CN104403005A

CN104403005A - Glp-1与人血清白蛋白重组蛋白的设计及稳定表达cho细胞株的构建方法

Info

Publication number: CN104403005A
Application number: CN201410699879.3A
Authority: CN
Inventors: 金坚; 钱凯; 龚笑海; 马鑫; 朱瑞宇; 蔡燕飞; 陈蕴
Original assignee: WUXI XINLIANXIN BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd; Jiangnan University
Current assignee: WUXI XINLIANXIN BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd; Jiangnan University
Priority date: 2014-11-28
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2015-03-11

Abstract

本发明提供了一类新颖的胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物与人血清白蛋白重组蛋白及其制备的方法。该新颖重组蛋白组成框架为：T-S-X-G-G-H，T代表的蛋白序列为生物亲和标签；S代表的蛋白序列为蛋白酶酶切位点；X代表一个氨基酸；G代表GLP-1类似物蛋白；H代表人血清白蛋白。该设计通过生物制备后经酶切获得N端均一的GLP-1类似物样品，提高生物样品的均一性和活性。并构建稳定表达这类重组蛋白的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）稳定表达株。本发明制备的新颖重组蛋白具有更高的生物学活性和更优的体内外稳定性。这类重组蛋白可用于治疗2型糖尿病及通过降低血浆葡萄糖而受益的其它疾病。可用于诱导细胞分化为β胰腺细胞的1型糖尿病的治疗。同时也可用于刺激神经***产生饱腹感和抑制胃蠕动而受益的其他疾病。

Description

GLP-1与人血清白蛋白重组蛋白的设计及稳定表达CHO细胞株的构建方法

技术领域

本发明利用基因工程手段，设计新颖的GLP-1与HSA的类似物。新颖的重组蛋白利用新型构建的高效表达质粒pMH₃，并在中国仓鼠细胞(CHO)中表达。获得了高活性和高表达的细胞株（CHO/pMH₃/TSXGGH）。获得的菌株产率高达9.45 μg*d^-1*10⁶cells。发酵表达产量高，纯化工艺方便，纯化所获得的产品符合原料药的要求。该药物用于糖尿病和相关疾病的治疗。

背景技术

2型糖尿病，又被称之为非胰岛素依赖糖尿病，缘于β细胞功能低下，胰岛素相对缺乏和胰岛素抵抗。近年来，2型糖尿病的患病率逐渐增加，据世界卫生组织预测，至2030年，全球将有3亿2型糖尿病患者。GLP-1药物能刺激β细胞的分化和增值，并且促进β细胞的分泌胰岛素的能力，而成为治疗2型糖尿病的关键药物。

GLP-1类似物成药的药物有Glaxo Smith Kline 公司生产的阿必鲁泰(Albugon)和Eli lily公司生产的艾塞那肽（exendin-4）。国内的长效GLP-1类似物还没有任何一个药物通过CFDA的批准上市。国外批准上市的药物有Glaxo Smith Kline 公司生产的阿必鲁泰(Albugon)和Eli lily公司生产的艾塞那肽（exendin-4），但他们在应用当中都有很明显的缺陷。阿必鲁泰因是与脂肪酸融合而变成长效药物因其制备方法而导致药物的单位活性损失100倍以上，而药物的半衰期却只有4-6 h左右，单位服用剂量大而使得患者的副作用增强。艾塞那肽是单一的蛋白药物，生物制备方法使得产品质量很好控制，但其药物的半衰期只有2 h而患者每天要注射两次，增加了患者的痛苦和副作用。

现在研究报道的人血清白蛋白与GLP-l类似物重组蛋白在酵母中表达，未考虑N末端一致性而提高药物高活性的问题。生物模拟计算和实验结果显示N末端的是GLP-1药物的活性区域，为保证N末端的一致性，本发明在新颖重组蛋白的N末端前添加His-tag标签，并在His-tag标签后加入蛋白酶位点（肠激酶DDDDK）。表达的重组蛋白6*His-DDDDK-X-GGH，纯化后经肠激酶酶切获得重组蛋白（fusion protein）。获得的重组蛋白的N末端一致，且活性高。

发明内容

本发明设计了一种重组蛋白并在中国仓鼠卵巢细胞（chinese hamster ovary, CHO）中制备方法，保证了N末端的一致性并且获得了高活性的药物蛋白。主要包含的发明内容包括以下几点。

