CN104422659B

CN104422659B - 水杨醛吖嗪及其衍生物在蛋白质荧光检测中的应用

Info

Publication number: CN104422659B
Application number: CN201310268922.6A
Authority: CN
Inventors: 丛维涛; 金利泰; 朱忠欣; 洪国赢
Original assignee: WENZHOU UNDERSUN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Zhejiang Eye Spring Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2013-08-29
Filing date: 2013-08-29
Publication date: 2017-09-19
Anticipated expiration: 2033-08-29
Also published as: CN104422659A

Abstract

本发明涉及蛋白质荧光检测技术，具体地说是水杨醛吖嗪(Salicylaldehyde azine)及其衍生物在蛋白质荧光检测中的应用。本发明还提供了应用水杨醛吖嗪进行蛋白质荧光检测的方法，包括步骤：将蛋白质样品电泳后的凝胶在固定液中固定，去离子水冲洗；染色；酸洗；碱液脱色；酸洗；检测。本发明具有灵敏度高、操作简单迅速、重现性好、染色背景好、线性关系好、可逆性好、兼容性好、使用安全、成本低等优点。

Description

水杨醛吖嗪及其衍生物在蛋白质荧光检测中的应用

技术领域

本发明涉及蛋白质荧光检测技术，具体地说涉及蛋白质的一种新的荧光染料。

背景技术

在生命科学研究领域，离不开对生命的基本物质蛋白质和DNA的研究，也就离不开对蛋白质的检测技术。尤其是最近几年，随着基因组学和蛋白质组学的飞速发展，使我们对蛋白质的分离检测技术有了更高的要求。

蛋白质的检测方法有很多，包括浊度法、凯氏定氮法、吸光光度法、荧光光度法，以及新发展起来的共振瑞利散射法、高效液相色谱法、毛细管电泳分析法。荧光光度法是目前研究最多、应用最广、操作较为简便、灵敏度较高的检测方法。

本发明首次将水杨酸吖嗪及其衍生物应用于蛋白质荧光检测，相比于其他荧光检测技术，具有众多优点，在蛋白质组学研究中将具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于建立一种水杨醛吖嗪及其衍生物在蛋白质荧光检测中的应用。

本发明所述的水杨醛吖嗪相关化合物是指以水杨醛吖嗪为母核的钠盐、钾盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、鞣酸盐、氢碘酸盐等。

水杨醛吖嗪母核为：

下面是本发明一个可用的凝胶检测方法，其包括步骤：

1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于固定液中固定10～ 60min，弃固定液，然后用去离子水冲洗1～20min；优选的固定时间为20min，去离子水冲洗时间为5min(共2次)，固定液可以是含有40％乙醇和10％乙酸的水溶液；

2)加入荧光染色液染色1～30min，用酸洗液洗涤1～10min，其中所述染色液为含按摩尔浓度25～50μM的水杨醛吖嗪或其衍生物及按摩尔浓度5～ 15mM氢氧化钠的水溶液，酸洗液为按体积比为0.01～1％的乙酸；染色液中优选的水杨醛吖嗪或其衍生物的浓度为25μM，优选的氢氧化钠浓度为10mM，优选的染色时间为5min，酸洗液中优选的乙酸浓度为0.1％，优选的酸洗时间为 5min；

3)加入碱洗液洗涤5～30min，其中所述碱液为含按重量体积比0.1～1％的硼砂，0.1～2％的碳酸钠；优选的硼砂浓度为0.2％，优选的碳酸钠浓度为0.5％，优选的洗涤时间为20min；

4)加入终止液洗涤5～30min，其中所述终止液为含按重量体积比0.01～ 1％的乙酸；优选的乙酸浓度为0.1％，优选的终止时间为5min；

5)检测，检测波长为250～370nm，优选为312nm。

本发明方法具有如下优点：

1)高灵敏度：荧光染料比普通染料的灵敏度要高很多倍；

2)操作简单迅速：操作步骤少，可在半小时内完成；

3)重现性好：受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；

4)染色背景好；

5)线性关系好：能在较大范围内对蛋白质进行半定量测定；

6)可逆性好：容易脱色；

7)兼容性好：可与MALDI-TOF等质谱仪器高度兼容；

8)使用安全：采用毒性很低的天然荧光染料，提高实验操作的安全性，对环境污染小；

9)成本低。

附图说明

图1.水杨醛吖嗪的化学结构；

图2.水杨醛吖嗪荧光染色法和其他常用染色法灵敏度的比较。其中(A)为水杨醛吖嗪染色法，(B)为EY负染法，(C)为SYPRO-Ruby染色，(D)为戊二醛银染法。蛋白质为商品化标准品，从上至下分别为transferrin(转铁蛋白)，牛血清白蛋白(bovine serumalbumin)，免疫球蛋白(IgG)，卵白蛋白(OVA)，α₁-酸性糖蛋白(α₁-acid glycoprotein)，α-酪蛋白(α-casein)， β-酪蛋白(β-casein)，κ-酪蛋白(κ-casein)，卵白素(avidin)。蛋白质载样量(每条带)如下：带1，100ng；带2，50ng；带3，25ng；带4，12.5ng；带5，6.4ng；带6，3.2ng；带7， 1.6ng；带8，0.8ng；带9，0.4ng；带10，0.2ng；

图3.水杨醛吖嗪荧光染色法和其他常用染色法灵敏度的比较。其中(A)为水杨醛吖嗪染色法，(B)为EY负染法，(C)为SYPRO-Ruby染色，(D)为戊二醛银染法，蛋白质为大肠杆菌全蛋白，蛋白质载样量从左至右(1-10)倍倍稀释。

