CN104419703A

CN104419703A - 一种高通量快速检测常见致病菌的方法

Info

Publication number: CN104419703A
Application number: CN201310412753.9A
Authority: CN
Inventors: 王慧; 周贤; 李井泉; 韩雪松; 储瑞蔼
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2013-09-11
Publication date: 2015-03-18
Anticipated expiration: 2033-09-11
Also published as: CN104419703B

Abstract

本发明提供了一种高通量快速检测常见致病菌的方法，所述方法包括：采用针对多种致病菌标志性DNA序列的通用引物对对样品进行PCR扩增，从而获得所述致病菌的标志性DNA序列；使得所述致病菌的标志性DNA序列与分别针对所述致病菌标志性DNA序列的特异性捕获探针接触，获得带有不同可检测标记物的杂交产物；检测可检测标记物的信号以确定样品中致病菌的存在或数量。本发明还提供了用于检测致病菌的试剂盒。本发明的方法和试剂盒可准确快速、高通量地检测致病菌，具有易操作、特异性强、灵敏度高等优点，其应用前景广泛。

Description

一种高通量快速检测常见致病菌的方法

技术领域

本发明涉及临床检测、食品检测、公共卫生和细菌学领域。具体而言，本发明涉及一种高通量、快速检测致病菌(优选临床常见致病菌)的新方法。

背景技术

细菌感染性疾病(例如泌尿***感染，如***)严重威胁人类健康且发病率日益提高。常见的致病性细菌可导致多种疾病，例如：由大肠杆菌(E.coli)引起的腹泻、败血症；由金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)引起的化脓感染、食物中毒、肺炎；由肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae)引起的上呼吸道、肠道感染；由粪肠球菌(E.faecalis)引起的***、心内膜炎、胆囊炎、脑膜炎及伤口感染等；由阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)引起的医源性感染、泌尿道感染、呼吸道感染以及败血症等；由铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)引起的医源性感染、术后伤口感染、化脓性中耳炎等；由普通变形杆菌(P.vulgaris)引起的泌尿***感染、创口感染、呼吸道感染、食物中毒及败血症等；由黏质沙雷菌(Serratiamarcescens)引起的肺部感染、脑膜炎、心内膜炎、***、灼伤后败血症等。

针对细菌感染性疾病大量使用广谱抗生素，虽然能够抑制大部分致病菌，但会导致耐药菌株和变异菌株不断出现，长期使用还会引发多种副作用，增加患者负担和临床治疗的复杂性。并且，某些疾病可能由多种致病菌共同导致，病因复杂。因此，检测特定致病菌并有针对性地抑制所测得的致病菌，有利于合理治疗细菌感染性疾病。

然而，以培养为基础的传统致病菌检测方法存在耗时长、检测敏感性受培养条件限制等缺点，越来越不能满足临床的需要，因而开发快速、敏感、准确地检测病原菌的方法一直是人们追求的目标。近年来发展的生物芯片技术具有高通量、集成化、微型化及自动化等特点，在检测基因位点差异和分析基因表达水平等领域已得到广泛应用，而在临床致病菌和耐药性的检测方面，则可为临床抗生素的合理使用提供科学依据。

目前，临床和食品检验检疫上细菌鉴定主要方法有：传统的细菌分离培养和鉴定方法、PCR、Southern Blot杂交(即DNA印迹法)、ELISA等分子生物学和免疫学方法。但是，传统检测方法操作繁琐、耗时费力，一般需要3-5天，ELISA方法虽然灵敏度高，但易受污染，出现假阳性；采用多重PCR技术，虽然可以达到对单一菌的快速、准确和方便的诊断目的，但在病原菌未明时，需要采用多种不同引物进行试验，这对病原菌的复杂性和PCR程序的多样性来说是不够理想的。

随着生物芯片技术的日趋成熟，高效、快速、准确、灵敏的生物芯片技术，被应用到越来越多的领域，其中就包括临床致病菌快速诊断领域。液相芯片技术是新近开发出的新一代分子诊断技术平台，该平台既能保证信息质量，又能提供相对高通量的检测，其高通量、高精确性以及耗时短的特点为临床常见菌的检测提供了思路，可有效防止抗生素药物的滥用。

目前最先进的技术是科学家韩健博士发明的Tem-PCR(target enrichedmultiplex PCR，靶序列富集多重PCR)技术与液相芯片检测技术的结合运用，该技术能在一次反应中对多种靶序列进行高度敏感和特异的扩增和检测，其主要原理是，针对待扩增的每一种靶序列，设计两对巢式的特异性引物：F0，R0；Fi，Ri。其中的Fi和Ri引物带有一个能被通用的超级引物(Super Primer)识别的标签序列。巢式的靶序列特异性引物的浓度极低，用于在PCR的最初几个循环中富集目标序列。只有超级引物的浓度足以进行指数扩增，而且只有反向超级引物进行了生物素的标记。最后通过液相芯片检测平台输出信号，达到检测目的。该技术与普通PCR技术相比具有兼容性好、特异性强、效率超高、可半定量等优点，但是该技术存在对所需DNA模板要求高、PCR反应时间长、敏感性不够强等缺点。

细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构包含保守区及可变区。16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因，其长度约为1500pb，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。

在核糖体RNA(rRNA)特征序列中，经研究认为16S rRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物***发育指标最为合适，其主要依据是：它们为细胞所共有；其功能同源且最为古老；既含有保守序列又含可变序列；分子大小适合操作；它的序列变化与进化距离相适应。依据16S rRNA序列绘制的生命进化树，卡尔·沃斯(Carl Woese)将地球上的所有细胞生物划分为3个域(domain)，即古生菌(Archaea，也称Archaebacteria)、细菌(Bacteria，也称Eubacteria)和真核生物(Eukarya)。16S rRNA序列分析作为微生物分类***的主要依据也得到了广泛认同，随着微生物核糖体数据库的日益完善，该技术成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。

关于16S rDNA的数据库信息及分析软件较其它分类鉴定用的基因丰富得多，如RDP(http://rdp.cme.msu.edu/html/)、ARB(http://www.ard-home.de/)、ORS(http://soul.mikro.biologie.tu-muenchen.de/ORS/)、OPD(http://www.com.msu.eduOPD/)及PRIMROSE、CLUSTAL-X、PRIMER PREMIER、DNA START等，各分析软件因采用的算法不同而各有所长。