（1）新颖GLP-1类似物的重组蛋白设计。GLP-1(A2G)- GLP-1(A2G)-HSA蛋白分别简写为GGH，设计XGGH蛋白（X代表一个氨基酸或无）。为表达N端一致性的目标蛋白，在蛋白的N端添加His-tag等生物标签（简称T），并在生物标签后加入肠激酶DDDDK等蛋白酶酶切位点（简称S）。通过基因工程手段获得TSXGGH的基因片段。附图中SEQ ID NO:1 GLP-1(A2G)- GLP-1(A2G)-HSA基因序列，SEQ ID NO:2 GLP-1(A2G)- GLP-1(A2G)-HSA蛋白序列。其它GLP-1类似物序列以此类推。

（2）高效表达质粒（pMH₃/TSXGGH）的构建。利用自行构建的高启动活性，高GC序列和poly A序列的质粒pMH₃（国际专利号：WO/2008/091276）。表达的重组蛋白为T（亲和标签）-S(蛋白酶位点)-X-GLP-1m-GLP-1m-HSA，将表达的重组蛋白简称TSXGGH。经EcoRⅠ和NotⅠ酶切PCR扩增产物并与pMH₃载体连接。构建表达细胞表达质粒pMH₃/TSXGGH。

（3）稳定表达CHO细胞株的筛选。所用的CHO细胞的贴壁培养基（D001）和悬浮培养基（B001）均为优化后的培养基。构建好的质粒经无内毒素试剂盒提取质粒后，经电转和梯度压力筛选获得表达菌株。重复低密度铺板和表型筛选四个循环后获得稳定且高表达的细胞株。稳定细胞株可以连续培养20代以上，表达量无明显变化。

（4）稳定表达CHO细胞株的悬浮驯化与发酵。筛选的8株稳定表达的细胞株，在B001中连续培养培养2个月，使得CHO细胞适应悬浮培养。按照1:3比例放大培养悬浮细胞，最后在10 L生物反应器中发酵培养连续发酵12 d。蛋白产率达4.58-9.43μg*d^-1*10⁶cells。

（5）药物蛋白纯化与活性检测。先通过Blue亲和柱调取含HSA的蛋白并除去大部分的杂蛋白。稀释溶液至电导与Ni离子柱等亲和柱上样液相同后，再通过Ni离子等亲和柱调取N端含His-tag的蛋白。经脱盐柱置换缓冲液，获得的蛋白通过肠激酶剪等蛋白酶酶切后终获得N端均一的目标蛋白。药物蛋白经体内外活性检测，均显示有很好的药效。

附图说明

图1：细胞株表达蛋白的Dot blot筛选图；挑选的单克隆细胞经Dot blot挑选高表达的克隆。

图2：细胞株表达蛋白的Western blot筛选图；挑选的8株高表达细胞株的GLP-1单抗的Western blot图，泳道1为阳性对品GGH。

图3：细胞株表达蛋白的Western blot筛选图；挑选的8株高表达细胞株的HSA单抗的Western blot图，泳道1为阳性对品GGH。

图4：CHO细胞株的10 L发酵罐过程监测。

图5：CHO细胞株表达药物蛋白的体外活性实验；在构建好的CHO/GLP-1R/CRE-fLUC细胞模型检测。

图6：CHO细胞株表达药物蛋白的体内活性实验；给药量为3 mg/kg。

具体实施方式

具体实施方法是本发明的制备途径之一，本发明还可以通过其他途径实施和应用，本发明可以在没有违背本发明的精神下进行修饰和改善。

具体实施方法1： GLP-1重组蛋白在CHO中的稳定株克隆和制备

实验材料

中国仓鼠卵巢细胞（CHO-S）；遗传霉素G418（sigma）；自己构建的表达载体pMH₃；自己配置的培养基，贴壁培养基（D001），悬浮培养基（B001），流加培养基（F001）；所用其它试剂皆为分析纯试剂。

实验仪器

电转仪；细胞培养箱；细胞摇床；10 L生物反应器；常规的一次性耗材。

实验步骤

（1）质粒提取

溶液配制：溶液I：50mM葡萄糖；25mM Tris-cl(pH 8.0)；10mM EDTA(pH 8.0)，配好后灭菌放在4℃。溶液II：0.2 mol/L NaoH；1%（m/L）的SDS，现用现配。0.4 mol/L NaoH与2%（m/L）的SDS等体积混匀。溶液III（100 mL）：5mol/L KAc 60 mL；冰醋酸11.5 ml；水28.5 mL。

