CN104428010A - 热稳定的纳米颗粒制剂及其相关方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在高温下对纳米颗粒制剂灭菌的方法。将多个纳米颗粒纯化以形成所述制剂，其中所述纳米颗粒至少包含核和壳且所述壳包含连接到所述核的一种或多种配体物质。所述纳米颗粒制剂由纯化的纳米颗粒组合物、载液和过量的未连接到所述核的所述一种或多种配体物质制备。连接到所述核的配体物质与在纯化之后加入的过量配体物质在结构上相同。本发明提供的纳米颗粒制剂可在诸如X射线和磁共振成像的医学成像技术中作为造影剂使用。

Description

热稳定的纳米颗粒制剂及其相关方法
领域
概括地讲，本发明涉及使纳米颗粒制剂稳定化的方法。所述纳米颗粒制剂可用于多种治疗和诊断应用。
背景
纳米颗粒，即其直径以纳米适当度量的颗粒，已经被考虑用于广泛种类的最终用途。具有适当成像性质的纳米颗粒通常基于过渡金属氧化物且用作用于MR和/或X射线成像的造影剂。氧化铁纳米颗粒用于诸如铁替代疗法、磁性颗粒成像(MPI)、药物靶向或基因传递的各种治疗应用中。将用于人类个体的体内应用的含有纳米颗粒组合物的制剂通常需要纯化并灭菌以防止生物污染，且常希望在等渗水性介质中表现出稳健的悬浮稳定性。
存在用于纳米颗粒灭菌的各种方法，包括紫外线照射、环氧乙烷处理、甲醛处理、无菌过滤、γ照射和高压釜灭菌。用于可注射的造影剂的高压釜灭菌被视为最可靠且廉价的灭菌技术之一。
在水性混悬液中的纳米颗粒组合物在使用诸如高压处理的热灭菌技术期间常经历团聚和沉淀。已经尝试通过加入各种表面改性剂来使所述纳米颗粒的表面性质改性以增强所述纳米颗粒的水性混悬液的稳定性。使用浊点改性剂是一种供选的方法，其用以改变纳米颗粒聚集发生的温度，从而能够经由高压釜来灭菌。然而，在一些情况下，浊点改性剂为带电的分子且与构成纳米颗粒的壳的分子不同，并且引入使壳的表面化学以及纳米颗粒的组成改性的危险。
非常需要在不改变纳米颗粒表面化学的情况下使纳米颗粒组合物在高压釜灭菌期间在高温下稳定的方法。包括改进的稳定性、无菌性、增强的安全性和对热灭菌期间的聚集的抗性的纳米颗粒组合物的制剂对于各种应用都是有利的。
发明简述
方法的一个或多个实施方案包括纯化组合物以形成纯化的组合物，其中所述纯化的组合物包含布置在载液中的至少一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含核和连接到所述核的壳，所述壳包含配体物质；将一定量的所述配体物质加到所述纯化的组合物中以形成制剂，其中所加入量的所述配体物质的至少一部分保持未连接到所述核；和对所述制剂灭菌。
方法的另一实施方案包括纯化组合物以形成纯化的组合物，其中所述纯化的组合物包含布置在载液中的至少一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含核和连接到所述核的壳，所述壳包含配体物质且其中所述纯化的组合物没有任何过量的配体物质；将一定量的所述配体物质加到所述纯化的组合物中以形成制剂，其中所加入量的所述配体物质的至少一部分保持未连接到所述核；和通过高压处理对所述制剂灭菌。
附图简述
在参考附图阅读以下详述时，本发明的这些和其他特征、方面和优势将得到更好的理解，在整个附图中，相同的符号表示相同的部分，其中：
图1为根据本发明的一个实施方案说明制造稳定的纳米颗粒制剂的例示性方法的流程图；
图2为根据本发明的一个实施方案说明制造稳定的纳米颗粒制剂的例示性方法的示意流程图，包括核-壳纳米颗粒的理想化横截面视图的构造。
发明详述
在以下说明书中和随后的权利要求中，将提到许多术语，这些术语将定义为具有以下含义。
除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/种”和“所述”包括复数个指代对象。
在整个说明书和权利要求中使用的近似语言可用于修饰任何定量表述，这些表述可获准允许在不造成其相关的基本功能发生变化的条件下进行改变。因此，由诸如“约”的一个或多个术语修饰的值并不局限于所指定的精确值。在一些情况下，近似语言可对应于用于测量所述值的仪器的精密度。
本发明的实施方案包括以下方法，其包括：纯化组合物以形成纯化的组合物，其中所述纯化的组合物包含布置在载液中的至少一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含核和连接到所述核的壳，所述壳包含配体物质。所述纯化后面是将一定量的所述配体物质加到所述纯化的组合物中以形成制剂，其中所加入量的所述配体物质的至少一部分保持未连接到所述核。所述制剂随后经历灭菌。
更具体地讲，在一个或多个实施方案中，方法包括提供至少包含核和壳的至少一种纳米颗粒且所述壳包含连接到所述核的配体物质。将所述纳米颗粒组合物纯化以形成纯化的纳米颗粒组合物，和通过加入一定量的所述配体物质而使用所述纯化的纳米颗粒组合物形成制剂，所述加入可帮助使所述制剂在高压釜灭菌期间在高温下稳定。进行所述纯化以消除在所述组合物中存在的不希望有的外来物质，所述物质例如包括过量的起始材料或任何杂质。所述纯化顺便除去任何过量的配体物质，即存在于所述纳米颗粒组合物中但未连接到所述纳米颗粒核的配体物质。在一个实施例中，纳米颗粒的所述纯化可采用基于分子量截留的过滤，其中滤膜的孔径限制特定分子量的分子穿过该孔。在另一实施例中，纳米颗粒的所述纯化可采用通过离心分离、接着在载液中再悬浮的洗涤。因为配体物质和纳米颗粒组合物(核-壳)的尺寸差，所述纯化促进从所述纳米颗粒组合物中除去过量的配体物质。将过量的所述配体物质加到纯化的纳米颗粒组合物中以形成制剂，接着灭菌。所述制剂的灭菌生成灭菌的制剂。
正如所提到的那样，所述制剂包含纯化的纳米颗粒组合物。在一些实施方案中，所述纳米颗粒组合物至少包含核和壳。所述壳包含配体物质，其中所述配体物质连接到所述核。连接到核的配体物质在本文中可被称为“结合的配体物质”。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒组合物包含核-壳结构，其中所述核包含过渡金属，诸如包含过渡金属氧化物的核。具体实例包括钨、钽、铪、锆、锌、钼、银、铁、锰、铜、钴、镍的氧化物或上述过渡金属氧化物中两种或更多种的组合。在一个实施方案中，所述核包含超顺磁性氧化铁。在一个或多个实施方案中，在所述制剂中的多个纳米颗粒的金属含量在0.5-300mg/mL的范围内。所述核的结构和组成在下文中更具体地参考图2更详细地描述。