然而，本领域中尚未提供同时检测样品中多种致病菌的方法。本领域中仍然迫切需要开发出能够克服目前致病菌检测中的不足，且能高通量、快速检测多种致病菌的方法。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种高通量、快速检测常见致病菌的方法，该方法具有特异性强、敏感性高、检测时间短、交叉反应少等优点。本发明的另一个目的在于提供用于本发明方法的试剂盒，以及本发明的方法和试剂盒在临床常见菌检测中的应用。

在本发明的第一方面中，提供了一种获得样品中致病菌的标志性DNA序列的方法，所述致病菌为选自下组菌中的一种或多种：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae，即KPN)、粪肠球菌(E.faecalis，即EF)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae，即ECL)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa，即PAE)、普通变形杆菌(P.vulgaris，即PV)、黏质沙雷菌(Serratia marcescens，即SM)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，即SA)；所述方法包括：

(i)获得针对SEQ ID NO：10所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和针对SEQ ID NO：11所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG或SEQ ID NO：12所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的通用下游引物；

(ii)采用所述通用上游引物和通用下游引物对所述样品进行PCR扩增，从而获得所述致病菌的标志性DNA，其中，所述标志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一种或多种致病菌各自独有的特异性序列。

在一些优选例中，通过以上所述的PCR扩增方法获得的分别是SEQ ID NO:21-28所示的各菌标志性DNA序列。

在一些优选例中，所述通用下游引物的序列针对SEQ ID NO:12所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA。

在一些优选例中，所述通用上游引物的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示；所述通用下游引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示。

在另一些优选例中，所述致病菌为选自上组菌中的至少两种。

在一些实施方式中，所述通用上游引物为与SEQ ID NO：10所示序列的15～17个连续核苷酸序列完全一致的序列；所述通用下游引物为与SEQ ID NO：11或或SEQ ID NO：12的15～23个连续核苷酸序列完全互补的序列。

在一些优选例中，所述通用下游引物为与SEQ ID NO:12所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA或的15～23个连续核苷酸序列完全互补的序列。

在另一些实施方式中，所述通用上游引物为与SEQ ID NO：10所示序列的15～17个连续核苷酸序列完全互补的序列；所述通用下游引物为与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO:12的15～23个连续核苷酸序列完全一致的序列。

在一些优选例中，所述通用下游引物为与SEQ ID NO:12所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的15～23个连续核苷酸序列完全一致的序列。

在一些优选例中，所述致病菌的标志性DNA序列分别如下：a)SEQ ID NO:21所示的大肠杆菌的标志性DNA序列；b)SEQ ID NO:22所示的肺炎克雷伯菌的标志性DNA序列；c)SEQ ID NO:23所示的粪肠球菌的标志性DNA序列；d)SEQ ID NO:24所示的阴沟肠杆菌的标志性DNA序列；e)SEQ ID NO:25所示的铜绿假单胞菌的标志性DNA序列；f)SEQ ID NO:26所示的普通变形杆菌的标志性DNA序列；g)SEQ ID NO:27所示的黏质沙雷菌的标志性DNA序列；h)SEQID NO:28所示的金黄色葡萄球菌的标志性DNA序列。

在本发明的第二方面中，提供了一种检测样品中致病菌的方法，所述致病菌为选自下组中的一种或多种：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae，即KPN)、粪肠球菌(E.faecalis，即EF)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae，即ECL)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa，即PAE)、普通变形杆菌(P.vulgaris，即PV)、黏质沙雷菌(Serratia marcescens，即SM)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，即SA)；所述方法包括：

(A)采用本发明所述的方法获得样品中所述致病菌的标志性DNA序列；

(B)提供分别针对所述致病菌的标志性DNA序列的相应特异性捕获探针；

(C)在杂交条件下，使所述致病菌的标志性DNA序列与所述特异性捕获探针接触，并且在所述接触之前、之时或之后用不同的可检测标记物标记所述特异性捕获探针或所述致病菌的标志性DNA序列与所述特异性捕获探针形成的复合物，获得带有不同可检测标记物的杂交产物；

(D)检测连接到所述杂交产物上的可检测标记物的信号，以确定样品中各种待测致病菌的存在或数量。

在另一些优选例中，所述方法用于同时检测出样品中选自上组菌中的至少两种。

在一些实施方式中，所述方法用于临床样品检测、食品检验、食品加工过程检测或化妆品检测，优选用于临床样品检测。

在另一些实施例中，所述可检测标记物选自：编码微球、或其它载体(如荧光标记物、发光蛋白等)。

在另一些实施例中，所述方法还包括在步骤(A)之后，分离和/或纯化所述所述致病菌的标志性DNA序列、和/或将所述所述致病菌的标志性DNA序列与可检测标记物连接。在一些实施例中，所述可检测标记物是生物素、抗生物素、抗体、标记细胞或发光蛋白。

在一些实施方式中，所述样品来源于：生物组织、体液、血液、尿液或食品。

在另一些实施例中，所述样品是DNA样品或菌液。

在另一些实施例中，所述样品中可包含所述菌组内致病菌中的一种或多种。

在另一些实施方式中，其特征在于，所述特异性捕获探针选自：

a)针对SEQ ID NO:21所示的大肠杆菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；b)针对SEQ ID NO:22所示的肺炎克雷伯菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；c)针对SEQ ID NO:23所示的粪肠球菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；d)针对SEQ ID NO:24所示的阴沟肠杆菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；e)针对SEQ ID NO:25所示的铜绿假单胞菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；f)针对SEQ ID NO:26所示的普通变形杆菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；g)针对SEQ ID NO:27所示的黏质沙雷菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；和h)针对SEQ ID NO:28所示的金黄色葡萄球菌的特异性捕获探针。

