)与底板(22)连接。
优选地，光学传感器设备(1)布置在这个把持元件上。功能单元(16)也可布置在这个把持元件上。尤其优选地，光学传感器设备(1)和功能单元(16)布置在这种把持元件上。
更优选地，光学传感器设备(1)布置在单桥(26)或双桥(23)上。功能单元(16)也可布置在单桥(26)或双桥(23)上。单桥(26)优选地包括(第一)天桥元件(27)。尤其优选地，光学传感器设备(1)位于单桥(26)的(第一)天桥元件(27)。功能单元(16)也可位于单桥(26)的(第一)天桥元件(27)。优选地，光学传感器设备(1)和功能单元(16)布置在不同单桥(26)上。在该情况下，光学传感器设备(1)和功能单元(16)优选地彼此相对坐落。
双桥(23)优选地包括第一天桥元件(24)和第二天桥元件(25)。光学传感器设备(1)可位于第一天桥元件(24)或第二天桥元件(25)。功能单元(16)也可位于第一天桥元件(24)或第二天桥元件(25)。更优选地，光学传感器设备(1)和功能单元(16)布置在双桥(23)上。最优选地，光学传感器设备(1)位于双桥(23)的第二天桥元件(25)。所述双桥(23)优选地进一步包括功能单元(16)，其位于第一天桥元件(24)。
上述双桥(23)的第一天桥元件(24)尤其位于载体平台(13)的第一表面(14)上和双桥(23)的第二天桥元件(25)尤其位于载体平台(13)的第二表面(15)上。
此外，上述单桥(26)的(第一)天桥元件(27)可位于载体平台(13)的第一表面(14)或载体平台(13)的第二表面(15)上。
进一步优选的是载体平台(13)连接至少一个、优选2个或3个把持元件，例如单桥(一个或多个)(26)和/或双桥(一个或多个)(23)。
在优选的实施方式中，包括光学传感器设备(1)的装置(12)包含至少一个、优选地2个或3个可移动把持元件，例如可移动单桥(一个或多个)(26)和/或可移动双桥(一个或多个)(23)。优选地，所述至少一个、优选2个或3个把持元件例如单桥(一个或多个)(26)和/或双桥(一个或多个)(23)沿着底板(22)和/或载体平台(13)的纵轴是可移动的。更优选地，光学传感器设备(1)位于可移动双桥(23)的第二天桥元件(25)。所述可移动双桥(23)优选地进一步包括位于第一天桥元件(24)的功能单元(16)。载体平台(13)和底板(22)优选地平行布置。
在进一步优选的实施方式中，光学传感器设备(1)可沿着载体平台(13)和/或底板(22)的纵轴和/或横轴移动。功能单元(16)也可沿着载体平台(13)和/或底板(22)的纵轴和/或横轴可移动。
在另一优选的实施方式中，光学传感器设备(1)朝着载体平台(13)是可移动的。优选地，布置在双桥(23)的第二天桥元件(25)上的光学设备(1)朝着载体平台(13)是可移动的。更优选地，所述光学传感器设备(1)中包括的至少一个光激发纤维(4)和至少一个发光纤维(5)朝着载体平台(13)是可移动的或光激发纤维束和发光纤维(19)朝着载体平台(13)是可移动的。最优选地，布置在双桥(23)的第二天桥元件(25)上的所述光学传感器设备(1)中包括的至少一个光激发纤维(4)和至少一个发光纤维(5)朝着载体平台(13)是可移动的。功能单元(16)也可朝着载体平台(13)是可移动的。布置在双桥(23)的第一天桥元件(24)上的功能单元(16)朝着载体平台(13)是可移动的。更优选地，所述功能单元(16)中包括的注入***(17)、排出***(18)或其组合(17/18)朝着载体平台(13)是可移动的。最优选地，布置在双桥(23)的第一天桥元件(24)上的所述功能单元(16)中包括的注入***(17)、排出***(18)或其组合(17/18)朝着载体平台(13)是可移动的。光学传感器设备(1)和载体平台(13)之间距离等于0至1mm之间，优选地0至500μm之间，更优选地0μm。
装置(12)的载体平台(13)优选地进一步配置为接收培养基样品(20)和/或测试化合物样品(21)，例如为至少一个三维细胞培养物***(2)，尤其经功能单元(16)例如注入***(17)，供应培养基，和/或为至少一个三维细胞培养物***(2)，尤其经功能单元(16)例如注入***(17)，施加测试化合物。
如上述的装置(12)中本发明光学传感器设备(1)的优选布置显示在图2中。
在第三方面中，本发明涉及根据第二方面的光学传感器设备(1)测定和/或监测包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)中的至少一个条件、优选地两个或三个条件的用途，其中至少一个条件、优选地两个或三个条件选自
(i)生理学条件，
(ii)活力，和
(iii)代谢状态，
其中使用红细胞作为所述条件的探测剂测定生理学条件，通过测量活细胞荧光染料测定和/或监测活力，和通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比，测定和/或监测代谢状态。关于测定或监测上面提到的包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)中的至少一个条件、优选地至少两个或三个条件，参考如在本发明的第一方面背景下描述的限定和优选的实施方式。