在一个或多个实施方案中，所述纳米颗粒壳包含包含结构部分的配体物质，其中所述结构部分包含有机磷酸酯或膦酸酯和一个或多个亲水性基团。在一个实施方案中，所述配体物质包括至少一个磷酸酯或膦酸酯基团和一个或多个包括聚乙烯醚部分、聚丙烯醚部分、聚丁烯醚部分或上述部分的两个或多个的组合的另外基团。在一些实施方案中，所述纳米颗粒壳包含配体物质，所述配体物质包括至少一个磷酸酯基团或膦酸酯基团和一个或多个包括聚乙烯醚部分的亲水性基团。在一些实施方案中，所述壳包含一种或多种配体物质，其中所述配体物质包括磷酸酯、膦酸酯或其组合。所述磷酸酯可包括单磷酸酯、双(磷酸酯)、多磷酸酯或其组合。所述膦酸酯可包括α-羟基膦酸酯、单膦酸酯、双膦酸酯、多膦酸酯或其组合。在一些其他实施方案中，所述配体物质还包含聚(乙二醇) (PEG)官能团。在一些实施方案中，所述壳包括聚(乙二醇) (PEG)官能化的磷酸酯、PEG官能化的单磷酸酯、PEG官能化的α-羟基膦酸酯、PEG官能化的双(磷酸酯)或其组合。PEG为亲水性聚合物，且由PEG官能化的配体物质制成的壳大大增强表面水化，因此增强颗粒的溶解性和体内相容性。所述壳的结构和组成在下文中更具体地参考图2更详细地描述。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括将一定量的配体物质加到所述纯化的组合物中以形成包含未连接到核的过量配体物质的制剂。加到用于制备所述制剂的纯化的纳米颗粒组合物中的配体物质在结构上与在连接到纳米颗粒核的壳中存在的配体物质相同。正如所提到的那样，术语“所加入量的配体物质的至少一部分保持未连接到核”在本文中可与“游离配体物质”或“过量的游离配体物质”互换使用。所述游离配体物质在结构上与结合到纳米颗粒核的配体物质也相同。
在高温下，所述结合的配体物质可从所述核解离，这增强了纳米颗粒聚集的可能性。纳米颗粒的聚集在制剂中存在游离配体物质的情况下降低。在不受理论限制的情况下，据建议从核解离的配体物质可被游离配体物质置换，其中该机制在本文中称为“配体交换”。在制剂中游离配体物质的存在即使在高温下也维持纳米颗粒的核-壳结构的完整性。
在一个或多个实施方案中，在所述制剂中存在的游离配体物质可置换从所述核解离的配体物质，且因为游离的配体物质与结合的配体物质在结构上相同，所以所述纳米颗粒的表面化学保持不变。在一个或多个实施方案中，所述游离配体物质包括聚(乙二醇) (PEG)官能化的单磷酸酯、PEG官能化的α-羟基膦酸酯、PEG官能化的双(磷酸酯)或其组合。在一个实施例中，如果纳米颗粒组合物的结合的配体物质为PEG官能化的α-羟基膦酸酯，则在所述制剂中存在的游离配体物质也是PEG官能化的α-羟基膦酸酯，这保持在灭菌期间所述纳米颗粒的表面性质。游离配体物质的浓度随纳米颗粒在制剂中的浓度的改变而变。在一个或多个实施方案中，加到所述制剂中的游离配体物质的量相对于在所述纳米颗粒核中存在的金属的摩尔数在约0.005-2摩尔配体的范围内。
正如所提到的那样，所述制剂还包含载液。在一个或多个实施方案中，所述载液包括水、乙醇或其组合。所述纳米颗粒的核-壳结构在所述载液中保持稳定，即悬浮，而没有过度聚集。在一个或多个实施方案中，将另外的化合物加到所述载液中可增加所述纳米颗粒制剂的离子强度。在一个或多个实施方案中，所述另外的化合物包括糖，诸如甘露糖醇、右旋糖、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、木糖醇和麦芽糖醇；醇，诸如丙二醇；合成聚合物，诸如未改性的PEG和聚乙烯吡咯烷酮；表面活性剂，诸如Tweens、Cremaphors和Labasols；和任何生理学相容性盐(例如，氯化钠、溴化钠、硫酸钠、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钾、溴化钾、硫酸钾、乙酸钾、碳酸氢钾)或其组合。在一些实施方案中，所述载液可用来制备纳米颗粒混悬液。在一个实施例中，将乙醇用作载液，其中可使所述乙醇在制备所述制剂的最后步骤中蒸发以形成纳米颗粒的水性混悬液。在一个或多个实施方案中，所述载液可作为稀释剂使用。所述载液也可用以优化或改变所述纳米颗粒或过量配体物质在所述制剂中的浓度。在一些实施方案中，在将所述制剂用作造影剂的情况下，所述载液可在包含所述纳米颗粒制剂的可注射介质中使用。在一个或多个实施方案中，所述载液可充当药用赋形剂。当所述制剂作为医药药物载剂使用时，所述流体可作为用于所述药物载剂的介质使用。
在一些实施方案中，所述方法还包括将一定量的流体加到所述载液中。将所述量的流体加到所述组合物中以将金属的浓度调节在规定范围内。所加入量的流体可包括乙醇、水或其组合。在一些其他实施方案中，所述方法还包括加入一定量的药学上可接受的赋形剂，诸如缓冲剂、糖、盐或两种或更多种赋形剂的组合。例如，所述药学上可接受的盐包括氯化钠、溴化钠、硫酸钠、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钾、溴化钾、硫酸钾、乙酸钾、碳酸氢钾。对于一些其他实施例，所述药学上可接受的糖可包括甘露糖醇、右旋糖、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、木糖醇和麦芽糖醇。
正如所提到的那样，在一些实施方案中，所述制剂通过热灭菌来灭菌，其中所述热灭菌可分类为干热灭菌和湿热灭菌。在一个具体的实施方案中，所述制剂通过高压处理热灭菌。
在所述方法的一个或多个实施方案中，所述制剂通过在高温下高压处理灭菌。所述高压釜灭菌可按照关于标准高压釜灭菌方法的规定执行。术语“高温(high temperature)”或“高温(elevated temperature)”在本文中可指适合高压处理的温度，诸如超过100℃。在热灭菌中，所述灭菌取决于培育温度和培育时间。细菌、病毒、真菌或孢子可在典型的134℃下高压处理至少3分钟或在121℃下高压处理至少15分钟而被破坏。在蒸汽或湿热灭菌的一个或多个实施方案中，将所述纳米颗粒制剂在约121℃的温度下灭菌历时至少约15分钟的时间。在一些实施方案中，121℃历时约15分钟的时间的条件通过在接近海平面的海拔下使用处于超过大气压的15磅/平方英寸(psi)的压力下的蒸汽获得。也可执行干热灭菌，虽然用于干热灭菌的温度通常为160℃，历时1-2小时。在所述方法的一个或多个实施方案中，所述制剂通过高压处理灭菌。在一些实施方案中，对于高压处理，将所述温度维持在121℃下，历时15分钟。在一些其他实施方案中，将所述制剂在约256℃的温度下灭菌至少5分钟。
与其中纳米颗粒通常形成聚集体的其他热灭菌方法不同，在本发明的实施方案中，所述纳米颗粒在热灭菌期间抗聚集。在一个或多个实施方案中，所述方法可由于一种或多种过量的游离配体物质与连接到核的一种或多种配体物质交换而防止纳米颗粒在灭菌期间聚集。所述配体物质形成围绕所述纳米颗粒的核的壳以使所述核稳定。
正如所提到的那样，所述方法包括提供包含至少一种纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含核和连接到所述核的壳。随后将所述组合物纯化以形成包含至少一种布置在载液中的纳米颗粒的纯化的组合物。还将一定量的配体物质加到所述纯化的组合物中以形成制剂，接着对所述制剂灭菌。提供稳定的纳米颗粒制剂的方法的一个例示性实施方案参考图1更详细地描述。