在另一些优选例中，所述特异性捕获探针的G/C为45～60%，优选50～55%。

在另一些实施例中，所述特异性捕获探针的长度为20-25bp，更优选22bp。

在另一些实施例中，所述特异性捕获探针的Tm值为40-60℃，优选52℃。

在另一些实施例中，所述特异性捕获探针的5'端将修饰或封闭，以便于与编码微球偶联。

在另一些实施例中，所述特异性捕获探针选自下组：

a)SEQ ID NO:13所示的大肠杆菌的特异性捕获探针；

b)SEQ ID NO:14所示的肺炎克雷伯菌的特异性捕获探针；

c)SEQ ID NO:15所示的粪肠球菌的特异性捕获探针；

d)SEQ ID NO:16所示的阴沟肠杆菌的特异性捕获探针；

e)SEQ ID NO:17所示的铜绿假单胞菌的特异性捕获探针；

f)SEQ ID NO:18所示的普通变形杆菌的特异性捕获探针；

h)SEQ ID NO:19所示的黏质沙雷菌的特异性捕获探针；和

i)SEQ ID NO:20所示的金黄色葡萄球菌的特异性捕获探针。

在另一些实施方式中，步骤(C)中的所述可检测标记物为编码微球，所述编码微球采用可产生不同可信号的标记物编码。

在一些实施例中，所述标记物选自：不同颜色的标记物或其不同比例的组合。在另一些实施例中，所述标记物选自：不同颜色的荧光标记物，或不同比例的两种或两种以上的荧光标记物的组合。

在一些实施例中，所述编码微球与捕获探针偶联。在一些实施例中，所述偶联通过EDC法进行。在另一些实施例中，所述偶联是通过NHS偶联剂进行的。在另一些实施例中，所述微球是聚苯乙烯微球，并根据其表面带有的分子残基的不同，可以结合不同的探针分子。

在另一些实施方式中，步骤(D)中的所述检测采用选自下组的一种或多种***或仪器：液相芯片检测***、流式细胞仪或固相芯片。

在本发明的第三方面中，提供了一种用于检测致病菌和/或治疗致病菌感染的试剂盒，所述致病菌为选自下组中的一种或多种：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae，即KPN)、粪肠球菌(E.faecalis，即EF)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae，即ECL)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa，即PAE)、普通变形杆菌(P.vulgaris，即PV)、黏质沙雷菌(Serratia marcescens，即SM)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，即SA)；所述试剂盒包含：

(i')针对SEQ ID NO：10所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和针对SEQ ID NO：11所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG或或SEQ ID NO：12所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物对所述样品进行PCR扩增，可获得所述致病菌的标志性DNA，其中，所述标志性DNA序列位于所述致病菌的16SrDNA中，且包含所述一种或多种致病菌各自独有的特异性序列；

(ii')针对所述致病菌的标志性DNA序列的相应特异性捕获探针、各种可检测标记物、或各种特异性捕获探针与可检测标记物的连接物；

(iii')一个或多个容器和/或包装物；

(iv')任选的，PCR扩增用试剂；

(v')任选的，用于连接所述特异性捕获探针和可检测标记物的试剂；

(vi')任选的，检测信号用的试剂和/或仪器；

(vii')任选的，使用说明书；

(viii')任选的，致病菌治疗剂。

在一些优选例中，所述试剂盒用于同时检测出样品中至少两种选自上组的菌。

在本发明的第四方面中，提供了下述物质在制备检测致病菌和/或治疗致病菌感染的试剂盒中的用途：

(i)针对SEQ ID NO：10所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和针对SEQ ID NO：11所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG或或SEQ ID NO：12所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物对所述样品进行PCR扩增，可获得所述致病菌的标志性DNA，其中，所述标志性DNA序列位于所述致病菌的16SrDNA中，且包含所述一种或多种致病菌各自独有的特异性序列；

(ii)针对所述致病菌的标志性DNA序列的相应特异性捕获探针、各种可检测标记物、或各种特异性捕获探针与可检测标记物的连接物；

(iii)一个或多个容器和/或包装物；

(iv)任选的，PCR扩增用试剂；

(v)任选的，用于连接所述特异性捕获探针和可检测标记物的试剂；

(vi)任选的，检测信号用的试剂和/或仪器；

(vii)任选的，使用说明书；

(viii)任选的，致病菌治疗剂。

在一些实施例中，所述可检测标记物是微球。

在本发明的其它方面中，还提供了本发明上述方法和试剂盒在检测致病菌和/或治疗致病菌感染中的用途。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1：针对菌A-菌F的16S rDNA基因的通用引物和特异性捕获探针的设计示意图。

图2：采用通用引物对(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)PCR扩增不同菌株的凝胶电泳图。

图3：采用通用引物对(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4)PCR扩增不同菌株的凝胶电泳图。

图4：采用通用引物对(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5)PCR扩增不同菌株的凝胶电泳图。

图5：采用通用引物对(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6)PCR扩增不同菌株的凝胶电泳图。

图6：采用通用引物对(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7)PCR扩增不同菌株的凝胶电泳图。

图7：采用通用引物对(SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)PCR扩增不同菌株的凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明主要是为了克服目前致病菌(尤其是临床常见致病菌)检测中的不足，提供一种高通量快速检测致病菌的方法，采用一对通用引物及特异性捕获探针设计，通过液相芯片实现信号输出的方法，可同时、快速检测多种致病菌。该方法高效、灵敏、特异性强、交叉反应少，克服多重PCR及荧光检测***中存在的PCR反应引物设计繁琐及产生交叉反应等缺点。

本发明人开发的以16S rDNA PCR技术为核心的新型致病菌快速检测技术，只需采用一对通用引物就可以对多种不同细菌的16S rRNA特征信息进行扩增，获得的为包含多重性的16S rDNA信息的PCR产物。这种常规的PCR方法，可以在一个小时之内完成扩增反应。所获得的PCR产物，采用与特异性引物偶联的编码微球，用液相芯片检测***(如Luminex200)，可以实现多重性和高通量的检测目标。

获得致病菌标志性DNA序列的方法

本发明中提供了一种获得样品中致病菌的标志性DNA序列的方法，所述致病菌为选自下组中的一种或多种：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae，即KPN)、粪肠球菌(E.faecalis，即EF)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae，即ECL)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa，即PAE)、普通变形杆菌(P.vulgaris，即PV)、黏质沙雷菌(Serratia marcescens，即SM)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，即SA)，所述方法包括：

(i)获得针对SEQ ID NO：10所示序列ACGCGAAGAACCTTACC的通用上游引物和针对SEQ ID NO：11所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG或SEQ ID NO：12所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的通用下游引物；