在第四方面中，本发明涉及根据第二方面的光学传感器设备(1)用于监测测试化合物的作用和/或测定效力、副作用、生物安全性、代谢物、作用模式或器官再生的用途。关于术语“测试化合物”的定义和关于“测试化合物”的优选实施方式，参考本发明的第一方面。
在另一方面中，本发明涉及光学传感器设备(1)，其包括至少一个光激发纤维(4)，例如至少1、2、3、4、5或更多个光激发纤维(4)，和至少一个发光纤维(5)，例如至少1、2、3、4、5或更多个发光纤维(5)。优选地，至少一个发光纤维(5)选自
(i)NADH发射纤维(6)，
(ii)FAD发射纤维(7)，
(iii)荧光发射纤维(8)，和
(iv)红外发射纤维(9)。
所述光学传感器设备(1)优选地配置为根据本发明的第一方面进行测定和/或监测包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)的至少一个条件的所述方法，其中至少一个条件选自
(i)生理学条件，
(ii)活力，和
(iii)代谢状态，
其中使用红细胞作为所述条件的探测剂测定生理学条件，通过测量活细胞荧光染料测定和/或监测活力，和通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比，测定和/或监测代谢状态。
关于术语“光激发纤维(4)”、“发光纤维(5)”、“NADH发射纤维(6)”、“FAD发射纤维(7)”、“荧光发射纤维(8)”和“红外发射纤维(9)”的定义和关于光学传感器设备(1)的其他优选实施方式，参考本发明的第二方面。关于优选地利用光学传感器设备(1)进行的方法和关于在该背景下使用的具体定义，参考本发明的第一方面。
在进一步的方面中，本发明涉及用于自动建立和/或操作三维细胞培养物***(2)的装置(12)，其包括
(i)载体平台(13)，其配置为接收包括至少一个生长区域(3)的至少一个三维细胞培养物***(2)，
(ii)至少一个功能单元(16)，
(iii)至少一个光学传感器设备(1)，
(iv)至少一个把持元件(例如1、2或3个把持元件)，优选地至少一个双桥(23)或至少两个单桥(26)，和
(v)底板(22)，
其中至少一个把持元件，优选地至少一个双桥(23)或至少两个单桥(26)，与底板(22)连接，至少一个功能单元(16)和/或至少一个光学传感器设备(1)布置在至少一个把持元件上，优选地在至少一个双桥(23)或至少两个单桥(26)上(例如至少一个功能单元(16)布置在单桥(26)上和至少一个光学传感器设备(1)布置在另一单桥(26)上)，以及至少一个功能单元(16)和至少一个光学传感器设备(1)彼此相对坐落。
装置(12)中至少一个功能单元(16)和至少一个光学传感器设备(1)的该具体布置的优势在于其允许同时(i)经功能单元(16)，为至少一个三维细胞培养物***(2)供应材料，例如流体比如培养基和/或血液，物质比如养分，测试物质和/或化学品比如活细胞荧光染料，和(ii)经光学传感器设备(1)监测至少一个三维细胞培养物***(2)。
优选地，载体平台(13)包括至少一个开孔，更优选地1至500个，甚至更优选地25至200个，和最优选地25至150个开孔，例如至少1、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多个开孔，和/或至少一个安装元件，更优选地1至500个，甚至更优选地25至200个，和最优选地25至150个安装元件，例如至少1、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多个安装元件，其配置为接收三维细胞培养物***(2)。
关于术语“三维细胞培养物***(2)”和“生长区域(3)”的定义和关于“三维细胞培养物***(2)”和“生长区域(3)”的优选实施方式，参考本发明的第一方面。尤其优选地，至少一个三维细胞培养物***(2)，尤其是至少一个三维细胞培养物***(2)的主体，由透明材料例如由玻璃比如碳酸钙/碳酸氢钠玻璃或石英玻璃或塑料制造。这允许非接触和非侵入式观察至少一个三维细胞培养物***(2)，尤其用光学传感器设备(1)。尤其，其允许从外部分析至少一个三维细胞培养物***(2)。
载体平台(13)优选地是可调温的。这允许容易调整至少一个三维细胞培养物***(2)的培养温度，这可通过载体平台(13)实现。培养温度优选地是37℃。
优选地载体平台(13)——其尤其包括配置为接收至少一个三维细胞培养物***(2)的至少一个安装元件——也由透明材料、优选地玻璃、更优选地碳酸钙/碳酸氢钠玻璃或石英玻璃、或塑料制造。载体平台(13)使用透明材料利于从外部观察和/或分析可通过载体平台(13)接收的至少一个三维细胞培养物(2)***，尤其用光学传感器设备(1)。