操作步骤。培养12-16 h的新鲜菌液6-8 mL，12000 rpm 1min，吸掉管底残留培养基。溶液I 300 μL，用移液器吹打使菌体充分重悬。溶液II 300 μL，小心翻转EP管，待液体变清澈后，静置1 min。溶液III 300μL，小心的混匀，有大量的白色絮状析出（液体是透明的）。12000 rpm离心15 min，移上清至一新EP管中，再重复一遍。加异丙醇至1.5 mL，-20℃，10min。12000 rpm离心25 min。在管里加1mL的75%乙醇漂洗沉淀，倒掉乙醇，晾干。加入超纯水溶解，加入适量RNA酶，37℃ 1 h。按体积比1:1加入苯酚，剧烈混匀，静置2 min。12000 rpm离心10 min，小心吸取上清至一新EP管。按体积比1:1加入氯仿，剧烈混匀，静置2 min。12000 rpm离心10 min，小心吸取上清至一新EP管。在上清中加入75μL3M的NaAc，加异丙醇至1.5 mL，-20℃，10min。12000 rpm离心25 min，倒掉上清，加入1mL的75%乙醇漂洗。12000 rpm离心2 min，倒掉乙醇，晾干。溶于适量的超纯水中（100μL左右）。

（2）细胞转染

准备高浓度无内毒素质粒，收集CHO细胞。配置电转反应体系：200 μL细胞悬液+20 μg质粒+10 μg鲑鱼精DNA(提高转染效率)，混匀后加入2 mm电极杯中。将电极杯冰浴1 min，250V，12 mS电击一次，冰浴1 min。两个dish中各加入10 mL的培养基（D001含10% FBS），将电极杯中的悬液均分至两个dish中。

（3）克隆筛选

待dish细胞生长两天贴壁后，换液（D001+6%FBS）加压，加G418浓度为1.2-1.8mg/mL。有大量死细胞直接换液不加压，待克隆长出。细胞单克隆长至合适大小，准备挑克隆。将克隆挑至96孔板中。置培养箱中培养，待克隆长至铺满80%孔底，通过Dot blot(附图1)和WB（附图2、图3）检测表达情况。挑选阳性克隆继续放大贴壁培养，继续讲阳性克隆消化后放置在dish中加压培养，待长出克隆可见后据需挑至96孔板中通过Dot blot和WB检测表达情况。

（4）细胞悬浮驯化

选择8个阳性克隆，将细胞转移至T75培养瓶中培养，待细胞汇合度至90%左右时，将两瓶T75细胞消化，合并转移至40mL摇瓶中，加入30mL悬浮培养液B001悬浮驯化。连续培养2个月，挑选最终适应悬浮培养的细胞株作为工程菌株。

（5）Dot blot检测

收集样本，一般为细胞培养液上清；点膜，使用NC膜或PVDF膜（需泡甲醇），按照样品顺序点膜，5uL/点，设置阴性对照（空培养液、空细胞培养液）和阳性对照（稀释梯度），并用圆珠笔做好标记；将膜置37℃烘干，约10-15min；封闭，用TBST配制5%脱脂奶粉，室温摇床封闭1h；TBST洗涤1-2次；一抗（TBST配制）孵育1h；TBST洗涤三次，每次10min；二抗（TBST配制）孵育1h；TBST洗涤三次，每次10min；ECL显影。

（6）Western blot检测

收集样本，一般为细胞培养液上清。样品处理，加入相应量的Loading buffer，煮沸5min；SDS-PAGE电泳；转膜，电泳完后，将胶小心剥下，与滤纸、纤维垫、硝酸纤维膜按正确顺序装好，-20℃浸泡于转移缓冲液40 min；装好转移电泳盒，放入转子、冰盒，接好电源，在磁力搅拌器上50-100V恒压转移1h；转移完成后拆去转移装置，揭下膜，标记好正反面（膜与胶贴着的一面为正面），放入丽春红染液染色5-10 min，取出，去离子水洗去浮色，观察转移效果，丽春红染色可做可不做；加入封闭液，4 ℃过夜，或室温1h；TBST洗膜1-2次；用TBST稀释一抗，置于水平摇床上室温孵育1 h；TBST洗涤三次，每次10min；用TBST稀释二抗，置于水平摇床上室温孵育1 h；TBST洗涤三次，每次10minECL显色。