如本文所用，术语“标志性DNA序列”是指位于各种致病菌16S rDNA中、且可由本发明的通用引物对扩增获得的特定序列，所述序列的两端包含各菌共有的保守序列，而在该序列内部具有各种致病菌独有的特异性序列。在本发明的一些实施方式中，所述致病菌的标志性DNA序列分别如下：a)SEQ ID NO:21所示的大肠杆菌的标志性DNA序列；b)SEQ ID NO:22所示的肺炎克雷伯菌标志性DNA序列；c)SEQ ID NO:23所示的粪肠球菌标志性DNA序列；d)SEQ IDNO:24所示的阴沟肠杆菌标志性DNA序列；e)SEQ ID NO:25所示的铜绿假单胞菌标志性DNA序列；f)SEQ ID NO:26所示的普通变形杆菌标志性DNA序列；g)SEQ ID NO:27所示的黏质沙雷菌标志性DNA序列；和h)SEQ ID NO:28所示的金黄色葡萄球菌标志性DNA序列。

如本文所用，术语“特异性序列”或“可变区”可互换使用，均是指位于各种待测致病菌16S rDNA基因内部、各种待测致病菌独有的一段区域。通过分析和比较各种待测致病菌的16S rDNA序列可确定该特异性序列的存在和具***置。通常，该特异性序列两端具有各种致病菌共有的保守序列。所述的特异性序列可用于区分致病菌的种类。

可采用序列比对、参考文献(液体芯片技术定量测定人体血清CEA、AFP、NSE和tPSA，粱惠仪等，J Mol Diagn Ther，2010年7月，Vo1.2，No.4；王嘉莉等；High-Throughput,Sensitive,and Accurate Multiplex PCR-Microsphere FlowCytometry System for Large-Scale Comprehensive Detection of Respiratory Viruses(以新技术平台Luminex快速检测具二甲氧基苯青霉素抗药性的金黃色葡萄球菌)2007年5月30日提前公开.10.1128/JCM.02501-06.2007,45(8):2626.DOI:J.Clin.Microbiol.James R.Prudent等)、实验验证等本领域常规技术确定适用于本发明方法的各待测致病菌的特异性序列或包含该序列的标志性DNA序列。关于16S rDNA的数据库信息及分析软件在本领域中是已知的，例如RDP(http：//rdp.cme.msu.edu/html/)、ARB(http://www.ard-home.de/)、ORS(http://soul.mikro.biologie.tu-muenchen.de/ORS/)、OPD(http://www.com.msu.eduOPD/)及PRIMROSE、CLUSTAL-X、PRIMER PREMIER、DNA START等，各分析软件因采用的算法不同而各有所长，这些数据库和软件均可用于本发明中。

如本文所用，术语“保守序列”或“共有序列”可互换使用，均是指各种致病菌的16S rRNA基因(16S rDNA)的标志性DNA序列中的一致序列。针对“保守序列”设计出的本发明的通用引物可用于扩增出各种待测致病菌的标志性DNA序列。为了实现通用扩增的目的，通常该保守序列位于可变区的两端。

如本文所用，术语“通用引物对”是指针对致病菌标志性DNA序列中的保守区域、可用于扩增出包含各种致病菌的特异性序列的致病菌标志性DNA序列的一对通用引物。通用上游引物(或称“正向通用引物”)通常针对标志性DNA序列的上游；通用上游引物(或称“反向通用引物”)通常针对标志性DNA序列的下游。

通用引物对的设计可根据本领域中常规的引物设计规则进行、采用已知的引物设计软件和/或由提供引物设计的公司提供专门的服务。本发明的通用上游引物和通用下游引物分别针对SEQ ID NO：10所示序列ACGCGAAGAACCTTACC和针对SEQ ID NO：11所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG或SEQ ID NO：12所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA。例如在本发明的一个实施例中，可采用SEQ ID NO:1或3的通用上游引物与SEQ ID NO:2、4、5、6或7的通用下游引物组合形成通用引物对。

在本发明的方法中，可采用本领域中已知的PCR方法和常规条件、采用本发明的通用引物对，对样品进行PCR扩增。也可对已知类型的菌种进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序，并将测序信息用于后续的特异性捕获探针设计。

致病菌检测方法

本发明中提供了一种检测致病菌的方法，所述方法包括：

(A)采用如上所述的方法获得样品中所述致病菌的标志性DNA序列；

(B)提供分别针对所述致病菌(一种或多种，优选至少两种)的标志性DNA序列的相应特异性捕获探针；

如本文所用，术语“特异性捕获探针”或“捕获探针”可互换使用，均是指针对可能存在的某种致病菌在16S rDNA标志性DNA序列中的特异性序列设计的，从而可特异性捕获该种致病菌的16S rDNA扩增产物的探针。根据需要，本发明的捕获探针可带有或不带有标记物(如放射性、生物素、荧光标记物等)。可根据本领域中常规的探针设计规则设计探针，并人工合成探针。

在本发明的一些实施方式中，SEQ ID NO：13～20的捕获探针序列分别特异性地针对并可分别捕获大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、黏质沙雷菌和金黄色葡萄球菌的标志性DNA序列，更具体而言是标志性DNA序列中的特异性序列。

可用各种可检测标记物与捕获探针连接，以使得被特定捕获探针捕获的序列上带有特定的标记，从而将特定可检测标记与特定菌的序列对应起来，便于区分不同的细菌。所述可检测标记物包括但不限于：编码微球、载体(例如荧光标记物、发光蛋白)等，优选编码微球。连接标记物和捕获探针的方法是本领域中所熟知的，本领域普通技术人员可根据所选的标记物对捕获探针或标记物进行修饰或改造，以得到两者可相互连接(例如可参见许艳军，厦门大学2008年硕士学位论文：液相芯片中羧基功能性聚苯乙烯微球的制备、表征及其在生物检测中的应用、及其所引用的参考文献等文献)。

如本文所用，术语“编码微球”是指具有不同可检测区分的特征(例如大小和/或颜色)、能与捕获探针偶联、并可被检测设备区分的各种微球。微球的材料可为：聚苯乙烯，如MultiAnalyte微球或SeroMap微球等。微球的直径可为20nm-200μm，优选5～10μm，更优选5.6μm。微球可用不同配比的染料(优选荧光染料)染成不同的颜色(如荧光色)，从而获得可多达数种、十数种、数十种、甚至百余种不同的编码微球。可通过市售途径获得编码微球，例如购自凯杰生物、BIO-RAD或根据需要自行设计和制备编码微球(例如可参考陈玮，液相芯片技术的原理与应用进展，成都医学院病理教研室，成都医院学报，2008(3):225-231，该文献以其全文纳入本文作为参考)。