特定地讲，图1示出了说明用于制备在高温下稳定的稳定纳米颗粒制剂的例示性方法的流程图。多个核-壳纳米颗粒8通过组合至少一个核和一个壳而形成。通常，所述制备纳米颗粒组合物的方法包括使纳米粒子金属氧化物核与本发明的壳组合物接触，其中所述壳包含配体物质，所述配体物质包括有机磷酸酯或膦酸酯和一个或多个亲水性基团。通常，所述接触在包含至少一种有机溶剂和水的混合物中进行。纳米颗粒的纯化产生纯化的核-壳纳米颗粒10，消除了在核壳前体中存在的任何外来物质、在配体物质交换形成核-壳纳米颗粒之后的任何过量的配体物质或非特异性结合到所述颗粒的其他材料。在一个或多个实施例中，所述纳米颗粒通过基于分子量截留原理的过滤、接着经由离心分离和随后纯化的纳米颗粒在载液中再悬浮而洗涤来纯化。将相同壳材料的过量配体物质和载液加到纯化的纳米颗粒中以形成纳米颗粒制剂12。随后使制剂12经历例如热灭菌。
在所述方法的一些实施方案中，所述稳定的制剂可具有在结合到所述纳米颗粒核上的配体物质与所述游离配体物质之间的平衡。在室温下，所述纳米颗粒组合物可处于平衡中，因此大多数结合的配体物质(壳分子)与纳米颗粒核相互作用，提供充分涂布的核/壳结构并防止纳米颗粒聚集。
正如所提到的那样，在一些实施方案中，在较高温度下灭菌期间，所述结合的配体物质从所述核解离，这使得纳米颗粒的核-壳结构不稳定并增加聚集的可能性。所述结合的配体物质壳与所述纳米颗粒的水性混悬液的水分子处于平衡状态中。配体物质与水分子或与其他配体物质的预期交换速率在较高温度下可能更快。基于理论估算，所述结合的配体物质在高温下可以更快的速率从核解离且在缺乏过量的游离配体物质的情况下，水分子可代替解离的配体物质。具有不足壳覆盖率的纳米颗粒可形成聚集体。基于另一理论假设，向制剂中加入过量的配体物质可以使得结合到核的配体物质在高温下维持核-壳结构的完整性的方式调节该平衡。在一个假设中，在高压釜灭菌(通常121℃)期间向核-壳纳米颗粒的纯化的组合物中加入作为游离配体物质的配体物质引起未结合的配体物质与结合的配体物质的比率更大程度的增加且有助于保证结合到核的配体物质在高温下维持核-壳结构的完整性。
参考图2，一种例示性方法说明在高压釜灭菌期间稳定的纳米颗粒制剂的形成，其中在本文中说明了包含核-壳结构的纳米颗粒的理想化横截面视图。图2详细地图示在例示性方法中采用的一系列步骤的示意图，其中多个核-壳纳米颗粒8通过组合至少核6和壳4而形成。壳4包含连接到核6的配体物质5。纳米颗粒8包含过量的配体物质9和其他杂质2，它们通过纯化而除去，引起形成纯化的纳米颗粒组合物10。所述纳米颗粒组合物包含布置在载液中的至少一种纳米颗粒。在纯化之后，可在有或没有加入一定量的与壳材料相同的配体物质的情况下使纳米颗粒经历高压釜灭菌。如果纯化的纳米颗粒组合物10在缺乏所加入量的配体物质的情况下经历高压釜灭菌，则可发生纳米颗粒16的聚集。另一路径图示将一定量的配体物质18加到纯化的组合物10中以形成纳米颗粒制剂12，其中所加入量的配体物质在结构上与壳材料的配体物质相同。随后使制剂12经历高压釜灭菌以形成稳定的纳米颗粒制剂14，其中制剂14在较高的温度下在高压处理期间抗聚集。
所述核-壳纳米颗粒可用本领域已知的标准程序制备。将核-壳纳米颗粒混悬液洗涤以除去过量的配体物质或非特异性结合到纳米颗粒的其他杂质，接着浓缩纳米颗粒混悬液以便于将来使用。随后将纯化的纳米颗粒组合物用于制备包含所述纯化的纳米颗粒组合物、过量的在结构上与壳材料相同的配体物质和载液的制剂。所述制剂随后经历高压釜灭菌。本发明的实验部分提供制备由本发明提供的纳米颗粒组合物的进一步指导。
本发明的一个或多个实施方案涉及具有在图2中所示的理想化核-壳结构的纳米颗粒组合物10。如在图2中所述，纳米颗粒组合物10包含纳米粒子金属氧化物核6和壳4。在一个实施方案中，本发明提供纳米颗粒组合物，其以形成对于在高温下的热灭菌表现出明显稳定性的水性混悬液的能力为特征。
正如所提到的那样，所述制剂包含成分纳米颗粒，所述纳米颗粒的形状和尺寸可根据制备纳米颗粒的方法而改变。所述纳米颗粒的截面几何形状可不同，这些几何形状包括但不限于球形、棒、管、碎片、纤维、板、线、立方体和须晶。在一个实施方案中，颗粒的截面几何形状可为圆形、椭圆形、三角形、矩形、多边形或不规则形状中的一种或多种。非球形纳米颗粒供选地可具有锥形或长棒形状。在一个实施方案中，所述纳米颗粒的形状为球形。
通常，所述纳米颗粒可具有小于1微米的平均粒度。本文使用的术语“大小”是指纳米颗粒的流体力学直径(DH)，如通过动态光散射测量。在一个实施方案中，由本发明提供的纳米颗粒组合物具有在约2nm-约500nm范围内的DH。在一个供选的实施方案中，由本发明提供的纳米颗粒组合物具有在约10nm-约25nm范围内的DH。在一个实施方案中，由本发明提供的纳米颗粒组合物具有小于50nm的DH。在另一实施方案中，由本发明提供的纳米颗粒组合物具有小于10nm的DH。在又一实施方案中，由本发明提供的纳米颗粒组合物具有小于5nm的DH。小的粒度在例如促进采用纳米颗粒组合物作为造影剂进行医学成像程序之后，自受试者的肾和其他器官清除纳米颗粒组合物方面可为有利的。
在一个或多个实施方案中，所述制剂可包含以诸如晶型或无定形的各种形式的纳米颗粒。在一个实施方案中，在所述制剂中存在的纳米颗粒呈晶型。在一些供选的实施方案中，所述制剂的纳米颗粒以无定形存在。在一些实施方案中，所述制剂可包含作为晶型和无定形两者的混合物的纳米颗粒。
在一个实施方案中，所述制剂包含纳米颗粒的混合物，其中所述纳米颗粒的分布是均质的。例如，所述制剂可包含单一类型的纳米颗粒，其中各个纳米颗粒的形状和尺寸大致相同。在一个供选的实施方案中，所述制剂包含纳米颗粒的混合物，其中所述纳米颗粒的分布是非均质的。在一些其他实施方案中，所述制剂可包含不同类型的纳米颗粒的混合物，其中所述纳米颗粒的尺寸或所述纳米颗粒的形状可不同。
所述纳米颗粒在所述制剂中的相对容易的分散可防止在室温下团聚和/或聚集。聚集体(aggregate)可包含彼此实体接触的多于一个纳米粒子，而团聚体(agglomerate)可包含彼此实体接触的多于一个聚集体。
所述纳米颗粒组合物的金属氧化物核具有以纳米适当量度的尺寸。在各种实施方案中，所述纳米粒子金属氧化物核可作为在稀释剂中的混悬液制备且所述悬浮的纳米粒子金属氧化物核颗粒的流体力学直径可例如通过动态光散射测量。在一个实施方案中，所述纳米粒子金属氧化物核的大小通过透射电子显微镜术(TEM)测量。所述纳米粒子金属氧化物核的直径在约1nm-约100nm范围内。在一个供选的实施方案中，所述纳米粒子金属氧化物核具有约1-30nm的直径。在一个或多个实施方案中，所述纳米粒子金属氧化物核包含纳米粒子超顺磁性氧化铁(SPIO)且具有如通过TEM测量的小于约25nm的直径。
在一个实施方案中，所述核包含过渡金属。在某些实施方案中，所述核包含过渡金属元素的一种或多种衍生物，诸如氧化物、碳化物、硫化物、氮化物、磷化物、硼化物、卤化物、硒化物和碲化物，其含有这些过渡金属元素中的一种或多种。术语“金属”表示含有过渡金属元素作为成分的金属或非金属材料的存在。