（7）稳定细胞株的10 L生物反应器发酵表达

装液量为6 L，准备1 L种子液，密度为4.0×10⁶个/mL。转速为110 rpm，pH控制为7.2，培养温度为37℃。通过调节氧气和二氧化碳的通气量保证溶氧控制在30~60%之间。待细胞密度长为9.0×10⁶个/mL后，降低温度流加F001继续培养10 d（图4）。结果显示，在发酵罐中前三天细胞密度每天翻倍增长，第三天细胞密度高达8.78*10⁶ cell/mL。第三天后降温细胞密度变化不大，细胞开始大量生产目的蛋白，发酵后期细胞死亡率增加，蛋白积累量减少，最终的蛋白浓度可达到487 mg/L。

（8）重组蛋白的纯化

发酵液8000 rpm、10 min离心获得上清液，用0.45 μm的膜过滤除菌。用截留分子量10 kDa的超滤仪超滤浓缩5~12倍。第一步选用Blue Sepharose，0.1 mol/L NaCl（pH 6.0~9.0）平衡，用浓缩液上样，淋洗平衡。2 mol/L NaCl（pH 6.0~9.0）为B液，以100%B液梯度洗脱。第二部稀释收集的洗脱液，经过Ni Sepharose亲和层析，收集100 mmol/L 咪唑的洗脱液。最后一步经G25 Sepharose离子层析置换缓冲液。置换后的纯化蛋白经肠激酶剪切后，再经过Ni Sepharose亲和层析流穿液即为最终制备的样品。

整个纯化工艺步骤衔接较好，上一步层析的洗脱液只需要稍微的调节便可作为下一步的层析上样液。减少中间处理步骤，便于工业化操作和减少中间操作带来的污染。

（9）重组蛋白的活性检测

体外细胞模型活性检测：脂质体顺转：optiwcly 100μL中加入1.5μg/mL GLP-1R质粒和0.5μg/mL CRE/Luc置15min，加至HEK293细胞中，培养过夜。细胞铺于96孔板中（80*10⁴个/mL），过夜培养至90%-95%汇合度即可，每孔100μL。将培养基吸走，加入DMEM和药物的刺激液各100μL，孵育4h。吸走培养基，每孔加50μL裂解液，于水平摇床震荡30min。吸取30μL裂解液与配制好的15μL检测液混合，加入96孔板，摇床震荡15min，检测OD₅₆₀。结果显示CHO表达的药物蛋白可以刺激胞内的cAMP含量提升并刺激荧光蛋白（Luc）的提高，结果见附图5。

体内活性检测：取体重22-25 g雄性KM小鼠50只，随机分为：正常组，Exendin-4组(0.125mg/Kg)，GGH高剂量组(6.0 mg/kg)和低剂量组(3 mg/kg)。小鼠禁食(不禁水)过夜后，各组灌胃给药，正常组给生理盐水。3各组小鼠灌胃给予1.5 g/kg葡萄糖溶液后立刻尾静脉注射Exendin-4和不同剂量的GGH。注射后20、40、60 min、80 min、100min的血糖值。结果显示，相对于对照组，实验组的血糖水平长时间的得到控制，结果见附图6。