本发明的捕获探针可经过修饰或改造具有适于与编码微球偶联的接头或基团，例如可在捕获探针的5'端连接AMB以用于进一步与编码微球连接。捕获探针与编码微球的偶联，可采用本领域中已知的方法进行(例如可参考韩卫宁等，液相芯片技术在核酸检测中的应用研究进展，现代预防医学，2008(10):1911-1915，该文献以其全文纳入本文作为参考)。例如在适合捕获探针上的接头或基团与编码微球上的相应结构连接或反应的条件下，混合和孵化捕获探针和编码微球。

在适当条件下，使采用通用引物对扩增得到的PCR产物与不同的捕获探针-编码微球偶联物杂交，以使得PCR产物带有来自编码微球的可检测信号。杂交条件可参照厂商提供的操作规程(例如luminex偶联试剂盒的标准操作规程进行)或本领域中的常规条件进行。

可采用本领域中已知的方法检测连接到所述PCR产物上的编码微球的信号，以测定致病菌的存在或数量。例如可采用荧光微球检测***、流式细胞仪或固相芯片等。当检测到与特定致病菌的捕获探针偶联的特定编码微球信号时，表明被检测的样品中带有此种特定的致病菌。如需要的话，可通过编码微球信号的强弱测定样品中致病菌的数量。

试剂盒及试剂的应用

本发明中还提供了一种用于检测致病菌的试剂盒，其包含：

(i')针对SEQ ID NO：10所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和针对SEQ ID NO：11所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG或SEQID NO：12所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物对所述样品进行PCR扩增，可获得所述致病菌的标志性DNA，其中，所述标志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一种或多种致病菌各自独有的特异性序列；

(iii')一个或多个容器和/或包装物；

(iv')任选的，PCR扩增用试剂；

(vi')任选的，检测信号用的试剂和/或仪器；

(vii')任选的，使用说明书；

(viii')任选的，致病菌治疗剂。

本发明中进一步提供了采用本发明的方法或试剂盒检测致病菌和/或治疗致病菌感染中的用途。

本发明的优点

利用本发明的技术，可在短时间内(4小时内，如2-3小时)对多种临床常见致病菌及其混合物进行准确、快速检测；与传统的检测方法(细菌培养、生化鉴定、血清分型等)以及医院现用其它仪器检测(例如西门子walkaway96微生物鉴定***，该***原理还是传统检测方法的原理)相比，新技术的特色和创新性主要体现在：可以直接用菌液或待检样品作为PCR模板进行快速多重PCR扩增，可同时对多种常见致病菌进行高通量并行检测，一次实验即可得出全部结果，操作简便快速，特异性强、灵敏度高。

序列表说明

本发明序列表中序列号与具体序列之间的对应关系如下表1所示：

表1.序列表说明

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

材料与方法

1.主要实验仪器

本实验的主要实验仪器是PCR仪(BIO-RAD S1000Thermal cycler)、荧光微球检测***(luminex liquichip200)、QIAxcel Advanced***(凯杰公司QIAGEN)。

2.实验菌株

表2.实施例所用实验菌株描述

3.主要实验试剂

大肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、普通变形杆菌、黏质沙雷菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌均采用LB培养基37℃培养过夜。

LB培养基：酵母提取物0.5%，胰蛋白胨1%，NaCl1%；

HotStar Taq Plus标准混合试剂盒(HotStar Taq Plus Master mix kit(1000)，cat.No.203645，德国恰根生物(QIAGEN))、EDC(西格玛公司(Sigma))、偶联微球(COOH beads#171-5060**伯乐公司(BIO-RAD))、鞘液(cat.NO922902，德国恰根生物)、S-PE(cat.NO922721德国恰根生物)。

引物及探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

4.通用引物和捕获探针设计

通用引物的设计及生物素标记，根据致病菌的16S rDNA中标志性DNA序列的保守区域，设计一对通用引物，该引物的位置和序列如下所示：

通用上游引物16S-for针对SEQ ID NO：10所示序列设计；通用下游引物16S-rev针对SEQ ID NO：11所示序列或SEQ ID NO:12所示序列设计：

表3.本发明的通用引物

SEQ ID NO：	通用引物	序列	5端修饰
				1	通用上游引物1	5’-ACGCGAAGAACCTTACC-3’
2	通用下游引物2	5’-TGCGGGACTTAACCCAAC-3’	BIO
				3	通用上游引物3	5’-GCGAAGAACCTTACC-3’
4	通用下游引物4	5’-TGCGGGACTTAACCC-3’	BIO
				5	通用下游引物5	5’-TCGTTGCGGGACTTAACCCAACA-3’	BIO
6	通用下游引物6	5’-GTTGCGGGACTTAACCCAACA-3’	BIO
				7	通用下游引物7	5’-CTCGTTGCGGGACTTAACCCAA-3’	BIO

另设计可扩增16S rDNA最长片段的一对引物(参考周煌，16S rRNA序列分析法在医学微生物鉴定中的应用，北京微生物流行病研究所，生物技术通讯，Vol.10,NO4,1999)：

上游引物16S-for针对各菌的16S rDNA的8-28bp处设计；下游引物16S-rev针对各菌的16S rDNA的1460-1510处设计：

表4.全长16S rDNA通用引物

SEQ ID NO：	通用引物	序列	5端修饰
				8	全长16通用上游引物8	5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
9	全长16通用下游引物9	5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’	BIO

各菌16S rDNA Genebank号如下：阴沟肠杆菌：AJ251469.1；肺炎克雷伯菌：Y17657.1；粪肠球菌：KC699230.1；普通变形杆菌：DQ205432.1；黏质沙雷菌：FM163485.2；铜绿假单胞菌：FJ194518.1；金黄色葡萄球菌：DQ269498.1。

SEQ ID NO:1-7扩增片段长度为130-140bp，SEQ ID NO:8-9扩增片段长度的为1500bp左右，设计好的下游引物在5’端用生物素(Biotin)标记，用于luminex仪器Luminex-流式荧光技术(又称液态芯片，液相芯片))信号检测。

通过DNA测序获得PCR后的序列，然后结合NCBI中数据库Taxonomy，获得各菌株的16S rDNA，利用核酸比对软件DNAMAN进行比对，获得各菌株在通用引物区间内的标志性序列，即为设计的特异性探针所针对的序列(即为设计捕获探针所针对的序列)。对每种致病菌各设计一条捕获探针，Tm值为52℃左右，并在5’端磷酸化封闭，用于探针和微球的偶联。设计构思如图1所示。捕获探针的具体序列如表5所示：