具体实施方式：

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1水杨醛吖嗪染色

图1是水杨醛吖嗪的化学结构式。水杨醛吖嗪蛋白质荧光染色实验采用下述步骤进行：

1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品(Sigma-Aldrich Co，USA)凝胶置于固定液中 20min，去离子水冲洗两次，每次5min，固定液为体积百分含量40％乙醇，10％乙酸的水溶液；

2)在染色液中染色5min，用0.1％乙酸洗涤5min，染色液为含25μM水杨醛吖嗪及10mM氢氧化钠的水溶液；

3)在碱洗液中洗涤20min，碱洗液为含0.2％硼砂，0.5％碳酸钠的水溶液。

4)在酸液中终止5min，终止液为含0.1％的乙酸水溶液。

5)被染色的凝胶直接放在透射仪上，312nm处透射，记录影像。

按照上述方法分别用水杨醛吖嗪的钠盐、钾盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、鞣酸盐、氢碘酸盐进行蛋白质染色，结果表明用这些衍生物均能得到类似于水杨醛吖嗪的检测结果。SDS-PAGE参照《分子克隆实验指南》第三版相关部分进行。

实验例1水杨醛吖嗪与其他染料染色效果对比

采用不同染料进行染色，(A)为水杨醛吖嗪染色法，(B)为EY负染法，(C)为 SYPRO-Ruby染色，(D)为戊二醛银染法。蛋白质载样量(每条带)如下：带1，100ng；带 2，50ng；带3，25ng；带4，12.5ng；带5，6.4ng；带6，3.2ng；带7，1.6ng；带8，0.8 ng；带9，0.4ng；带10，0.2ng。结果如图2所示，水杨醛吖嗪染色法灵敏度比SYPRO-Ruby 染色，戊二醛银染法高，与EY负染法相近；但是在小分子量区域，水杨醛吖嗪染色法灵敏度比EY负染法高。其中水杨醛吖嗪染色采用实施例1的方法进行，EY负染、SYPRO-Ruby 染色及戊二醛银染法分别按下述方式进行：

EY负染^[1]：

1)将电泳后的凝胶置于固定液(50％乙醇，10％乙酸)中20min；

2)去离子水水洗5min，共2次；

3)将凝胶置于50％的甲醇平衡液中平衡10min；

4)在染色液(0.4％Eosin Y，50％甲醇，1％乙酸)中染色15min，再用去离子水水洗3min；

5)被染色的胶放在透光板上记录影像或直接干胶。

SYPRO Ruby^[2]染色法：

1)将电泳后的凝胶放在SYPRO Ruby染色工作液中染色不少于3小时，再用10％甲醇/7％乙酸溶液冲洗30min；

2)被染色的凝胶直接放在透射仪上，312nm处透射，记录影像。

戊二醛银染法^[3]：

1)将电泳后的凝胶置于固定液(40％乙醇，10％乙酸)中30min；

2)将凝胶置于6.8％乙酸钠，0.125％戊二醛，0.2％硫代硫酸钠的反应液中反应30min；

3)用去离子水水洗5min，共3次；

4)将凝胶置于染色液(0.015％甲醛，0.25％硝酸银，)中染色20min；

5)用去离子水水洗1min，共2次；

6)将凝胶置于显影液(3％碳酸钠，0.007％甲醛)中进行显影；

7)将凝胶置于终止液(1.5％EDTA)中反应10min。

参考文献：

1.Wei-Tao Cong，Sun-Young Hwang，High-throughput negative detectionofSDS-PAGE separated proteins and its application forproteomics.Electrophoresis 2010，31，411-420.

2.Berggren，K.，Chernokalskaya，E.，Steinberg，T.H.，Kemper，C.，Lopez，M.F.，Diwu，Z.，Haugland，R.P.，Patton，W.F.，Electrophoresis 2000，21，2509-2521.

3.Heukeshoven，J.，Dernick，R.，Electrophoresis 1985，6，103-112.

Claims

1.水杨醛吖嗪或水杨醛吖嗪的衍生物作为蛋白质的荧光染料在经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶中的蛋白质的荧光检测中的应用，其中，所述水杨醛吖嗪衍生物是水杨醛吖嗪的钠盐、钾盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、鞣酸盐或氢碘酸盐。

2.权利要求1所述的应用，其中所述荧光检测的步骤为：

1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于固定液中固定10～60min，弃固定液，然后用去离子水冲洗1～20min，一共2次；

2)加入荧光染色液染色1～30min，其中所述染色液为含按摩尔浓度25～50μM的水杨醛吖嗪或水杨醛吖嗪的衍生物及按摩尔浓度5～15mM氢氧化钠的水溶液；

3)加入酸洗液洗涤5～30min，其中所述酸洗液为含按重量体积比0.01～1％的乙酸；

4)加入碱洗液洗涤20～40min，其中所述碱洗液为含按重量体积比0.1～1％的硼砂，0.1～2％的碳酸钠；

5)加入终止液洗涤5～30min，其中所述终止液为含按重量体积比0.01～1％的乙酸；

6)检测。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤1)中蛋白固定时间为20min，然后用去离子水冲洗5min，共2次。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤2)中染色的时间为5min。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤2)染色液中水杨醛吖嗪的浓度按摩尔浓度为25μM，染色液中氢氧化钠浓度为10mM。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)酸洗液中乙酸的重量体积比浓度为0.1％。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤4)碱洗液中硼砂的重量体积比浓度为0.2％，碳酸钠的重量体积比浓度为0.5％。

8.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤4)碱洗时间为20min。

9.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤5)终止液中乙酸的重量体积比浓度为0.1％。