CN104428308B - 环状大环内酯类化合物的分离方法 - Google Patents

环状大环内酯类化合物的分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种不使用银化合物、即使在同样具有双键的化合物的存在下仍能分离目标环状大环内酯类化合物的方法。本发明是一种将含有环状大环内酯类化合物和一种以上其类似化合物的混合物加到固定有不对称识别剂的硅胶色谱柱上、分离环状大环内酯类化合物的方法。

Description

环状大环内酯类化合物的分离方法
技术领域
本发明涉及作为药品等有用的环状大环内酯类化合物的分离纯化方法。
背景技术
环状大环内酯类化合物中存在大量如红霉素等抗生素、他克莫司等免疫抑制剂等作为药品有用的物质。该环状大环内酯类化合物多从微生物的培养物中提取而来。这种培养物中除了作为目标化合物的环状大环内酯类化合物以外，还含有许多类似物质，因而，已有各种报告提出了仅分离出目标化合物的技术。
例如，作为天然化合物的经典纯化方法，有将受试液加到担载有银的硅胶色谱柱上来分离骨架上具有双键的化合物和不具有双键的化合物的方法(非专利文献1、2等)。
他克莫司及其类似物质中存在侧链骨架中具有双键的成分和不具有双键的成分。因此，已有报告提出将银担载到强酸性离子交换树脂上、通入他克莫司及其类似物质的混合物的液体、分离他克莫司和类似物质的技术(专利文献1)。此外，也有报告提出使混合物吸附到非离子性吸附树脂上、用含银离子的含水溶剂等分离他克莫司和类似物质的技术(专利文献2)。
专利文献：
专利文献1：日本专利第3750527号公报
专利文献2：日本专利第3925198号公报
非专利文献：
非专利文献1：物质的分离与生成(日)，大竹等，第70页(东京大学出版会，1976)
非专利文献2：J.Chromatograph.69,207(1972)
发明内容
然而，上述专利文献记载的技术虽然对侧链上具有双键的化合物和不具有双键的化合物的分离有效，但对与他克莫司同样地在侧链上具有双键的化合物与他克莫司的分离则并不有效。实际上，已知在含有他克莫司的培养物中含有与他克莫司同样地在侧链上具有双键的化合物。此外，由于使用银化合物，因而在后续处理工序中需要进行完全除去银的操作。还需要考虑废液处理等环境方面的问题。
因此，本发明旨在提供一种不使用银化合物、即使在同样具有双键的化合物的存在下仍能分离目标环状大环内酯类化合物的方法。
为此，本发明者以含有他克莫司等环状大环内酯类化合物及其类似化合物的混合物为对象，对各种分离纯化方法进行了研究，结果意外地发现，使用固定有不对称识别剂的硅胶柱色谱，能够高效率地将不是光学异构体的他克莫司与其多个类似化合物分离，制得高纯度的他克莫司，并由此完成了本发明。
即，本发明提供以下〔1〕～〔8〕。
〔1〕环状大环内酯类化合物的分离方法，其特征在于，将含有环状大环内酯类化合物和一种以上其类似化合物的混合物加到固定有不对称识别剂的硅胶色谱柱上，从该混合物中分离环状大环内酯类化合物。
〔2〕根据〔1〕所述的分离方法，其中，环状大环内酯类化合物为他克莫司。
〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的分离方法，其中，环状大环内酯类化合物为他克莫司，其类似化合物为选自子囊霉素、FR－901156和FR－900525中的一种或二种以上。
〔4〕根据〔1〕～〔3〕中任一项所述的分离方法，其中，固定有不对称识别剂的硅胶为固定有氨基甲酸酯修饰的多糖类的硅胶或固定有对映异构体修饰的合成高分子的硅胶。
〔5〕环状大环内酯类化合物的制造方法，其特征在于，将含有环状大环内酯类化合物和一种以上其类似化合物的混合物加到固定有不对称识别剂的硅胶色谱柱上，制造所述类似化合物的合计量小于0.27％的环状大环内酯类化合物。