表5.针对各菌株所设计的探针序列

AMB(由合成引物探针公司完成修饰)是化学物质氨基连接臂(Aminolinker)C12/5'端氨基修饰，用于连接探针和磁珠。

5.通用引物PCR反应及条件

试验中PCR的反应体系包括(50μl)：Hotstar酶25μL，水22μL，通用引物(10μmol/L)各4μL，模板10μL(模板中的菌浓度为大于1×10⁵CFU/ml)。

PCR程序为：95℃，5分钟；94℃，40秒；55℃，40秒；72℃，1分钟；34个循环；72℃，2分钟；16℃，5分钟；终止。

所得到的PCR产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。

6.探针、微球的偶联

涡旋微球(微球的浓度为1.25×10⁷个/mL)5min，将100μL微球转至耦合管中，避光，用0.1M MES洗涤微球。离心微球12000rpm，3min，弃上清，再用50μL0.1M MES悬浮。将5微升100pmol/L的探针试剂加入到每一个相应的微球(即不同编码的微球)悬浮液中。立即加入2.5μL10mg/mL EDC到每一个包含探针和微球的混合管中，涡旋10秒，室温下孵化混合液30分钟。

第二次EDC的添加和孵化(步骤同上)。

二次孵化加2.5μL0.1M MES溶解的EDC溶液(10mg/mL)至探针-微球的混合管中，涡旋10秒，孵化30分钟，在室温暗处放置。

然后，用0.02%吐温20洗涤微球，加入1mL0.02%吐温20到每个偶联的微球的耦合管中，涡旋10秒，以12000rpm离心3分钟，弃上清。加1mL0.1%SDS清洗，涡旋10秒，以12000rpm离心3分钟。重新悬浮，用250μL1×TE涡旋5秒。4℃保存。

7.荧光微球***检测

步骤1：通用引物PCR扩增(同第5部分中所描述)

步骤2：通用引物PCR扩增产物与探针-微球偶联物的反应

A.反应体系中相关试剂的添加量：

微球混合体系(微球浓度：大于5×10³个/ml)：500μL-50×N=M

50表示稀释倍数；N表示各种探针-微球溶液的体积(μL)；M表示1×TE的体积(mol/L)。

1×TE(10mM Tris-HCl，pH=8.0，0.1mM EDTA pH＝8.0)的配制：

1M Tris-HCl pH＝8.0，1mL；0.5M EDTA pH＝8.0，0.2mL；

用超纯水定容至100mL。

表6.反应体系组成

成分	体积μL/r×n
		微球混合体系	10
检测缓冲液	35
		PCR产物	5

“r”是“反应(reaction)”的简写；

“n”是“数量(number)”的简写；

“体积μL/r×n”表示单个反应体系所需的试剂体积。

检测缓冲液(1.8L)的配方：606.6mL超纯水，1080mL的5M TMAC，9mL的20%肌氨酰(Sarkosyl)，90mL的1M Tris-HCl(pH=8.0)，14.4mL的0.5M EDTA(pH=8.0)。

杂交过程：

将微球稀释液(微球混合体系+检测缓冲液)涡旋15秒，混匀后加入到杂交管或96孔板中，每孔45μL，将PCR产物加入到相应孔中，每孔5μL，混匀后，将孔板于52℃孵育10分钟；孵育后，每孔加入10μL S-PE，52℃孵育5分钟；孵育后，每孔加入120微升事先预热的ddH₂O，终止杂交过程，待测。

采用荧光微球检测***(luminex liquichip200)，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光以进行定性和半定量。

实施例1.采用SEQ ID NO:1所示的通用上游引物和SEQ ID NO:2所示的通用下游引物对临床常见致病菌进行PCR扩增

培养所要检测的临床常见致病菌(常见于尿液，也可见于其它样品)：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae，即KPN)、粪肠球菌(E.faecalis，即EF)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae，即ECL)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa，即PAE)、普通变形杆菌(P.vulgaris，即PV)、黏质沙雷菌(Serratia marcescens，即SM)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，即SA)。

将菌液浓度调至大于10⁵CFU/ml，直接进行PCR扩增。

PCR扩增结果如图2所示。

图2所示为菌种PCR凝胶电泳图，从左到右依次是大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae，即KPN)、粪肠球菌(E.faecalis，即EF)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae，即ECL)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa，即PAE)、普通变形杆菌(P.vulgaris，即PV)、黏质沙雷菌(Serratia marcescens，即SM)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，即SA)、以上8种菌的混合菌样、空白和分子量标记(Marker100-2000bp)。

该结果显示：所设计的引物可以高灵敏度、特异性扩增相应的菌株及菌株混合液。

实施例2.采用SEQ ID NO:3所示的通用上游引物和SEQ ID NO:4所示的通用下游引物对临床常见致病菌进行PCR扩增

菌液的扩增方法同上(实施例1)，PCR扩增结果如图3所示。

图3所示为菌种PCR凝胶电泳图，从左到右依次是大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae，即KPN)、粪肠球菌(E.faecalis，即EF)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae，即ECL)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa，即PAE)、普通变形杆菌(P.vulgaris，即PV)、黏质沙雷菌(Serratia marcescens，即SM)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，即SA)、以上8种菌的混合菌样、空白和分子量标记(Marker100-2000bp)。

该结果显示：所设计的引物也可以有效扩增获得PCR产物，可作为通用引物。

实施例3.采用SEQ ID NO:3所示的通用上游引物和SEQ ID NO:5所示的通用下游引物对临床常见致病菌进行PCR扩增

菌液的扩增方法同上(实施例1)，PCR扩增结果如图4所示。

图4所示为菌种PCR凝胶电泳图，从左到右依次是大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae，即KPN)、粪肠球菌(E.faecalis，即EF)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae，即ECL)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa，即PAE)、普通变形杆菌(P.vulgaris，即PV)、黏质沙雷菌(Serratia marcescens，即SM)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，即SA)、以上8种菌的混合菌样、空白和分子量标记(Marker100-2000bp)。

该结果显示：所设计的引物也可以作为通用引物，获得相应的PCR产物以及混合菌的PCR产物。

实施例4.采用SEQ ID NO:3所示的通用上游引物和SEQ ID NO:6所示的通用下游引物对临床常见致病菌进行PCR扩增

菌液的扩增方法同上(实施例1)，PCR扩增结果如图5所示。

图5所示为菌种PCR凝胶电泳图，从左到右依次是大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae，即KPN)、粪肠球菌(E.faecalis，即EF)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae，即ECL)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa，即PAE)、普通变形杆菌(P.vulgaris，即PV)、黏质沙雷菌(Serratia marcescens，即SM)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，即SA)、以上8种菌的混合菌样、空白和分子量标记(Marker100-2000bp)。