SEQ ID NO:1

1 CACCACCACC ATCACCATGA TGACGATGAC AAGCACGGTG AAGGTACTTT CACTTCTGAT

61 GTTTCTTCTT ACTTGGAAGG TCAAGCTGCT AAGGAGTTCA TTGCTTGGTT GGTTAAGGGT

121 AGACACGGTG AAGGTACTTT CACTTCTGAT GTTTCTTCTT ACTTGGAAGG TCAAGCTGCT

181 AAGGAGTTCA TTGCTTGGTT GGTTAAGGGT AGAGATGCAC ACAAGAGTGA GGTTGCTCAT

241 CGATTTAAAG ATTTGGGAGA AGAAAATTTC AAAGCCTTGG TGTTGATTGC CTTTGCTCAG

301 TATCTTCAGC AGTGTCCATT TGAAGATCAT GTAAAATTAG TGAATGAAGT AACTGAATTT

361 GCAAAAACAT GTGTTGCTGA TGAGTCAGCT GAAAATTGTG ACAAATCACT TCATACCCTT

421 TTTGGAGACA AATTATGCAC AGTTGCAACT CTTCGTGAAA CCTATGGTGA AATGGCTGAC

481 TGCTGTGCAA AACAAGAACC TGAGAGAAAT GAATGCTTCT TGCAACACAA AGATGACAAC

541 CCAAACCTCC CCCGATTGGT GAGACCAGAG GTTGATGTGA TGTGCACTGC TTTTCATGAC

601 AATGAAGAGA CATTTTTGAA AAAATACTTA TATGAAATTG CCAGAAGACA TCCTTACTTT

661 TATGCCCCGG AACTCCTTTT CTTTGCTAAA AGGTATAAAG CTGCTTTTAC AGAATGTTGC

721 CAAGCTGCTG ATAAAGCTGC CTGCCTGTTG CCAAAGCTCG ATGAACTTCG GGATGAAGGG

781 AAGGCTTCGT CTGCCAAACA GAGACTCAAG TGTGCCAGTC TCCAAAAATT TGGAGAAAGA

841 GCTTTCAAAG CATGGGCAGT AGCTCGCCTG AGCCAGAGAT TTCCCAAAGC TGAGTTTGCA

901 GAAGTTTCCA AGTTAGTGAC AGATCTTACC AAAGTCCACA CGGAATGCTG CCATGGAGAT

961 CTGCTTGAAT GTGCTGATGA CAGGGCGGAC CTTGCCAAGT ATATCTGTGA AAATCAAGAT

1021 TCGATCTCCA GTAAACTGAA GGAATGCTGT GAAAAACCTC TGTTGGAAAA ATCCCACTGC

1081 ATTGCCGAAG TGGAAAATGA TGAGATGCCT GCTGACTTGC CTTCATTAGC TGCTGATTTT

1141 GTTGAAAGTA AGGATGTTTG CAAAAACTAT GCTGAGGCAA AGGATGTCTT CCTGGGCATG

1201 TTTTTGTATG AATATGCAAG AAGGCATCCT GATTACTCTG TCGTGCTGCT GCTGAGACTT

1261 GCCAAGACAT ATGAAACCAC TCTAGAGAAG TGCTGTGCCG CTGCAGATCC TCATGAATGC

1321 TATGCCAAAG TGTTCGATGA ATTTAAACCT CTTGTGGAAG AGCCTCAGAA TTTAATCAAA

1381 CAAAATTGTG AGCTTTTTGA GCAGCTTGGA GAGTACAAAT TCCAGAATGC GCTATTAGTT

1441 CGTTACACCA AGAAAGTACC CCAAGTGTCA ACTCCAACTC TTGTAGAGGT CTCAAGAAAC

1501 CTAGGAAAAG TGGGCAGCAA ATGTTGTAAA CATCCTGAAG CAAAAAGAAT GCCCTGTGCA

1561 GAAGACTATC TATCCGTGGT CCTGAACCAG TTATGTGTGT TGCATGAGAA AACGCCAGTA

1621 AGTGACAGAG TCACCAAATG CTGCACAGAA TCCTTGGTGA ACAGGCGACC ATGCTTTTCA

1681 GCTCTGGAAG TCGATGAAAC ATACGTTCCC AAAGAGTTTA ATGCTGAAAC ATTCACCTTC

1741 CATGCAGATA TATGCACACT TTCTGAGAAG GAGAGACAAA TCAAGAAACA AACTGCACTT

1801 GTTGAGCTCG TGAAACACAA GCCCAAGGCA ACAAAAGAGC AACTGAAAGC TGTTATGGAT

1861 GATTTCGCAG CTTTTGTAGA GAAGTGCTGC AAGGCTGACG ATAAGGAGAC CTGCTTTGCC

1921 GAGGAGGGTA AAAAACTTGT TGCTGCAAGT CAAGCTGCCT TAGGCTTATA A

SEQ ID NO:2

1 HisHisHisHisHisHisAspAspAspAspLysHisGlyGluGlyThrPheThrSerAsp