载体平台(13)优选地包括配置为接收至少一个三维细胞培养物***(2)的第一表面(14)和与第一表面(14)相对放置的第二表面(15)。至少一个功能单元(16)可位于载体平台(13)的第一表面(14)或第二表面(15)上。尤其优选地，至少一个功能单元(16)位于载体平台(13)的第一表面(14)。至少一个光学传感器设备(1)可位于载体平台(13)的第二表面(15)或第一表面(14)上。尤其优选地，至少一个光学传感器设备(1)位于载体平台(13)的第二表面(15)上。尤其更优选地，至少一个功能单元(16)位于载体平台(13)的第一表面(14)并且至少一个光学传感器设备(1)位于载体平台(13)的第二表面(15)上。至少一个功能单元(16)优选地配置为允许装载、交换和/或施用材料。优选地，至少一个功能单元(16)包括注入***(17)、排出***(18)或其组合(17/18)。注入***(17)配置为允许提供/施用材料，例如流体供应比如培养基或血液供应，施用物质比如养分，施用测试物质或活细胞荧光染料，例如经三维细胞培养物***(2)一部分的注入端口，和/或排出***(18)配置为允许材料移除，例如流体移除比如培养基或血液移除，例如经三维细胞培养物***(2)一部分的排出端口。在优选的实施方式中，注入和/或排出***(17/18)是移液管(例如多通道移液管)。优选地，三维细胞培养物***(2)包括允许注入以及排出材料例如移除/交换流体比如培养基和/或血液的端口。
优选地至少一个光学传感器设备(1)配置为允许非接触、非侵入监测至少一个三维细胞培养物***(2)。
优选地，载体平台(13)连接至至少一个把持元件，例如1、2或3个把持元件，和/或底板(22)连接至至少一个把持元件，例如1、2或3个把持元件。
优选地至少一个功能单元(16)或至少一个光学传感器设备(1)布置在单桥(26)上。例如，至少一个功能单元(16)布置在单桥(26)上和至少一个光学传感器设备(1)布置在另一单桥(26)上，前提是至少一个功能单元(16)和至少一个光学传感器设备(1)彼此相对坐落。
也优选地，至少一个功能单元(16)或至少一个光学传感器设备(1)布置在双桥(23)上。例如，至少一个功能单元(16)布置在双桥(23)上和至少一个光学传感器设备(1)布置在另一双桥(23)上，前提是至少一个功能单元(16)和至少一个光学传感器设备(1)彼此相对坐落。
更优选地，至少一个功能单元(16)和至少一个光学传感器设备(1)布置在双桥(23)上。
尤其优选地，单桥(26)包括(第一)天桥元件(27)。功能单元(16)可位于单桥(26)的(第一)天桥元件(27)上和/或光学传感器设备(1)可位于单桥(26)的(第一)天桥元件(27)上。例如，至少一个功能单元(16)位于单桥(26)的(第一)天桥元件(27)上和至少一个光学传感器设备(1)位于另一单桥(26)的(第一)天桥元件(27)上，前提是至少一个功能单元(16)和至少一个光学传感器设备(1)彼此相对坐落。尤其更优选地，双桥(23)包括第一天桥元件(24)和第二天桥元件(25)。功能单元(16)可位于第一天桥元件(24)上和光学传感器设备(1)可位于双桥(23)的第二天桥元件(25)上，或功能单元(16)可位于第二天桥元件(25)上和光学传感器设备(1)可位于双桥(23)的第一天桥元件(24)上。尤其最优选地，至少一个功能单元(16)位于第一天桥元件(24)上和光学传感器设备(1)位于双桥(23)的第二天桥元件(25)上。
上述双桥(23)的第一天桥元件(24)尤其位于载体平台(13)的第一表面(14)上和双桥(23)的第二天桥元件(25)尤其位于载体平台(13)的第二表面(15)上。
此外，上述单桥(26)的(第一)天桥元件(27)可位于载体平台(13)的第一表面(14)上或位于载体平台(13)的第二表面(15)上。
进一步优选的是载体平台(13)和底板(22)平行布置。进一步尤其优选地至少一个功能单元(16)和/或至少一个光学传感器设备(1)相对于彼此是可移动的。这允许单独或共同引导至少一个三维细胞培养物***(2)，例如为了经功能单元(16)改变三维细胞培养物***(2)中的流体，例如培养基和/或血液，经功能单元(16)为三维细胞培养物***(2)供应测试化合物和经光学传感器设备(1)监测测试化合物对三维细胞培养物***(2)的作用，尤其在培养期间的相同时间点。
尤其优选地，载体平台(13)沿着底板(22)和/或把持元件例如双桥(23)或单桥(26)的纵轴是可移动的。也尤其优选地，功能单元(16)和/或光学传感器设备(1)沿着载体平台(13)的横轴是可移动的。进一步尤其优选地光学传感器设备(1)朝着载体平台(13)是可移动的和/或功能单元(16)朝着载体平台(13)是可移动的。更尤其优选地，光学传感器设备(1)中包括的光激发纤维束和发光纤维(19)朝着载体平台(13)是可移动的和/或功能单元(16)中包括的注入/排出***(17/18)的组合朝着载体平台(13)是可移动的。如上提到，光学传感器设备(1)允许非接触和非侵入式监测至少一个三维细胞培养物。因此，所述光学传感器设备(1)可靠近至少一个三维细胞培养物***(2)但是从不***或引入所述***。优选地，光学传感器设备(1)和载体平台(13)之间的距离等于0至1mm之间，优选地0至500μm之间，更优选地0μm。