如先前所提到的，在一个实施方案中，所述纳米粒子金属氧化物核包含过渡金属氧化物，所述过渡金属氧化物包括钨、钽、铪、锆、锌、钼、银、铁、锰、铜、钴、镍的氧化物或上述过渡金属氧化物的两种或更多种的组合。在一些实施方案中，所述金属氧化物核包含过渡金属，其表现出磁性行为，例如包括超顺磁性行为。在一些实施方案中，所述金属氧化物核包含顺磁性金属，所述顺磁性金属选自铁、锰、铜、钴、镍或其组合。在一个具体的实施方案中，所述金属氧化物核包括超顺磁性氧化铁(SPIO)。在一个实施方案中，所述氧化铁用另一金属掺杂。在一个或多个实施方案中，所述纳米颗粒的核包含超顺磁性氧化铁且所述纳米颗粒具有高达约50nm的粒度。
在一个实施方案中，所述纳米粒子金属氧化物核由单一过渡金属氧化物组成，例如由氧化钽、氧化铪或氧化铁单独组成。在另一实施方案中，所述纳米粒子金属氧化物核包含两种或更多种过渡金属氧化物。因此，在一个实施方案中，所述纳米粒子金属氧化物核包含氧化钽和氧化铪两者，或氧化钽和氧化铁两者。在一个实施方案中，所述纳米粒子金属氧化物核仅包含氧化铁。
通常，所述纳米粒子金属氧化物核包含所述过渡金属氧化物的至少30重量%的过渡金属组分。在所述纳米粒子金属氧化物核中相对较高的过渡金属含量可提供具有相对较高程度的辐射不能透过每单位体积的纳米颗粒组合物，从而作为造影剂赋予更高效的性能。相对较高的过渡金属含量潜在地给出颗粒在诸如计算机断层摄影(CT)的X射线成像应用中作为造影剂的效用。可提供该性质的过渡金属元素的实例包括钨、钽、铪、锆、钼、银和锌。
在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒制剂可用作磁共振(MR)造影剂。对于作为造影剂使用，由本发明提供的纳米颗粒组合物有利地包含顺磁性金属物质，其中包含超顺磁性金属物质的那些组合物具有特别的重要性。潜在的顺磁性和超顺磁性材料的实例包括包含铁、锰、铜、钴、镍或锌中的一种或多种的材料。一个特定有意义的材料组为基于氧化铁的那些材料组，特别是SPIO组，它们通常包含为核重量的约65重量%-约75重量%的铁。在一个实施方案中，所述纳米粒子金属氧化物核包含具有通式[Fe2 +O3]x[Fe2 +O3(M2+O)]1-x的铁化合物，其中1 ≥ x ≥ 0且M2+为金属阳离子，诸如铁、锰、镍、钴、镁、铜、锌的阳离子和所述阳离子的组合。落入该通式范围内的铁化合物的实例包括磁铁矿(Fe3O4)，此时金属阳离子(M2+)为亚铁离子(Fe2+)且x = 0；和磁赤铁矿(γ-Fe2O3)，此时x = 1。
纳米颗粒组合物10包含如在图2中所示完全覆盖纳米粒子金属氧化物核6的壳4。因此，在某些实施方案中，所述纳米颗粒组合物被说成包含基本上覆盖核的壳。术语“基本覆盖”是指，与在其上没有壳的核相比较，壳对核的表面覆盖度百分数大于约20%。本文使用的术语“表面覆盖度百分数”是指被壳覆盖的核表面与未被壳覆盖的核表面的比率。在一些实施方案中，所述纳米颗粒的表面覆盖度百分数可大于约40%。
在一些实施方案中，壳4可促进改善的水溶性、减少聚集体形成、防止纳米颗粒的氧化、保持核-壳实体的均匀性和/或提供给纳米颗粒组合物生物相容性。
壳4的平均厚度通常在约1nm-约50nm范围内。在一个实施方案中，所述壳具有小于50nm的平均厚度。在另一实施方案中，所述壳具有小于8nm的平均厚度。在又一实施方案中，所述壳具有小于5nm的平均厚度。
在一个或多个实施方案中，所述纳米颗粒组合物可包含布置在所述纳米粒子金属氧化物核上的多于一个壳层。通过明智地选择加工条件，可将纳米粒子金属氧化物核物质制备为在稀释剂中的混悬液，并且此后在第一组条件下用一种或多种稳定剂物质处理，以产生包含第一壳的第一纳米颗粒组合物，并且此后将所述第一纳米颗粒组合物在第二组条件下用一种或多种不同的稳定剂物质处理，产生包含所述第一壳和第二壳两者的第二纳米颗粒组合物。
由本发明提供的纳米颗粒组合物并非意欲提出在纳米粒子金属氧化物核与包含配体物质的壳之间的1:1化学计量，而是意欲将纳米颗粒组合物确定为包含纳米粒子金属氧化物核和包含配体物质的壳。所述配体物质包括至少一种结构部分，所述结构部分包含包含一个或多个亲水性基团的有机磷酸酯或膦酸酯基团。正如所提到的那样，包含一个或多个亲水性基团的所述有机磷酸酯或膦酸酯可以完全质子化形式，或以离子化形式。通常，包含一个或多个亲水性基团的多个有机磷酸酯或膦酸酯可与指定纳米粒子金属氧化物核颗粒的表面结合。在一些实施方案中，所述配体物质经由氢键与所述纳米粒子金属氧化物核结合。在一些实施方案中，所述配体物质经由至少一个共价键与所述纳米粒子金属氧化物核结合。在其他实施方案中，所述配体物质可经由离子键与所述纳米粒子金属氧化物核结合。
正如所提到的那样，所述纳米颗粒包含包含有机磷酸酯或膦酸酯和一个或多个亲水性基团的配体物质。所述一个或多个亲水性基团选自聚乙烯醚部分。聚乙烯醚部分定义为包含氧乙烯基氧结构单元-OCH2CH2O-和/或被取代的氧乙烯基氧结构单元的部分。为了方便起见且因为与术语聚乙二醇(PEG)的紧密结构相关性，这样的部分在本文中有时可称为PEG基团或PEG部分，且通过基团分子量表征(moiety molecular weight)。类似地，聚丙烯醚部分定义为包含氧丙烯基氧结构单元-OCH2CH2CH2O-和/或被取代的氧丙烯基氧结构单元的部分。为了方便起见，聚丙烯醚部分在本文中有时可称为聚丙二醇基团或部分。类似地，聚丁烯醚部分定义为包含氧丁烯基氧结构单元-OCH2CH2CH2CH2O-和/或被取代的氧丁烯基氧结构单元的部分。为了方便起见，聚丁烯醚部分在本文中有时可称为聚四氢呋喃部分。
在一些实施方案中，所述壳包含包含一个磷酸酯基团、在本文中供选地称为单磷酸酯的配体物质。在一个或多个实施方案中，所述磷酸酯连接到PEG部分，其中PEG的分子量可为350、440、750、2000或5000道尔顿。相应地，所述配体物质在本文中称为mPP350，其中mPP350表示与PEG 350连接的单磷酸酯。更具体地讲，mPP350定义为具有约350g/m的分子量的PEG分子，其中一个末端羟基甲氧基化且另一末端羟基转化成磷酸单酯。类似地，mPP440、mPP750、mPP2000或mPP5000也可用于纳米颗粒制剂。
在其中所述壳包含包含至少两个磷酸酯基团的配体物质的实施方案中，这两个磷酸酯基团可占据彼此构成1,2、1,3、1,4、1,5或1,6空间关系的位置。这至少两个磷酸酯基团的1,2空间关系包括其为以下的实施方案：1,2-双磷酸酯、2,3-双磷酸酯、3,4-双磷酸酯、4,5-双磷酸酯、5,6-双磷酸酯等。本领域普通技术人员应完全理解该原理延伸至这至少两个磷酸酯基团的1,3、1,4、1,5和1,6空间关系。如在本文使用，纳米颗粒组合物包含这样的配体，名称“1,2-BPP350”是指包含以1,2空间关系构造的两个磷酸酯基团和具有350道尔顿的基团分子量的聚乙烯醚部分的结构部分。类似地，名称“1,2-BPP440”是指包含以1,2空间关系构造的两个磷酸酯基团和具有440道尔顿的基团分子量的聚乙烯醚部分的配体物质。