实施例5.采用SEQ ID NO:3所示的通用上游引物和SEQ ID NO:7所示的通用下游引物对临床常见致病菌进行PCR扩增

菌液的扩增方法同上(实施例1)，PCR扩增结果如图6所示。

图6所示为菌种PCR凝胶电泳图，从左到右依次是大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae，即KPN)、粪肠球菌(E.faecalis，即EF)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae，即ECL)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa，即PAE)、普通变形杆菌(P.vulgaris，即PV)、黏质沙雷菌(Serratia marcescens，即SM)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，即SA)、以上8种菌的混合菌样、空白和分子量标记(Marker100-2000bp)。

实施例6.采用SEQ ID NO:8所示的上游引物和SEQ ID NO:9所示的下游引物对临床常见致病菌进行PCR扩增(扩增长度大约在1500bp)

菌液的扩增方法同上(实施例1)，PCR扩增结果如图7所示。

图7所示为菌种PCR凝胶电泳图，从左到右依次是大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae，即KPN)、粪肠球菌(E.faecalis，即EF)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae，即ECL)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa，即PAE)、普通变形杆菌(P.vulgaris，即PV)、黏质沙雷菌(Serratia marcescens，即SM)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，即SA)、以上8种菌的混合菌样、空白和分子量标记(Marker100-2000bp)。

该结果表明：所设计的全长16S rDNA通用引物扩增单个菌时，可以获得目标产物，但对混合菌液进行PCR扩增时，就得不到目标产物。换言之，该引物对无法对混合菌液进行有效扩增。而在实际应用中所要检测的样品通常是混合菌液(如：尿液、体液、血液、食品等，其中所包含的微生物不止一种)，因此该全长16S rDNA通用引物对不能作为通用引物运用于本实验以及大多数临床情况。相反，实施例1-5中所采用的本发明的特定通用引物对可对混合菌液有效扩增。

实施例7.采用Luminex***检测临床常见致病菌

将包含单一菌株或混合菌株样品的实施例1中所得的PCR产物与偶联了探针的微球反应，然后采用Luminex***进行检测。同时将其它非目标菌株的PCR产物也加入到检测***，检测体系的特异性(即交叉反应情况)。

将用微球藕联好探针与PCR产物结合，用液相芯片实现信号输出，用MFI值表示，检测结果如下表7所示：

表7：采用Luminex***检测临床常见致病菌

数据类型：平均值，n＝14

阳性结果判定依据：所获得的荧光强度中位值(MPI)大于250，或为阴性结果的平均值加上5倍的阴性结果标准差当数值在250左右时，2种判定结果都用，当都在临界值时，应判为阳性。

以表格中关于ECL菌的数据为例，计算标准差阳性值。

阴性结果平均值＝(102+46+46+78+59+14+103+103+85+81+59+26)/12=66.83

阳性结果临界值＝66.83+5×28.80=210.86，即当获得结果大于210.86时，可认为是阳性结果。

采用本发明的试剂和方法对阴沟肠杆菌检测的结果为阳性。

其它结果可以按此方法类推。

首先是单个阳性样本的测试即对样品为单种菌的PCR产物进行检测，以确定检测探针设计的可行性、灵敏度及特异性。由表7的编号1-8可以得出：探针设计可行，灵敏度高，且特异性强。

编号9-12是未纳入探针设计中的实验室现有的其它菌种，采用本***未探测到***设计以外的菌，表明本发明***特异性强，没有发生交叉反应。

通过本实验可以得出结论：本发明的***可以作为检测临床常见致病菌的强特异性有效***。

实施例8.采用Luminex***检测临床样本

采用382例中段尿样样本进行检测，其液相芯片Luminex200和西门子walkaway96微生物鉴定***的检测结果如表8所示：

表8：采用Luminex***检测临床样本

注：血平板检测结果中，“+”表示：5μL尿液的平板菌落数大于20个；

PCR检测结果中，“+”表示：与空白比对，条带浓度大于空白；

西门子***检测结果中，“+”表示：以医院金标准(参考《全国临床检验操作规程》第三版,中华人民共和国***医政司)判定***仪器显示结果，菌浓大于1×10⁵CFU/mL；

液相芯片***检测结果中，“+”表示：MFI(荧光强度中位值)大于250。

西门子walkaway96微生物鉴定***的鉴定简介和过程简述如下：西门子鉴定***以微生物深化理论为基础，借助微生物信息编码技术，该***根据微生物对各种生理条件、生化指标、代谢反应进行分析，并将结果转化为软件可以识别的数据，进行聚类分析，与已知的参比菌株数据库进行比较，最终对未知菌进行鉴定。实验鉴定过程：尿液在血平板上37℃培养24小时，由技术员判断是否进一步实验，观察到平板上未生长菌落的或生长较少菌落或杂菌较多的平板弃之报阴性，挑取判断为染菌的平板上的染菌菌落，接入西门子试剂盒中，在西门子***培养24-72小时，仪器判定结果。即，在进入西门子***确定何种菌种前，先进行了平板初筛，人为剔除了平板上菌落生长较少或无及含有混合菌的平板，或是检验人员认为是染杂菌的平板。

对从医院获得的382例临床中段尿样本进行检测，其中234例样本的各项检测结果显示均为阴性结果，61例样本大肠杆菌检测呈阳性。另外有14例样本的液相芯片确定为大肠杆菌阳性，但采用金标准的西门子***检测结果显示为阴性。这是由于医院在进行西门子***检验时进行了血平板初筛，人为判定并放弃含2个及2个以上菌种的样本(即无法检测混合菌样品)及菌落数较少的样本(即检测灵敏度受限)(特殊样本2)，或只选择优势样本检测(即检测灵敏度受限)(特殊样本1)，相比之下，采用本发明方法的液相芯片***不经过初筛且检测灵敏，液相芯片可显示低菌浓度或混合菌阳性结果。并且，本发明方法的检测时间仅需2-3小时，且无需初筛样品，具有高效、简便的优点。