装置(12)优选地进一步配备至少一个控制单元，其允许以自动方式操作所述装置(12)。这种装置允许自动建立和/或操作至少一个三维细胞培养物***(2)，更优选地1至500个，甚至更优选地25至200个，和最优选地25至150个三维细胞培养物***(2)，例如至少1、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多个三维细胞培养物***(2)。相比手动操作三维细胞培养物***(2)，自动建立和/或操作三维细胞培养物***(2)是经济的以及节约时间的。
自动建立三维细胞培养物***(2)优选地包括下述步骤：(i)将细胞比如内皮细胞，尤其经装置(12)的至少一个功能单元(16)，接种进入三维细胞培养物***(2)，尤其经所述***的注入端口，和/或(ii)温育三维细胞培养物***(2)，至少直到细胞培养物、组织培养物或类器官已经在三维细胞培养物***(2)中形成。任选地，自动建立测试***(11)进一步包括下述步骤：将全血或培养基，尤其经装置(12)的至少一个功能单元(16)，注入三维细胞培养物***(2)，尤其经所述***的注入端口。
自动操作三维细胞培养物***(2)优选地包括下述步骤：流体交换，例如血液和/或培养基交换，尤其经装置(12)的至少一个功能单元(16)，进行标准化的毒性测试，即测试以研究一个或多个测试物质对至少一个三维细胞培养物***(2)的毒性作用，例如将测试化合物，尤其经注入端口，施加至三维细胞培养物***(2)，和进行根据本发明的第一方面的方法，尤其经装置(12)的光学传感器设备(1)。
装置(12)的载体平台(13)优选地进一步配置为接收培养基样品(20)和/或测试化合物样品(21)，例如为至少一个三维细胞培养物***(2)，尤其经功能单元(16)例如注入***(17)，供应培养基，和/或为至少一个三维细胞培养物***(2)，尤其经功能单元(16)例如注入***(17)，施加测试化合物。
包括光学传感器设备(1)的本发明的用于自动建立和/或操作三维细胞培养物***(2)的优选的装置(12)显示在图2中。
参考数字列表
(1) 光学传感器设备
(2) 三维细胞培养物***
(3) 生长区域
(4) 光激发纤维
(5) 发光纤维
(6) NADH发射纤维
(7) FAD发射纤维
(8) 荧光发射纤维
(9) 红外发射纤维
(10) 隔离层
(11) 隔离材料
(12) 装置
(13) 载体平台
(14) 载体平台的第一表面
(15) 载体平台的第二表面
(16) 功能单元
(17) 注入***
(18) 排出***
(19) 光激发纤维束和发光纤维
(20) 培养基样品
(21) 测试化合物样品
(22) 底板
(23) 双桥
(24) 第一天桥元件
(25) 第二天桥元件
(26) 单桥
(27) 天桥元件
附图说明
图1：光学传感器设备(1)的横截面。(A)包括一个光激发纤维(4)和一个发光纤维(5)的光学传感器设备(1)的横截面；(B)包括光激发纤维(4)、NADH发射纤维(6)、FAD发射纤维(7)、荧光发射纤维(8)和红外发射纤维(9)的光学传感器设备(1)的横截面；(C)包括光激发纤维(4)、NADH发射纤维(6)、FAD发射纤维(7)、荧光发射纤维(8)和红外发射纤维(9)的光学传感器设备(1)的横截面，其中每个纤维涂布隔离层(10)；和(D)包括光激发纤维(4)、NADH发射纤维(6)、FAD发射纤维(7)、荧光发射纤维(8)和红外发射纤维(9)的光学传感器设备(1)的横截面，其中纤维之间的空间填充隔离材料(11)。
图2：显示自动建立和/或操作三维细胞培养物***(2)的装置(12)的图，其包括(i)携带包括一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)的载体平台(13)，(ii)包括注入/排出***(17/18)组合的一个功能单元(16)，(iii)具有光激发纤维束和发光纤维(19)的一个光学传感器设备(1)，(iv)一个双桥(23)和两个单桥(26)以及(v)底板(22)，其中一个双桥(23)和两个单桥(26)连接底板(22)，包括注入/排出***(17/18)组合的一个功能单元(16)和/或一个光学传感器设备(1)在双桥(23)上彼此相对布置。载体平台(13)是可调温的并且由透明材料制造。三维细胞培养物***(2)也由透明材料制造。载体平台(13)包括携带三维细胞培养物***(2)的第一表面(14)和与第一表面(14)相对放置的第二表面(15)。双桥(23)包括第一天桥元件(24)和第二天桥元件(25)。所述双桥(23)的第一天桥元件(24)位于载体平台(13)的第一表面(14)上和双桥(23)的第二天桥元件(25)位于载体平台(13)的第二表面(15)上。