〔6〕根据〔5〕所述的制造方法，其中，环状大环内酯类化合物为他克莫司。
〔7〕根据〔5〕或〔6〕所述的制造方法，其中，环状大环内酯类化合物为他克莫司，其类似化合物为选自子囊霉素、FR－901156和FR－900525中的一种或二种以上。
〔8〕根据权利要求〔5〕～〔7〕中任一项所述的制造方法，其中，固定有不对称识别剂的硅胶为固定有氨基甲酸酯修饰的多糖类的硅胶或固定有对映异构体修饰的合成高分子的硅胶。
根据本发明的分离方法，能够以良好的收率分离与目标环状大环内酯类化合物的不同点在于侧链上是否具有双键、以及碳数多或少1个或2个等的类似化合物。完全意外的是，虽然使用的色谱柱是本来具有不对称识别剂的色谱柱，但却能够分离碳数略有不同的类似化合物。
附图说明
图1是显示使用实施例1的分离方法的分离状况的图。
图2是显示使用比较例1的分离方法的分离状况的图。
图3是显示使用比较例2的分离方法的分离状况的图。
具体实施方式
本发明是一种用固定有不对称识别剂的硅胶柱色谱从含有环状大环内酯类化合物和一种以上其类似化合物的混合物中分离、纯化目标环状大环内酯类化合物的方法。
作为环状大环内酯类化合物，可以是他克莫司、红霉素类、阿奇霉素、交沙霉素、吉他霉素、雷帕霉素类，优选雷帕霉素和他克莫司，尤其优选他克莫司。
作为环状大环内酯类化合物的类似化合物，可以是在用培养技术制造该环状大环内酯类化合物时培养物中所含的类似化合物。例如，可以是与环状大环内酯类化合物在结构上的不同点在于侧链上是否具有双键、结构中的碳数相差1～2个等的化合物。作为他克莫司的类似化合物，可以列举子囊霉素(FK520)、FR－901156、FR－900525等。他克莫司、子囊霉素、FR－901156和FR－900525的结构如下所示。
〔化学式1〕
作为本发明中使用的含有环状大环内酯类化合物和一种以上其类似化合物的混合物，进一步优选为含有他克莫司和选自子囊霉素、FR－901156及FR－900525中的一种或二种以上的混合物。更具体地，为含有这些混合物的培养液的粗提物。
该混合物优选含有他克莫司60质量％(下面仅称％)以上，更优选含70％以上，进一步优选含80％以上。此外，优选地，他克莫司的含量上限在98％以下，进一步地在95％以下，更进一步地在90％以上。作为该混合物中的他克莫司的具体含量，优选为60～90％，更优选为70～95％，进一步优选为80～98％。此外，优选地，上述类似化合物在混合物中的含量在2％以上，进一步地在4％以上，更进一步地在5％以上。优选地，上述类似化合物在混合物中的含量为2～10％，进一步地为4～10％，更进一步地为5～10％。
作为该混合物，例如可以是他克莫司产生菌的培养物的粗提物。作为他克莫司产生菌，例如可以是日本特公平3－38276号公报中记载的菌，例如属于链霉菌属的他克莫司产生菌、属于筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)的属于Tacrolimustsukubaensis的他克莫司产生菌、筑波链霉菌No.9993。作为粗提物，可以是该公报记载的粗提物。
本发明使用固定有不对称识别剂的硅胶柱作为分离柱。他克莫司和其类似化合物并非光学异构体，而是结构相异的化合物。尽管如此，还是能够高效率地将他克莫司与其类似化合物分离则是出乎意料的。
作为固定有不对称识别剂的硅胶，可以是氨基甲酸酯修饰的多糖类固定剂硅胶、固定有对映异构体的硅胶、固定有对映异构体修饰的合成高分子的硅胶、固定有包接多糖类的硅胶、固定有蛋白的硅胶、固定有冠醚的硅胶、固定有光学活性聚马来酰亚胺的硅胶等。作为氨基甲酸酯修饰的多糖类，可以是氨基甲酸酯修饰的纤维素、氨基甲酸酯修饰的直链淀粉、氨基甲酸酯修饰的琼脂糖、氨基甲酸酯修饰的支链淀粉、氨基甲酸酯修饰的环糊精类等。更具体地，可以是下述式(1)表示的苯基氨基甲酸酯修饰的多糖类，
〔化学式2〕