结论

由于16S rRNA基因的序列分析已从根本上影响了人们对细菌之间进化关系的理解，许多微生物的分类鉴定中均进行了16S rRNA序列测定。然而，本领域中尚未采用16S rDNA、PCR扩增及借助仪器快速鉴别未知样品中微生物的种类。

本实验中采用PCR扩增将16S rRNA片段扩增成16S rDNA。然后，通过比对多种菌的16S rDNA序列，找到各菌的高度特异性区域，在高度特异性区域的两端找到这些菌的高度保守区设计通用引物并使其带生物素标记。

本实验对16S rDNA长约1500bp左右的序列设计多对引物，图2-7表明在16SrDNA的约900～1200bp处(例如黏质沙雷氏菌16S rDNA的975-1108bp处)设计引物，可扩增约在130-140bp片段，可获得高效率的扩增，而全长16S rDNA通用引物16S-FOR(SEQ ID NO:8)和16S-REV(SEQ ID NO:9)并不能同时扩增目标菌及混合菌样的有效片段，不能符合同时检测多种菌的要求。这说明,任意选择16S rDNA中的所谓保守序列设计引物,常常不能在混合菌多重PCR的状况下获得目的DNA产物。

发明人经过反复实验和尝试发现：针对具体的8种临床常见致病菌：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae，即KPN)、粪肠球菌(E.faecalis，即EF)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae，即ECL)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa，即PAE)、普通变形杆菌(P.vulgaris，即PV)、黏质沙雷菌(Serratia marcescens，即SM)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，即SA)，分别设计上下游通用引物，可以同时扩增各菌标志性DNA。本实验引物的设计解决了以往致病菌采用多重PCR的扩增所导致的交叉反应，引物设计简单，成本降低。

捕获探针的设计主要针对在通用引物PCR扩增后所得序列中各菌的高度特异性区域。对探针的5’端进行修饰(如氨基化)以便该探针和微球的偶联，每个探针偶联一个编码的(如颜色编码)微球，使得仪器识别PCR产物和探针微球结合后的微球信号，从而实现单一反应体系同时检测多种菌株的目的。

本发明的反应体系检测灵敏、特异性强、检测速度快，在15min就可完成检测过程，液相芯片技术改变以往通用芯片需要将探针固定在芯片上、芯片成本高的状况，而只需要一个无菌反应体系(如96孔细胞培养板)，就可以一次完成多个(如96个)样品的测定，成本低、效率高，是大批量样品检测的首选方法。

在不久的将来液相芯片技术会以其高通量、检测灵敏度高、重复性好等优点，以及检测动态范围宽等优势被广泛应用与各研究领域。

此外，虽然实施例中的通用引物序列和捕获探针是针对特定的临床常见致病菌设计和制备的，本领域普通技术人员可根据本发明的构思确定其它致病菌中可用于本发明的可变区序列，并设计和制备相应的通用引物序列和捕获探针，以实现对其它致病菌的检测。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种获得样品中致病菌的标志性DNA序列的方法，所述致病菌为选自下组菌中的一种或多种：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae)、粪肠球菌(E.faecalis)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)、普通变形杆菌(P.vulgaris)、黏质沙雷菌(Serratia marcescens)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)；所述方法包括：

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于，所述通用上游引物为与SEQ IDNO：10所示序列的15～17个连续核苷酸序列完全一致的序列；所述通用下游引物为与SEQ ID NO：11或12的15～23个连续核苷酸序列完全互补的序列。

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于，所述通用上游引物为与SEQ IDNO：10所示序列的15～17个连续核苷酸序列完全互补的序列；所述通用下游引物为与SEQ ID NO：11或12的15～23个连续核苷酸序列完全一致的序列。

4.一种检测样品中致病菌的方法，所述致病菌为选自下组菌中的一种或多种：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae)、粪肠球菌(E.faecalis)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)、普通变形杆菌(P.vulgaris)、黏质沙雷菌(Serratia marcescens)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)；所述方法包括：

(A)采用权利要求1～3中任一项所述的方法获得样品中所述致病菌的标志性DNA序列；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法用于临床样品检测、食品检验、食品加工过程检测或化妆品检测，优选用于临床样品检测或食品检疫。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述特异性捕获探针选自：

a)针对SEQ ID NO:21所示大肠杆菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；

b)针对SEQ ID NO:22所示肺炎克雷伯菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；

c)针对SEQ ID NO:23所示粪肠球菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；

d)针对SEQ ID NO:24所示阴沟肠杆菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；

e)针对SEQ ID NO:25所示铜绿假单胞菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；

f)针对SEQ ID NO:26所示普通变形杆菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；

g)针对SEQ ID NO:27所示黏质沙雷菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；和

h)针对SEQ ID NO:28所示金黄色葡萄球菌标志性DNA序列的特异性捕获探针。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(C)中的所述可检测标记物为编码微球，所述编码微球采用可产生不同可信号的标记物编码。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(D)中的所述检测采用选自下组的一种或多种***或仪器：液相芯片检测***、流式细胞仪或固相芯片。

9.一种用于检测致病菌和/或治疗致病菌感染的试剂盒，所述致病菌为选自下组菌中的一种或多两种：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae)、粪肠球菌(E.faecalis)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)、普通变形杆菌(P.vulgaris)、黏质沙雷菌(Serratia marcescens)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)；所述试剂盒包含：

(i')针对SEQ ID NO：10所示序列的通用上游引物和针对SEQ ID NO：11或SEQ ID NO:12所示序列的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物对所述样品进行PCR扩增，可获得所述致病菌的标志性DNA，其中，所述标志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一种或多种致病菌各自独有的特异性序列；

(iii')一个或多个容器和/或包装物；

(iv')任选的，PCR扩增用试剂；

(vi')任选的，检测信号用的试剂和/或仪器；

(vii')任选的，使用说明书；

(viii')任选的，致病菌治疗剂。

10.下述物质在制备检测致病菌和/或治疗致病菌感染的试剂盒中的用途：

(i)针对SEQ ID NO：10所示序列的通用上游引物和针对SEQ ID NO：11所示序列或SEQ ID NO：12所示序列的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物对所述样品进行PCR扩增，可获得所述致病菌的标志性DNA，其中，所述标志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一种或多种致病菌各自独有的特异性序列；

(iii)一个或多个容器和/或包装物；

(iv)任选的，PCR扩增用试剂；

(vi)任选的，检测信号用的试剂和/或仪器；

(vii)任选的，使用说明书；

(viii)任选的，致病菌治疗剂。