包括注入/排出***(17/18)的组合的一个功能单元(16)位于第一天桥元件(24)上和光学传感器设备(1)位于双桥(23)的第二天桥元件(25)上。两个单桥(26)包括天桥元件(27)。单桥(26)的所述天桥元件(27)位于载体平台(13)的第一表面(14)上。载体平台(13)进一步连接至一个双桥(23)和两个单桥(26)。装置(12)的载体平台(13)进一步携带培养基样品(20)和测试化合物样品(21)，例如经功能单元(16)的注入***(17)为三维细胞培养物***(2)供应培养基，和/或经功能单元(16)的注入***(17)为三维细胞培养物***(2)供应一个或多个测试化合物。载体平台(13)和底板(22)平行布置。载体平台(13)沿着底板(22)的纵轴是可移动的。包括注入/排出***(17/18)的组合的一个功能单元(16)和一个光学传感器设备(1)相对于彼此是可移动的。这允许单独或共同引导三维细胞培养物***(2)，例如为了经功能单元(16)的注入***(17)改变三维细胞培养物***(2)中的流体，例如培养基和/或血液，经功能单元(16)的注入***(17)为三维细胞培养物***(2)供应一个或多个测试化合物和经光学传感器设备(1)监测一个或多个测试化合物对三维细胞培养物***(2)的作用，尤其在培养期间的相同时间点。光学传感器设备(1)沿着载体平台(13)的横轴是可移动的以及包括注入/排出***(17/18)的组合的功能单元(16)沿着载体平台(13)的横轴是可移动的。光学传感器设备(1)中包括的光激发纤维束和发光纤维(19)进一步朝着载体平台(13)是可移动的以及功能单元(16)中包括的注入/排出***(17/18)的组合朝着载体平台(13)是可移动的。光学传感器设备(1)允许非接触和非侵入式监测由透明材料制造的三维细胞培养物，其由也是由透明材料制造的载体平台(13)携带。所述光学传感器设备(1)可靠近三维细胞培养物***(2)但是从不***或引入所述***中。光学传感器设备(1)和载体平台(13)之间距离可对于0和1mm之间或0和500μm之间。附图中白色双箭头表示上述移动方向。
实施例简述
实验1：
使用下述实验在多器官芯片(MOC)中评估不同的细胞聚集、类器官或器官的NADH自发荧光。所以，将制作MOC并且安装在载体中。将冲洗MOC并且填充培养基。其后，不同浓度的不同细胞类型放置在MOC上生长区域内。在连续培养期间，所述不同细胞类型将发育成不同的细胞聚集、类器官或器官。这种MOC的制作描述在例如WO 2009/146911 A2中(具体见第3页第6至20行，第37页，第1页至第38页第2行，和第38页第24行至第39页第15行，以及权利要求33和38至42)或WO 2012/016711 A1(具体见第3页第14至21行，第15页第1行至第16页第14行，第19页第10至33行，第20页第5至23行和第22页第1行至第23页第8行以及权利要求18至20)。为了测量所述MOC中的NADH自发荧光，将使用包括激发纤维和发射纤维的光学传感器设备。激发纤维连接至光源(例如激光器或LED)，其在337nm发光。激发纤维接收所述光并且将其提供至MOC中包括的不同的细胞聚集、类器官或器官。NADH可在337nm的波长激活。发射纤维接收不同的细胞聚集、类器官或器官中的NADH的自发荧光并且将其提供至光探测器(例如分光计)。探测器评估NADH在450nm波长的发射。发射纤维连接至MOC的底部载玻片。光学传感器设备用于在芯片内337nm下激发NADH自发荧光并且检测在450nm波长的NADH发射。潜在的带通滤光片可能用于纯化探测的发射。将在静态培养和在注入的MOC中测量信号。在实验中，也将使用数个不同的纤维和探测器。
实验2：
下述实验将用于在多器官芯片(MOC)中评估不同的细胞聚集、类器官或器官的FAD自发荧光。所以，将制作MOC并且安装在载体中。将冲洗MOC并且填充培养基。其后，不同浓度的不同细胞类型放置在MOC上生长区域内。在连续培养期间，所述不同细胞类型将发育成不同的细胞聚集、类器官或器官。这种MOC的制作描述在例如WO 2009/146911 A2中(具体见第3页第6至20行，第37页，第1页至第38页第2行，和第38页第24行至第39页第15行，以及权利要求33和38至42)或WO 2012/016711 A1(具体见第3页第14至21行，第15页第1行至第16页第14行，第19页第10至33行，第20页第5至23行，和第22页第1行至第23页第8行以及权利要求18至20)。为了测量所述MOC中的FAD自发荧光，将使用包括激发纤维和发射纤维的光学传感器设备。激发纤维连接至450nm下发光的光源(例如激光器或LED)。激发纤维接收所述光并且将其提供至MOC中包括的不同的细胞聚集、类器官或器官。FAD可在450nm波长激活。发射纤维接收不同的细胞聚集、类器官或器官的FAD的自发荧光并且将其提供至光探测器(例如分光计)。探测器评估FAD在520nm波长的发射。发射纤维连接至MOC的底部载玻片。光学传感器设备用于在芯片中激发在450nm的FAD自发荧光并且检测在520nm波长的FAD发射。潜在的带通滤光片可能用于纯化探测的发射。将在静态培养和在注入的MOC中测量信号。在实验中，也将使用数个不同的纤维和探测器。