(式中，R1、R2和R3可相同或不同，表示氢原子、卤原子、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳基或链烷酰基)。
这里，作为烷基，优选为碳数1～6的烷基，作为链烯基和炔基，优选为碳数2～6的链烯基、炔基。作为烷氧基，优选为碳数1～6的烷氧基。作为芳基，优选为苯基。作为链烷酰基，优选为碳数2～6的链烷酰基。
作为对映异构体修饰的合成高分子，可以是对映异构体修饰的聚(甲基)丙烯酸酯及固定有对映异构体修饰的聚(甲基)丙烯酸酯的硅胶等。所述对映异构体为：L－氨基酸、D－氨基酸等氨基酸类；(R)或(S)萘基乙胺、(R)或(S)苯基乙胺等光学活性胺类；L－酒石酸等光学活性有机酸，等等。
本发明的分离方法除了使用上述固定有不对称识别剂的硅胶柱作为色谱柱以外，可以与通常的硅胶柱色谱同样地进行。例如，将含有环状大环内酯类化合物及其类似化合物的混合物的液体通入固定有不对称识别剂的硅胶柱，然后用对该化合物的洗脱有用的洗脱液进行洗脱即可。当为他克莫司时，作为洗脱液，优选使用醇和/或醚类的混合液、乙腈、醇、醚类、水等的混合液。
通过本发明方法得到的他克莫司的纯度优选在99.0％以上，更优选在99.5％以上，进一步优选在99.7％以上。此外，化合物I和化合物II各自的含量优选在0.1％以下，子囊霉素、化合物I和化合物II的类似化合物的合计量优选小于0.27％。
实施例
下面通过给出实施例对本发明进行详细说明。
参考例1
将含有甘油(1％)、玉米淀粉(1％)、葡萄糖(0.5％)、棉籽粉(1％)、玉米浆(0.5％)、干酵母(0.5％)、碳酸钙(0.2％)的培养基(150mL，pH6.5)在120℃下灭菌30分钟。从筑波链霉菌No.9993株((日本)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏编号FERM BP－927)的斜面培养物上取1铂金丝接种环接种到经灭菌的培养基中，在30℃下振荡培养4天。将上述培养物接种到含有可溶性淀粉(4.5％)、玉米浆(1.0％)、干酵母(1％)、碳酸钙(0.1％)、Adekanol(0.1％)的培养基(15L，pH6.8)中，在30℃下培养4天。
向所得液体培养基(broth)中加入活性碳和硅藻土，过滤。将菌丝体混合物用丙酮8L提取，浓缩提取液。向浓缩物中加入氯化钠170g、乙酸乙酯1.7L，搅拌后除去水层。将有机层用氯化钠水溶液清洗后，浓缩乙酸乙酯层。将所得浓缩物加到硅胶色谱柱上，对用乙酸乙酯︰正己烷的混合液(1︰1)和(4︰1)溶出的他克莫司的馏分进行浓缩，得到含有如下成分的混合物：他克莫司、子囊霉素、17－丙基－1,14－二羟基－12－〔2－(4－羟基－3－甲氧基环己基)－1－甲基乙烯基〕－23,25－二甲氧基－13,19,21,27－四甲基－11,28－二氧杂－4－氮杂三环〔22.3.1.04, 9〕二十八－18－烯－2,3,10,16－四酮(下面简称化合物I)、16－烯丙基－1,13－二羟基－11－〔2－(4－羟基－3－甲氧基环己基)－1－甲基乙烯基〕－22,24－二甲氧基－12,18,20,26－四甲基－10,27－二氧杂－4－氮杂三环〔21.3.1.04,8〕二十七－17－烯－2,3,9,15－四酮(下面简称化合物II)。各成分的混合比为他克莫司90.5％、子囊霉素6.4％、化合物I 2.6％、化合物II 0.4％。
优选分离出的活性馏分中所含的子囊霉素、化合物I和化合物II的浓度之和越低越好，实际应用中需要小于0.27％。
实施例1
使用CHIRALPAK(注册商标)IC进行柱色谱分离
将用参考例1中所示的方法得到的含有他克莫司、子囊霉素、化合物I和化合物II的混合物4mg加到CHIRALPAK(注册商标)IC 4mL的色谱柱上，使用正己烷︰2－丙醇︰甲基叔丁基醚的混合液(70︰15︰15)作为洗脱液进行溶出。其中，CHIRALPAK(注册商标)IC是化学键合有不对称识别剂三(3,5－二氯苯基氨基甲酸)纤维素的硅胶。