在一个或多个实施方案中，所述壳包含配体物质，其中所述配体物质包括单膦酸酯、双膦酸酯或α-羟基磷酸酯。在一个实施方案中，所述纳米颗粒壳包含膦酸酯和作为亲水性部分的PEG，其产生作为PEG官能化的膦酸酯的配体物质。在一些实施方案中，所述纳米颗粒壳包含α-羟基膦酸酯和经由带有所述α-羟基的碳原子连接的亲水性部分。在一个或多个实施方案中，所述α-羟基膦酸酯连接到PEG部分，其中PEG的分子量可为350、440、750、2000、5000、10000或30000道尔顿。相应地，所述配体物质在本文中称为α-HmPP350，其中α-HmPP350表示与PEG 350连接的α-羟基膦酸酯。类似地，α-HmPP440、α-HmPP750、α-HmPP2000、α-HmPP5000、α-HmPP10000或α-HmPP30000也可用于纳米颗粒制剂。考虑用于人类受试者的体内治疗的纳米颗粒，在α-羟基膦酸酯与亲水性部分之间的连接可为烃，其使在这样处理的纳米颗粒与人类组织之间的任何相互作用的可能性减至最小。
正如所提到的那样，所述配体物质包括包括聚乙烯醚部分的一个或多个亲水性基团。已经发现所述配体物质在使所述纳米粒子金属氧化物核(和总体上所述纳米颗粒组合物)稳定化方面的功效取决于其结构。在各种实施方案中，所述配体物质在使所述纳米粒子金属氧化物核稳定化方面的功效取决于亲水性部分的大小，该大小在本文中有时可用亲水性基团的基团分子量描述。
通常，所述配体物质的结构可定制成在使特定的纳米粒子金属氧化物核稳定化方面有效，且在所述配体物质中存在的亲水性基团可具有相对较低的基团分子量(例如，小于100g/mol)，或相对较高的基团分子量(例如，超过10,000g/mol)。因为所述亲水性基团包含一个或多个聚乙烯醚部分，所以这些部分的大小和分子量(在本文中有时称为基团分子量)总体上为所述亲水性基团的基团分子量做贡献。在一个实施方案中，所述亲水性基团包括具有在约750道尔顿-约20,000道尔顿范围内的基团分子量的聚乙烯醚部分。在一个供选的实施方案中，所述亲水性基团包括具有约2000道尔顿的基团分子量的聚乙烯醚部分。在又一个实施方案中，所述亲水性基团包括具有少于20,000道尔顿的基团分子量的聚乙烯醚部分。在还一个实施方案中，所述亲水性基团包括具有少于2000道尔顿的基团分子量的聚乙烯醚部分。在再一个实施方案中，所述亲水性基团包括具有少于350道尔顿的基团分子量的聚乙烯醚部分。本文使用的“道尔顿”和“g/mol”在其用于亲水性基团的基团分子量或聚乙烯醚部分和这样部分的被取代的变体的基团分子量时作为可互换的术语使用，并且表示在1摩尔含有其的配体物质中存在的基团或部分以克计的重量。
在一个或多个实施方案中，所述纳米颗粒组合物的配体物质在某些实施方案中可包含含有亲水性基团的基团，外加在聚亚烷基醚部分中见到的醚键(-O-)。因此，除了醚基之外的广泛种类的官能团还可存在于所述配体物质中，例如酯基、胺基、酰胺基、氨基甲酸酯基、脲基、碳酸酯基、硫醚基、硒醚基、硅氧烷基、亚磺酰基、磺酰基和上述基团中两个或多个的组合。在一些实施方案中，所述官能团本身可为所述亲水性基团的组分或者可构成没有确定为亲水性基团的配体物质的一部分。所述纳米颗粒组合物的预定最终用途可能影响这样的官能团的选择。
所述纳米颗粒组合物的预定最终用途可能影响在所述配体物质中使用的亲水性基团的选择。例如，在纳米颗粒组合物在体内、特别地在人类受试者中使用时，可能需要避免可与诸如蛋白质的组织组分强烈结合的亲水性基团。对于体内用途，诸如聚亚烷基醚的基本没有净电荷的亲水性基团具有特别的重要性。另外，对于在人类受试者中使用，特别需要容许纳米颗粒组合物对于安全性评价容易地且可再现地表征的亲水性基团。由本发明提供的纳米颗粒组合物通常具有在约-40mV至+40mV范围内的ζ电位。
正如所提到的那样，由本发明提供的纳米颗粒组合物通常包含过渡金属氧化物核和由布置在载液中的配体物质构成的壳。在所述纳米颗粒组合物中，壳与核的比率可通过元素分析确定。自金属氧化物纳米颗粒的化学组成和它们在用配体物质处理之前的平均粒度的知识，可计算每纳米粒子金属氧化物核颗粒的配体物质的量。在一个实施方案中，本发明提供包含纳米粒子氧化铁核和包含配体物质的壳的纳米颗粒组合物，其中配体物质与铁的摩尔比在约0.01-约0.25范围内。
正如所提到的那样，由本发明提供的纳米颗粒组合物可用作用于诊断成像的造影剂。在这样的应用中，将这些纳米颗粒组合物施用到受试者，在一些实施方案中，施用到哺乳动物受试者，且此后使所述受试者经历成像。由本发明提供的纳米颗粒组合物可特别地用于MR成像，尽管也可发现它们在超声波或放射性示踪剂成像中作为造影剂的效用。另外，由本发明提供的纳米颗粒组合物可用于诸如细胞培养物输注的其他领域。在一些实施方案中，所述纳米颗粒包含一种或多种治疗剂或诊断剂。在一些实施方案中，将灭菌的制剂用作造影剂，或用于治疗应用；实例包括磁共振成像(MRI)、药物传递、基因传递、替代疗法或其他。
在一个实施方案中，本发明提供诊断剂组合物，可将其作为具有恰当的摩尔渗透压浓度和pH的稳定的水性胶状混悬液、作为适合在给予受试者之前稀释的浓缩的水性胶状混悬液，传递到给药位点。在一个供选的实施方案中，本发明提供例如以通过冻干获得的适合重构的粉末剂形式的诊断剂组合物。
在一个实施方案中，本发明提供灭菌的制剂，其可用作适合注射到哺乳动物受试者体内的诊断剂组合物。所述诊断剂组合物包含本发明的纳米颗粒制剂和药学上可接受的载剂或赋形剂。在一个实施方案中，所述赋形剂为所述诊断剂组合物的任选组分。合适的赋形剂非限制性地通过盐、崩解剂、粘合剂、填料和润滑剂中的一种或多种举例说明。在一个实施方案中，所述药学上可接受的载剂可基本上为水。
由本发明提供的诊断剂组合物可通过使本发明的纳米颗粒组合物与药学上可接受的载剂和/或赋形剂接触来制备。
当用于特别是哺乳动物受试者且更特别是人类受试者的诊断成像时，由本发明提供的诊断剂组合物通常作为在药学上可接受的载剂中的混悬剂给予，这种混悬剂可(但是不要求)包含一种或多种赋形剂。如果给予将通过注射、特别是非肠道注射进行，所述载剂通常为已经通过加入约150mM NaCl、5%右旋糖、甘露糖醇或其组合以使得等渗的水性介质。其通常也具有在约7.3和7.4之间的适当(生理) pH。给予可为血管内(IM)、皮下(SQ)或最常见为静脉内(IV)。然而，给予也可经储库植入，其随后向受试者的血液或组织缓慢释放纳米颗粒。或者，给予可通过摄入以用于胃肠道的成像或通过吸入用于肺部和气道的成像。
给予人类受试者、特别是静脉内给予，要求诊断剂组合物在所使用的量下可为无毒的，并且不含任何传染物如细菌和病毒，并且也不含任何热原。因此，在所述诊断剂组合物中存在的纳米颗粒组合物对于必要的纯化程序应该稳定，并且不经受其亲水性的降低或成分纳米颗粒的大小的改变。
该书面描述使用实施例来公开本发明，包括最佳方式，而且使得本领域任何技术人员都能够实践本发明，包括制备和使用任何装置或***和实施任何所结合的方法。本发明的可取得专利权的范围通过权利要求书限定，且可包括本领域技术人员能想到的其他实施例。这样的其他实施例意欲处于权利要求书的范围内，如果它们具有没有与权利要求书的文字语言不同的结构元素，或者如果它们包括与权利要求书的文字语言无实质性差异的等价结构元素。
实验部分