实验3：
为了获得关于生长区域中器官培养的耗氧的更多细节，将测量红细胞的血红蛋白饱和度。基于血红蛋白饱和度，将测定耗氧。所以，如上述将制作MOC并且放置在载体中。代替细胞培养基，芯片将被填充人血并且灌注。其后，在芯片上的生长区之前和之后测量血红蛋白饱和度。这两个点/位置之间，培养基必须灌注填充了类器官、器官或细胞聚集等的生长区域。在红外光源和探测器的帮助下，可测量血红蛋白饱和度。基于在不同点/位置的血红蛋白饱和度，计算耗氧。血红蛋白饱和度可能的下降最可能是由于生长区域中氧消耗。消耗的氧的量进一步与细胞代谢活性相关。

Claims (39)

1.测定和/或监测包括至少一个生长区域(3)的三维细胞培养物***(2)的/中至少一个条件的方法，其中所述至少一个条件包括生理学条件并且进一步包括选自下述的条件：
(i)活力，和
(ii)代谢状态，
其中红细胞用作测定所述三维细胞培养物***(2)中流速、生理学重量摩尔渗透压浓度和/或耗氧的探测剂，通过测量活细胞荧光染料测定和/或监测所述活力，和通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比，测定和/或监测所述代谢状态。
2.权利要求1所述的方法，其中使用红细胞作为探测剂测定所述三维细胞培养物***(2)中所述流速的方法包括下述步骤：
(i)提供包括至少一个生长区域(3)的可灌注的三维细胞培养物***(2)，
(ii)至少在两个不同的时间点为所述细胞培养物***中的红细胞拍照，
(iii)选择至少一个红细胞并且测定所述至少一个红细胞在所述至少两个照片中的位置，
(iv)为所述至少一个红细胞分派运动矢量，其代表在所述至少两个照片上所述至少一个红细胞的位置变化，和
(v)基于所述运动矢量测定所述细胞培养物***中的所述流速。
3.权利要求2所述的方法，其中包含红细胞的全血、血浆或培养基灌注所述三维细胞培养物***(2)。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中使用红细胞作为探测剂测定所述三维细胞培养物***(2)中所述生理学重量摩尔渗透压浓度的方法包括下述步骤：
(i)提供包括至少一个生长区域(3)的所述三维细胞培养物***(2)，和
(ii)在培养所述细胞培养物***期间的时间点测定所述细胞培养物***中的至少一个红细胞的形状。
5.权利要求4所述的方法，其中所述至少一个红细胞的球形形状指示所述生理学重量摩尔渗透压浓度下降。
6.权利要求4所述的方法，其中所述至少一个红细胞的圆齿状形状指示生理学重量摩尔渗透压浓度升高。
7.权利要求4所述的方法，其中所述至少一个红细胞的两面凹的形状指示生理学重量摩尔渗透压浓度稳定。
8.权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述三维细胞培养物***(2)是可灌注的。
9.权利要求8所述的方法，其中包含红细胞的全血、血浆或培养基灌注所述三维细胞培养物***(2)。
10.权利要求1至3、5至7和9中任一项所述的方法，其中使用红细胞作为探测剂测定所述三维细胞培养物***(2)中所述耗氧的方法包括下述步骤：
(i)提供包括至少一个生长区域(3)的所述三维细胞培养物***(2)，
(ii)测定在所述细胞培养物***中的第一位置和第二位置的红细胞的平均血红蛋白饱和度，和
(iii)基于在不同位置的所述平均血红蛋白饱和度计算所述细胞培养物***中的所述耗氧。
11.权利要求10所述的方法，其中所述三维细胞培养物***(2)是可灌注的。
12.权利要求11所述的方法，其中包含红细胞的全血、血浆或培养基灌注所述三维细胞培养物***(2)。
13.权利要求11或12所述的方法，其中在所述至少一个生长区域(3)上游的位置和在所述至少一个生长区域(3)下游的位置测定所述红细胞的平均血红蛋白饱和度。
14.权利要求1所述的方法，其中通过测量活细胞荧光染料测定和/或监测所述三维细胞培养物***(2)的所述活力的方法包括下述步骤：
(i)提供包括装载活细胞荧光染料的至少一个生长区域(3)的所述三维细胞培养物***(2)，和
(iia)在所述细胞培养物***的培养期间在第一时间点和在第二时间点测量所述细胞培养物***的所述至少一个生长区域(3)的至少一部分中的平均荧光强度，并且将在第二时间点的平均荧光强度与在第一时间点的平均荧光强度比较，和/或
(iib)在培养所述细胞培养物***期间的时间点，测量所述细胞培养物***的所述至少一个生长区域(3)的至少一部分中的平均荧光强度，并且将在所述时间点的平均荧光强度与至少一种对照细胞培养物***的平均荧光强度比较。