21 ValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGly

41 ArgHisGlyGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAla

61 LysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgAspAlaHisLysSerGluValAlaHis

81 ArgPheLysAspLeuGlyGluGluAsnPheLysAlaLeuValLeuIleAlaPheAlaGln

101 TyrLeuGlnGlnCysProPheGluAspHisValLysLeuValAsnGluValThrGluPhe

121 AlaLysThrCysValAlaAspGluSerAlaGluAsnCysAspLysSerLeuHisThrLeu

141 PheGlyAspLysLeuCysThrValAlaThrLeuArgGluThrTyrGlyGluMETAlaAsp

161 CysCysAlaLysGlnGluProGluArgAsnGluCysPheLeuGlnHisLysAspAspAsn

181 ProAsnLeuProArgLeuValArgProGluValAspValMETCysThrAlaPheHisAsp

201 AsnGluGluThrPheLeuLysLysTyrLeuTyrGluIleAlaArgArgHisProTyrPhe

221 TyrAlaProGluLeuLeuPhePheAlaLysArgTyrLysAlaAlaPheThrGluCysCys

241 GlnAlaAlaAspLysAlaAlaCysLeuLeuProLysLeuAspGluLeuArgAspGluGly

261 LysAlaSerSerAlaLysGlnArgLeuLysCysAlaSerLeuGlnLysPheGlyGluArg

281 AlaPheLysAlaTrpAlaValAlaArgLeuSerGlnArgPheProLysAlaGluPheAla

301 GluValSerLysLeuValThrAspLeuThrLysValHisThrGluCysCysHisGlyAsp

321 LeuLeuGluCysAlaAspAspArgAlaAspLeuAlaLysTyrIleCysGluAsnGlnAsp

341 SerIleSerSerLysLeuLysGluCysCysGluLysProLeuLeuGluLysSerHisCys

361 IleAlaGluValGluAsnAspGluMETProAlaAspLeuProSerLeuAlaAlaAspPhe

381 ValGluSerLysAspValCysLysAsnTyrAlaGluAlaLysAspValPheLeuGlyMET

401 PheLeuTyrGluTyrAlaArgArgHisProAspTyrSerValValLeuLeuLeuArgLeu

421 AlaLysThrTyrGluThrThrLeuGluLysCysCysAlaAlaAlaAspProHisGluCys

441 TyrAlaLysValPheAspGluPheLysProLeuValGluGluProGlnAsnLeuIleLys

461 GlnAsnCysGluLeuPheGluGlnLeuGlyGluTyrLysPheGlnAsnAlaLeuLeuVal

481 ArgTyrThrLysLysValProGlnValSerThrProThrLeuValGluValSerArgAsn

501 LeuGlyLysValGlySerLysCysCysLysHisProGluAlaLysArgMETProCysAla

521 GluAspTyrLeuSerValValLeuAsnGlnLeuCysValLeuHisGluLysThrProVal

541 SerAspArgValThrLysCysCysThrGluSerLeuValAsnArgArgProCysPheSer

561 AlaLeuGluValAspGluThrTyrValProLysGluPheAsnAlaGluThrPheThrPhe

581 HisAlaAspIleCysThrLeuSerGluLysGluArgGlnIleLysLysGlnThrAlaLeu

601 ValGluLeuValLysHisLysProLysAlaThrLysGluGlnLeuLysAlaValMETAsp

621 AspPheAlaAlaPheValGluLysCysCysLysAlaAspAspLysGluThrCysPheAla

641 GluGluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGlnAlaAlaLeuGlyLeu

SEQ ID NO:1

1 CACCACCACC ATCACCATGA TGACGATGAC AAGCACGGTG AAGGTACTTT CACTTCTGAT

61 GTTTCTTCTT ACTTGGAAGG TCAAGCTGCT AAGGAGTTCA TTGCTTGGTT GGTTAAGGGT

121 AGACACGGTG AAGGTACTTT CACTTCTGAT GTTTCTTCTT ACTTGGAAGG TCAAGCTGCT

181 AAGGAGTTCA TTGCTTGGTT GGTTAAGGGT AGAGATGCAC ACAAGAGTGA GGTTGCTCAT