结果示于图1。通过HPLC分析测定了分离出的活性馏分的纯度。溶出馏分组成中，他克莫司为99.88％，子囊霉素为0.08％，化合物I为0.04％，未检测到化合物II。
实施例2
使用CHIRALPAK(注册商标)IE进行柱色谱分离
与实施例1同样地将他克莫司、子囊霉素、化合物I和化合物II的混合物4mg加到CHIRALPAK(注册商标)IE 4mL的色谱柱上，使用正己烷︰2－丙醇︰甲基叔丁基醚的混合液(45︰15︰40)作为洗脱液进行溶出。其中，CHIRALPAK(注册商标)IE是化学键合有不对称识别剂三(3,5－二氯苯基氨基甲酸)直链淀粉的硅胶。
通过HPLC分析测定了分离出的活性馏分的纯度。溶出馏分组成中，他克莫司为100.00％，子囊霉素、化合物I、化合物II均未检测到。
比较例1
使用DIAION(注册商标)HP20SS和含硝酸银洗脱液进行柱色谱分离
与实施例1同样地将他克莫司、子囊霉素、化合物I和化合物II的混合物200mg加到DIAION(注册商标)HP20SS 20mL的色谱柱上，使用含0.294mol/L硝酸银的50％丙酮水溶液作为洗脱液，然后使用60％丙酮水溶液进行溶出。结果示于图2。通过HPLC分析测定了分离出的活性馏分的纯度。溶出馏分组成中，他克莫司为99.73％，未检测到子囊霉素和化合物I，化合物II为0.27％。
比较例2
使用DIAION(注册商标)RCP 160M离子交换树脂的银盐进行柱色谱分离
在用硝酸银溶液使银离子吸附到DIAION(注册商标)RCP 160M离子交换树脂15.6mL之后，与实施例1同样地加载他克莫司、子囊霉素、化合物I和化合物II的混合物200mg，使用乙酸乙酯︰甲醇的混合液(1︰1)作为洗脱液进行溶出。结果示于图3。通过HPLC分析测定了分离出的活性馏分的纯度。溶出馏分组成中，他克莫司为99.35％，子囊霉素为0.2％，化合物I为0.06％，化合物II为0.4％。
实施例3
使用YMC Chiral NEA(注册商标)(R)进行柱色谱分离
与实施例1同样地将他克莫司、子囊霉素、化合物I和化合物II的混合物1mg加到YMC Chiral NEA(注册商标)(R)2.5mL的色谱柱上，使用35％乙腈(acetonitnitrile)作为洗脱液进行溶出。其中，YMC Chiral NEA(注册商标)(R)是固定有甲基丙烯酸酯聚合物的硅胶，所述甲基丙烯酸酯聚合物键合有不对称识别剂(R)－1－(α－萘基)乙胺。通过HPLC分析测定了分离出的活性馏分的纯度。溶出馏分组成中，他克莫司为99.94％，子囊霉素为0.02％，未检测到化合物I，化合物为0.04％。

Claims (2)

1.环状大环内酯类化合物的分离方法，其特征在于，将含有环状大环内酯类化合物和一种以上其类似化合物的混合物付加于不对称识别剂固定化硅胶柱色谱法，从该混合物中分离出环状大环内酯类化合物，所述环状大环内酯类化合物为他克莫司，
他克莫司的类似化合物为选自子囊霉素、FR－901156和FR－900525中的一种或多种，
不对称识别剂固定化硅胶为氨基甲酸酯修饰多糖类固定化硅胶或对映异构体修饰合成高分子固定化硅胶。
2.环状大环内酯类化合物的制造方法，其特征在于，将含有环状大环内酯类化合物和一种以上其类似化合物的混合物付加于不对称识别剂固定化硅胶柱色谱法，制造所述类似化合物的合计量小于0.27％的环状大环内酯类化合物，所述环状大环内酯类化合物为他克莫司，
他克莫司的类似化合物为选自子囊霉素、FR－901156和FR－900525中的一种或多种，
不对称识别剂固定化硅胶为氨基甲酸酯修饰多糖类固定化硅胶或对映异构体修饰合成高分子固定化硅胶。
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