15.权利要求14所述的方法，其中当与在所述第一时间点的平均荧光强度比较时在所述第二时间点的平均荧光强度的下降指示所述细胞培养物***(2)的活力下降。
16.权利要求14所述的方法，其中当与在所述第一时间点的平均荧光强度比较时在所述第二时间点的平均荧光强度的保持指示所述细胞培养物***(2)的活力维持。
17.权利要求14至16中任一项所述的方法，其中与所述对照细胞培养物***的平均荧光强度相比在所述时间点的平均荧光强度的增加指示所述细胞培养物***(2)是有活力的。
18.权利要求14至16中任一项所述的方法，其中在所述时间点的平均荧光强度与所述对照细胞培养物***的平均荧光强度的相似性指示所述细胞培养物***(2)没有活力。
19.权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述对照细胞培养物***没有装载活细胞荧光染料。
20.权利要求19所述的方法，其中没有装载活细胞荧光染料的所述对照细胞***是三维细胞培养物***。
21.权利要求20所述的方法，其中所述对照细胞培养物***与步骤(i)中提供的三维细胞培养物***相同，但是没有装载活细胞荧光染料。
22.权利要求14至16、20和21中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物***(2)用测试化合物处理，或其中所述细胞培养物***(2)用测试化合物处理和所述对照细胞培养物***没有用测试化合物处理。
23.权利要求22所述的方法，其中没有用所述测试化合物处理的所述对照细胞培养物***是三维细胞培养物***。
24.权利要求23所述的方法，其中所述对照细胞培养物***与步骤(i)中提供的三维细胞培养物***相同，但是没有用所述测试化合物处理。
25.权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述平均荧光强度的测量通过光谱测定法进行。
26.权利要求25所述的方法，其中所述平均荧光强度的测量通过使用荧光计、荧光阅读器或荧光显微镜进行。
27.权利要求1所述的方法，其中通过测量NADH和/或FAD的自发荧光和/或通过测定NADH/NAD+和/或NADH/FAD比测定和/或监测所述三维细胞培养物***(2)的代谢状态的方法包括下述步骤：
(i)提供包括至少一个生长区域(3)的所述三维细胞培养物***(2)，
(ii)激活所述细胞培养物***的所述至少一个生长区域(3)中包括的NADH和/或FAD，和
(iiia)在所述细胞培养物***的培养期间在第一时间点和在第二时间点，测量所述细胞培养物***的至少一个生长区域(3)的至少一部分中的NADH的平均自发荧光强度，测量FAD的平均自发荧光强度，测定所述NADH/NAD+比和/或测定所述NADH/FAD比，和
将在第二时间点的NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、所述NADH/NAD+比和/或所述NADH/FAD比与在第一时间点的NADH的平均荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、所述NADH/NAD+比和/或所述NADH/FAD比相比较，和/或
(iiib)在培养所述细胞培养物***期间的时间点，测量所述细胞培养物***的至少一个生长区域(3)的至少一部分中的NADH的平均自发荧光强度，测量FAD的平均自发荧光强度，测定NADH/NAD+比和/或测定NADH/FAD比，和
将在所述时间点的NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、所述NADH/NAD+比和/或所述NADH/FAD比与对照细胞培养物***的NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比相比较。
28.权利要求27所述的方法，其中当与在所述第一时间点的NADH的平均荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比相比较时，在所述第二时间点的NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比的保持指示所述细胞培养物***(2)的代谢稳定。
29.权利要求27所述的方法，其中
(i)当与在所述第一时间点的NADH的平均荧光强度相比较时，在所述第二时间点的NADH的平均自发荧光强度的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，
(ii)当与在所述第一时间点的NADH/NAD+比相比较时，在所述第二时间点的NADH/NAD+比的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，
(iii)当与在所述第一时间点的NADH/FAD比相比较时，NADH/FAD比在所述第二时间点的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，和/或