使用本领域已知的程序合成核-壳纳米颗粒并纯化。合成过量的配体物质以便于产生本发明的制剂并在以下实施例中使用。这样的配体物质和核-壳纳米颗粒的制备可见于专利申请公告US 20110104072A1号和专利申请12/968645号中。在本文中描述了合成配体物质如α-羟基PEG-350单(甲基醚)膦酸酯的配体物质的典型方法。在本文中描述了合成具有α-羟基膦酸酯的PEG350、具有α-羟基膦酸酯的PEG5000、具有双膦酸酯的PEG5000和合成用具有α-羟基膦酸酯的PEG5000涂布的纯化的SPIO的实施例。
实施例1：合成过量的配体物质，如PEG350 α-羟基膦酸酯。
合成PEG-350缀合物
合成PEG-350单(甲醚)乙醛：向含有溶解于CH2Cl2 (98mL)中的PEG-350单(甲醚) (3.438g，9.82mmol)的溶液中加入戴斯-马丁高价碘化物(Dess-Martin Periodinane)(5.00g，11.79mmol)且将所产生的溶液在室温下搅拌20小时。在该反应期间，形成细小的白色沉淀物，且在反应的最后通过经由硅藻土垫过滤将其除去。在真空下将溶剂从滤液中除去，留下悬浮在黄色油中的白色固体。将固体用***湿磨，且固体通过经硅藻土垫过滤而除去。在真空下从滤液中除去溶剂，留下为黄色油的产物PEG-350单(甲醚)乙醛(3.42g，100%)。1HnmR (CDCl3) δ 9.73 (t, J = 4 Hz, 1H), 4.16 (d, J = 4 Hz, 2H), 3.65 (m, 24H), 3.38 (s, 3H) ppm. IR (净) 2873, 1732, 1455, 1350, 1109, 1040, 948, 851, 749cm-1。
合成α-羟基PEG-350单(甲醚)膦酸二乙酯：向含有溶解于四氢呋喃(53mL)中的PEG-350单(甲醚)乙醛(3.71g，10.7mmol)的溶液中加入亚磷酸二乙酯(1.77g，12.8mmol)。将溶液冷却到0℃，且加入1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(1.94g，12.8mmol)。在0℃下搅拌10分钟之后，使反应物温至室温并另外搅拌24小时。在真空下除去溶剂以留下暗黄色油，将其经由柱色谱法(100% CH2Cl2至15% MeOH/85% CH2Cl2)纯化以给出3.30g (64%)为黄色油的所要α-羟基PEG-350单(甲醚)膦酸二乙酯产物。1HnmR (CDCl3) δ 4.19 (m, 6H), 3.65 (m, 24H), 3.38 (s, 3H), 1.34 (m, 6H) ppm. 31PnmR (CDCl3) δ 23.1 ppm. IR (净) 3343, 2872, 1725, 1453, 1248, 1105, 965, 850, 791cm-1。
合成α-羟基PEG-350单(甲醚)膦酸：向含有溶解于二氯甲烷(74mL)中的α-羟基PEG-350单(甲醚)膦酸二乙酯(3.61g，7.43mmol)的溶液中加入三甲基甲硅烷基溴(3.41g，22.3mmol)且将所产生的溶液在室温下搅拌2小时。在真空下除去溶剂，以留下褐色油。将所产生的油溶解于丙酮(74mL)和水(0.5mL)中，并将所产生的溶液在室温下搅拌1.5小时。随后在真空下除去溶剂，留下为金色油的所要α-羟基PEG-350单(甲醚)膦酸产物(2.66g，84%)。1HnmR (CDCl3) δ 3.65 (m, 24H), 3.38 (s, 3H). 31PnmR (CDCl3) δ 24.0 ppm. IR (净) 3460, 2870, 1727, 1456, 1351, 945, 849cm-1。
实施例2：合成过量的配体物质，如PEG5000 α-羟基膦酸酯。
合成mPEG5000-环氧化物：将水(4.32mL)悬浮在环氧氯丙烷(84.68mL，1.080mol)中，并加入NaOH (43.20g，1.080mmol)，接着加入三乙铵盐酸盐(1.18g，0.009mol)。将溶液搅拌并加热到70℃，在此期间，随着温度的上升，逐份加入PEG5000单(甲醚) (500g，0.100mol)。将所产生的混悬液在温度下搅拌4小时，且随后冷却到室温。加入水(500mL)，并将产物用CH2Cl2 (2 x 1000mL)萃取。在真空中除去CH2Cl2(并未干燥，而仅成为稠油)，并将所产生的油从THF (400mL)/己烷(200mL)中重结晶(加入THF，加热且随后加入己烷，打漩，直至混浊变澄清，约30秒)，以给出499.93g (理论质量的99%)的为灰白色固体的所要产物：1HnmR (CDCl3) δ 3.81 (m, 2H), 3.64 (m, 422H), 3.46 (m, 2H), 3.38 (s, 3H), 3.17 (m, 1H), 2.79 (m, 1H), 2.61 (m, 1H). 13CnmR (CDCl3) δ 71.97, 71.89, 70.53, 59.00, 50.76, 44.22。
合成mPEG5000-二醇：将mPEG5000-环氧化物(499.93g，98.88mmol)溶解于0.5 M H2SO4 (2000mL)中并在室温下搅拌1.5小时(约30分钟完全溶解材料且另外1小时反应)。随后将反应物用CH2Cl2 (2 x 1000mL)萃取。在真空中除去CH2Cl2(并未干燥，而仅成为稠油)，并将所产生的油从THF/己烷(400mL:200mL)中重结晶(加入THF，加热且随后加入己烷，打漩，直至混浊变澄清，约30秒)，以给出411.88g (理论质量的82%)的为灰白色固体的所要产物：1HnmR (CDCl3) δ 3.75 (m, 2H), 3.57 (m, 422H), 3.39 (m, 2H), 3.31 (s, 3H). 13CnmR (CDCl3) δ 72.88, 71.91, 70.55, 63.93, 59.02。
合成mPEG5000-乙醛：将mPEG5000-二醇(208g，40.99mmol)溶解于水(320mL)中并在室温下搅拌约45分钟。经约30分钟以相等份向该混浊溶液中加入NaIO4 (10.7g，50mmol)在水(90mL)中的预溶解溶液。在最后加入氧化剂之后约1.5-2小时，混浊变澄清。随后将反应物搅拌16小时并通过加入丙二醇(1.20mL)淬灭。随后将水性反应混合物用CH2Cl2 (1 x 1000mL，1 x 500mL)萃取。将有机层合并，且在真空中除去CH2Cl2(并未干燥，而仅成为稠油)。将所产生的金色油从THF/己烷(400mL :200mL)中重结晶(加入THF，加热且随后加入己烷，打漩，直至混浊变澄清，约30秒)，以产生183.77g (理论质量的89%)的为白色固体的所要产物。1HnmR (CDCl3) δ 9.66 (m, 1H), 4.10 (m, 2H), 3.75 (m, 2H), 3.58 (m, 422H), 3.39 (m, 2H), 3.31 (s, 3H). 13CnmR (CDCl3) δ 200.94, 71.90, 71.18, 70.54, 59.01, 53.56。
合成二苄基-αHmPP5000：将mPEG5000-乙醛(181.453g，35.97mmol)溶解于CH2Cl2(850mL)中并加入三乙胺(5.01mL，35.97mmol)，且允许搅拌约30分钟。接着缓慢加入亚磷酸二苄酯(9.43g，35.97mmol)。在室温下搅拌48小时之后，真空除去溶剂(并未干燥，而仅成为稠油)，且将所产生的油从THF/己烷(350mL:175mL)中重结晶(加入THF，加热且随后加入己烷，打漩，直至混浊变澄清，约30秒)，以产生175.59g (理论质量的92%)的为白色固体的所要产物。1HnmR (CDCl3) δ 7.34 (m, 10H), 5.10 (m, 4H), 3.79 (m, 1H), 3.75 (m, 2H), 3.64 (m, 460H), 3.53 (m, 4H), 3.37 (s, 3H). 13CnmR (CDCl3) δ 136.40, 136.27, 128.74, 128.60, 128.43, 127.99, 71.98, 71.17, 70.61, 68.67, 68.13, 64.85, 67.59, 59.08. 31PnmR (CDCl3) δ 23.92。
合成αHmPP5000：将干燥的二苄基-αHmPP5000 (122.80g，23.15mmol)悬浮在无水乙醇(500mL)和水(25mL)中，并缓慢加入10% Pd/碳(4.0g)。随后将反应物在H2气氛(气球压力)下搅拌，直到吸收完成。Pd/C经由硅藻土垫经过滤除去，且在真空下从滤液中除去溶剂(并未干燥，而仅成为稠油)。将所产生的油从THF/己烷(300mL:150mL)中重结晶，以给出109.7g (理论质量的94%)的为白色粉末的所要产物： 1HnmR (CDCl3) δ 3.81 (m, 4H), 3.64 (m, 366H), 3.47 (m, 2H), 3.38 (s, 3H) ppm. 13CnmR (CDCl3) δ 72.00, 71.04, 70.54, 59.11ppm. 31PnmR (CDCl3) δ 22.85ppm。
实施例4：合成PEG5k双磷酸酯(BPP5000)。
合成mPEG5000-1,2-双(磷酸二苄酯)：将二苄基N,N-二异丙基亚磷酰胺(phosphoramidite)(16.34g，97.3mmol)溶解于CH2Cl2 (600mL)中。加入四唑(0.45M，在乙腈中，47.3mmol)，且将所产生的溶液在室温下搅拌30分钟。随后加入溶解于CH2Cl2 (100mL)中的mPEG5000-二醇(60.0g，11.8mmol)，且将所产生的溶液在50℃下搅拌48小时。随后将反应物冷却到室温并将叔丁基过氧化氢(4.26g，47.3mmol)加到反应混合物中。将反应物在室温下搅拌4.5小时且随后用10% (w./v.)的亚硫酸钠溶液(200mL)洗涤。随后将所产生的水层用CH2Cl2 (500mL)萃取。将有机层合并，并真空除去溶剂以给出灰白色固体，将其经柱色谱法(100% CH2Cl2至20% MeOH/80% CH2Cl2)在硅胶上纯化，以给出47.47g (72%)为白色固体的所要产物。1HnmR (CDCl3) δ 7.31(m, 20H), 5.04 (m, 8H), 4.63 (m, 1H), 4.14 (m, 2H), 3.74 (m, 3H), 3.65 (m, 440H), 3.38 (s, 3H) ppm. 31PnmR (CDCl3) δ 0.03,-0.75 ppm。
合成PEG5k双磷酸酯(BPP5000)：将mPEG5000-1,2-双(磷酸双苄酯) (46.46g，8.33mmol)溶解于乙醇(300mL)中。随后加入10% Pd/C (2g)，且将所产生的混悬液在H2 (1大气压)下搅拌48小时。通过经硅藻土垫过滤除去催化剂且从滤液中除去溶剂，留下澄清的油。将该油从2:1 THF/己烷(300mL)中结晶。晶体经真空过滤并用己烷(2 x 50mL)洗涤来收集，以给出40.4g (74%)为白色固体的所要产物。1HnmR (CDCl3) δ 4.71 (m, 1H), 4.20 (m, 2H), 3.65 (m, 440H), 3.38 (s, 3H) ppm. 13CnmR (CDCl3) δ 74.90, 71.70, 70.34, 65.86, 58.81 ppm. 31PnmR (CDCl3) δ 1.18, 0.53 ppm。
实施例5：合成用PEG5000 α-羟基膦酸酯(aHmPP5000)涂布的纯化的SPIO纳米颗粒
将9.177g αHmPP5000配体物质称量到含有磁力搅拌棒的1L依氏烧瓶中。加入8.955mL NaOH溶液(0.2M)以及104mL去离子水和无水EtOH (200mL)。将烧瓶用表面皿覆盖且在磁力搅拌下搅拌，并温和地加热，直至获得澄清的无色溶液。将上述溶液加到具有机械搅拌器、特氟隆锚式搅拌器、热电偶、氮气入口和鼓泡器及回流冷凝器的2L夹套反应器中。将烧瓶用无水EtOH (2 x 25mL)冲洗，并将冲洗液加到反应器中。将澄清的无色溶液在100rpm下搅拌。将330.6mL在苄醇中的氧化铁纳米颗粒核溶液(6.05g Fe/ml)经碱洗、去离子水冲洗、烘干的量筒经漏粉斗加到反应混合物中。将量筒用无水EtOH (2 x 25mL)冲洗，并将冲洗液加到反应器中。观察到单相暗红色-褐色溶液。使搅拌速率增加到200rpm，并塞住反应器且在氮气下在搅拌下在50℃(内部温度)下加热18小时。在加热18小时之后，将反应器冷却到25℃。将EtOAc (660mL)及去离子水(320mL)加到反应器中并***挡板以增强混合。将反应混合物在500rpm下搅拌10分钟。停止搅拌并让各相分离。混浊的混合物在小于10分钟内开始相分离，且在约30分钟之后观察到清晰的相分开。将由247g暗红色-褐色溶液组成的下部水相(含有SPIO颗粒)从反应器中排出到2L 24/40圆底烧瓶中。将溶液用水稀释到800mL(理论上约2.5mg Fe/mL)并短暂地旋转蒸发以除去任何残留的挥发性有机物。随后将溶液无菌过滤(0.22μm)并使用50kDa PES微孔0.1m2膜通过切向流过滤(TFF)纯化。经约3小时且在约10psi下，将产物用24L去离子水洗涤，同时在保留储集器保持2.5L的体积。洗涤一旦完成，则将保留物浓缩到约120g (约16mg Fe/mL)。最后颗粒具有19.2nm的流体力学直径，如在150mM氯化钠溶液中通过动态光散射测量。
实施例6：在有过量配体物质的情况下的高压釜灭菌
将为单钠盐(相对于Fe，0.01-0.25摩尔当量)的配体物质溶解于含有涂有配体物质的SPIO纳米颗粒的水溶液中。加入另外的水以给出具有1-30mg Fe/mL的最后铁浓度的溶液。将所产生的溶液在密封的玻璃容器中使用Tuttnauer 2340EA或Steris SV-148H高压釜在121℃下高压处理15分钟。
实施例7：在有过量配体物质和其他添加剂的情况下的高压釜灭菌