(iv)当与在所述第一时间点的FAD的平均荧光强度相比较时，在所述第二时间点FAD的平均自发荧光强度的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加。
30.权利要求27所述的方法，其中
(i)当与在所述第一时间点的NADH的平均荧光强度相比较时，在所述第二时间点的NADH的平均自发荧光强度的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，
(ii)当与在所述第一时间点的NADH/NAD+比相比较时，在所述第二时间点的NADH/NAD+比的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，
(iii)当与在所述第一时间点的NADH/FAD比相比较时，在所述第二时间点的NADH/FAD比的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，和/或
(iv)当与在所述第一时间点的FAD的平均荧光强度相比较时，在所述第二时间点FAD的平均自发荧光强度的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降。
31.权利要求27至30中任一项所述的方法，其中在所述时间点的NADH的平均自发荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比与所述对照细胞培养物***的NADH的平均荧光强度、FAD的平均自发荧光强度、NADH/NAD+比和/或NADH/FAD比的相似性指示所述细胞培养物***(2)的代谢稳定。
32.权利要求27至30中任一项所述的方法，其中
(i)与所述对照细胞培养物***的NADH的平均自发荧光强度相比较，在所述时间点的NADH的平均自发荧光强度的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，
(ii)与所述对照细胞培养物***的NADH/NAD+比相比较在所述时间点的NADH/NAD+比的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，
(iii)与所述对照细胞培养物***的NADH/FAD比相比较，在所述时间点的NADH/FAD比的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加，和/或
(iv)与所述对照细胞培养物***的FAD的平均自发荧光强度相比较，在所述时间点的FAD的平均自发荧光强度的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢增加。
33.权利要求27至30中任一项所述的方法，其中
(i)与对照细胞培养物***的NADH的平均自发荧光强度相比较，在所述时间点的NADH的平均自发荧光强度的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，
(ii)与对照细胞培养物***的NADH/NAD+比相比较，在所述时间点的NADH/NAD+比的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，
(iii)与对照细胞培养物***的NADH/FAD比相比较，在所述时间点的NADH/FAD比的增加指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降，和/或
(iv)与对照细胞培养物***的FAD的平均自发荧光强度相比较，在所述时间点的FAD的平均自发荧光强度的下降指示所述细胞培养物***(2)的代谢下降。
34.权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物***(2)用测试化合物处理，或所述细胞培养物***(2)用测试化合物处理并且所述对照细胞培养物***没有用测试化合物处理。
35.权利要求34所述的方法，其中没有用测试化合物处理的所述对照细胞培养物***是三维细胞培养物***。
36.权利要求35所述的方法，所述对照细胞培养物***与步骤(i)中提供的三维细胞培养物***相同，但是没有用所述测试化合物处理。
37.权利要求27至30和35中任一项所述的方法，其中所述平均自发荧光强度的测量通过光谱测定法进行。
38.权利要求37所述的方法，其中所述平均自发荧光强度的测量通过使用荧光计、荧光阅读器或荧光显微镜进行。
39.权利要求1至3、5至7、11至12、14至16、20、21、23至24、26至30、36和38中任一项所述的方法，其中所述至少一个生长区域(3)包括多层细胞集群、组织、类器官或器官。
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