将为单钠盐(相对于Fe，0.01-0.25摩尔当量)的配体物质溶解于含有涂有配体物质的SPIO纳米颗粒的水溶液中。加入另外的水和其他添加剂(EtOH；最后体积为10%或d-甘露糖醇；最后体积为5%)，以给出具有1-30mg Fe/mL的最后铁浓度的溶液。将所产生的溶液在密封的玻璃容器中使用Tuttnauer 2340EA或Steris SV-148H高压釜在121℃下高压处理15分钟。
实施例8：在没有过量的配体物质的情况下的高压釜灭菌
将涂有配体物质的SPIO纳米颗粒用另外的水稀释，以给出具有1-30mg Fe/mL的最后铁浓度的溶液。将所产生的溶液在密封的玻璃容器中使用Tuttnauer 2340EA或Steris SV-148H高压釜在121℃下高压处理15分钟。
实施例9：在具有其他添加剂而没有过量的配体物质的情况下的高压釜灭菌
含有涂有配体物质的SPIO纳米颗粒的水溶液用另外的水和其他添加剂(EtOH；最后体积为10%或d-甘露糖醇；最后体积为5%)稀释，以给出具有1-30mg Fe/mL的最后铁浓度的溶液。将所产生的溶液在密封的玻璃容器中使用Tuttnauer 2340EA或Steris SV-148H高压釜在121℃下高压处理15分钟。
实施例10：通过动态光散射测量SPIO纳米颗粒大小的通用程序
将等分的SPIO溶液(高压釜之前或高压釜之后)在150mM NaCl水溶液中稀释到0.1-0.3mg Fe/mL。使所产生的溶液穿过Whatman Anotop 10 0.2μm针筒过滤器，并将滤液收集在无尘的聚苯乙烯DLS样品池中。大小使用Brookhaven Instruments Inc.的装有90°光散射检测器的ZetaPALS仪测量并记录有效直径。
在表1中提供的数据表明，在存在和不存在过量的配体物质的情况下在高压釜灭菌之前和之后SPIO纳米颗粒的大小。包含α-羟基单磷酸酯配体物质如aHmPP350、aHmPP750、aHmPP2000、aHmPP5000和aHmPP30000的SPIO纳米颗粒在存在过量的配体物质及添加剂的情况下在高压釜灭菌之前和之后表明几乎相同的大小。诸如，在存在过量配体物质的情况下在高压釜灭菌之后，各种纳米颗粒的大小分别为10.9nm、11.2nm、15.3nm、20.8nm和29.2nm，然而在所有这些制剂中在不含过量的配体物质的情况下纳米颗粒都形成具有大于200nm的直径的聚集体。
具有mPP2000和mPP5000的SPIO纳米颗粒在不含任何添加剂的情况下也显示类似的聚集概况。类似地，包含单磷酸酯配体物质如mPP2000的SPIO纳米颗粒在存在过量的配体物质和不存在任何添加剂的情况下在高压釜灭菌之前和之后表明几乎相同的大小，分别为约23.5nm和约24nm，然而在该制剂中在不含过量的配体物质的情况下纳米颗粒形成具有大于200nm的直径的聚集体。
对于包含双磷酸酯配体物质如BPP5000的SPIO纳米颗粒，也发现了类似的观察结果，这说明在存在过量的配体物质和乙醇添加剂的情况下在高压釜灭菌之前和之后几乎相同的大小，分别为约26.4nm和约26.6nm，然而在该制剂中在不含过量的配体物质的情况下纳米颗粒形成具有约47.8nm的直径的颗粒，该直径大于单个纳米颗粒组合物的直径。
表1：在不使用过量的配体物质的情况下在高压处理中纳米颗粒的聚集
虽然在本文中仅说明并描述了本发明的某些特征，但本领域的技术人员将想到许多修改和变化。因此，应理解所附权利要求将涵盖属于本发明的真实精神内的所有这样的修改和变化。

Claims (19)

1.方法，其包括以下步骤：
(a) 纯化组合物以形成纯化的组合物，其中所述纯化的组合物包含布置在载液中的至少一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含核和连接到所述核的壳，所述壳包含配体物质；
(b) 将一定量的所述配体物质加到所述纯化的组合物中以形成制剂，其中所加入量的所述配体物质的至少一部分保持未连接到所述核；和
(c) 对所述制剂灭菌。
2.权利要求1的方法，其中所述壳的配体物质和加到所述纯化的组合物中的所述配体物质在结构上相同。
3.权利要求1或2的方法，其中所述制剂通过热灭菌来灭菌。
4.权利要求1或2的方法，其中所述制剂通过高压处理来灭菌。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述核包含钨、钽、铪、锆、锌、钼、银、铁、锰、铜、钴、镍的氧化物或上述过渡金属氧化物中两种或更多种的组合。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述核包含包括铁、锰、铜、钴、镍的顺磁性金属或其组合。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述核包含超顺磁性氧化铁。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述配体物质包括磷酸酯、膦酸酯或其组合。
9.权利要求8的方法，其中所述磷酸酯配体物质包括单磷酸酯、双(磷酸酯)、多磷酸酯或其组合。
10.权利要求8的方法，其中所述膦酸酯配体物质包括单膦酸酯、α-羟基膦酸酯、双膦酸酯、多膦酸酯或其组合。
11.权利要求8-10中任一项的方法，其中所述配体物质还包含聚(乙二醇) (PEG)官能团。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述配体物质包括聚(乙二醇) (PEG)官能化的磷酸酯、PEG官能化的膦酸酯、PEG官能化的单磷酸酯、PEG官能化的双(磷酸酯)、PEG官能化的α-羟基膦酸酯或其组合。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述配体物质包括PEG官能化的α-羟基膦酸酯。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述纳米颗粒包括包含超顺磁性氧化铁的核和包含PEG官能化的α-羟基膦酸酯的壳。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述纳米颗粒具有在约1nm-100nm范围内的流体力学直径。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中所述载液包括水、乙醇或其组合。
17.前述权利要求中任一项的方法，其还包括向所述载液中加入一定量的流体，其中所述流体包括乙醇、水或其组合。
18.前述权利要求中任一项的方法，其还包括加入包括甘露糖醇、右旋糖、丙二醇、生理学相容性盐的一种或多种化合物或其组合。
19.前述权利要求中任一项的方法，其还包括向所述载液中加入一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述药学上可接受的赋形剂包括药学上可接受盐、药学上可接受的糖部分或其组合。
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