241 CGATTTAAAG ATTTGGGAGA AGAAAATTTC AAAGCCTTGG TGTTGATTGC CTTTGCTCAG

301 TATCTTCAGC AGTGTCCATT TGAAGATCAT GTAAAATTAG TGAATGAAGT AACTGAATTT

361 GCAAAAACAT GTGTTGCTGA TGAGTCAGCT GAAAATTGTG ACAAATCACT TCATACCCTT

421 TTTGGAGACA AATTATGCAC AGTTGCAACT CTTCGTGAAA CCTATGGTGA AATGGCTGAC

481 TGCTGTGCAA AACAAGAACC TGAGAGAAAT GAATGCTTCT TGCAACACAA AGATGACAAC

541 CCAAACCTCC CCCGATTGGT GAGACCAGAG GTTGATGTGA TGTGCACTGC TTTTCATGAC

601 AATGAAGAGA CATTTTTGAA AAAATACTTA TATGAAATTG CCAGAAGACA TCCTTACTTT

661 TATGCCCCGG AACTCCTTTT CTTTGCTAAA AGGTATAAAG CTGCTTTTAC AGAATGTTGC

721 CAAGCTGCTG ATAAAGCTGC CTGCCTGTTG CCAAAGCTCG ATGAACTTCG GGATGAAGGG

781 AAGGCTTCGT CTGCCAAACA GAGACTCAAG TGTGCCAGTC TCCAAAAATT TGGAGAAAGA

841 GCTTTCAAAG CATGGGCAGT AGCTCGCCTG AGCCAGAGAT TTCCCAAAGC TGAGTTTGCA

901 GAAGTTTCCA AGTTAGTGAC AGATCTTACC AAAGTCCACA CGGAATGCTG CCATGGAGAT

961 CTGCTTGAAT GTGCTGATGA CAGGGCGGAC CTTGCCAAGT ATATCTGTGA AAATCAAGAT

1021 TCGATCTCCA GTAAACTGAA GGAATGCTGT GAAAAACCTC TGTTGGAAAA ATCCCACTGC

1081 ATTGCCGAAG TGGAAAATGA TGAGATGCCT GCTGACTTGC CTTCATTAGC TGCTGATTTT

1141 GTTGAAAGTA AGGATGTTTG CAAAAACTAT GCTGAGGCAA AGGATGTCTT CCTGGGCATG

1201 TTTTTGTATG AATATGCAAG AAGGCATCCT GATTACTCTG TCGTGCTGCT GCTGAGACTT

1261 GCCAAGACAT ATGAAACCAC TCTAGAGAAG TGCTGTGCCG CTGCAGATCC TCATGAATGC

1321 TATGCCAAAG TGTTCGATGA ATTTAAACCT CTTGTGGAAG AGCCTCAGAA TTTAATCAAA

1381 CAAAATTGTG AGCTTTTTGA GCAGCTTGGA GAGTACAAAT TCCAGAATGC GCTATTAGTT

1441 CGTTACACCA AGAAAGTACC CCAAGTGTCA ACTCCAACTC TTGTAGAGGT CTCAAGAAAC

1501 CTAGGAAAAG TGGGCAGCAA ATGTTGTAAA CATCCTGAAG CAAAAAGAAT GCCCTGTGCA

1561 GAAGACTATC TATCCGTGGT CCTGAACCAG TTATGTGTGT TGCATGAGAA AACGCCAGTA

1621 AGTGACAGAG TCACCAAATG CTGCACAGAA TCCTTGGTGA ACAGGCGACC ATGCTTTTCA

1681 GCTCTGGAAG TCGATGAAAC ATACGTTCCC AAAGAGTTTA ATGCTGAAAC ATTCACCTTC

1741 CATGCAGATA TATGCACACT TTCTGAGAAG GAGAGACAAA TCAAGAAACA AACTGCACTT

1801 GTTGAGCTCG TGAAACACAA GCCCAAGGCA ACAAAAGAGC AACTGAAAGC TGTTATGGAT

1861 GATTTCGCAG CTTTTGTAGA GAAGTGCTGC AAGGCTGACG ATAAGGAGAC CTGCTTTGCC

1921 GAGGAGGGTA AAAAACTTGT TGCTGCAAGT CAAGCTGCCT TAGGCTTATA A

SEQ ID NO:2

1 HisHisHisHisHisHisAspAspAspAspLysHisGlyGluGlyThrPheThrSerAsp

21 ValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGly

41 ArgHisGlyGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAla

61 LysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgAspAlaHisLysSerGluValAlaHis

81 ArgPheLysAspLeuGlyGluGluAsnPheLysAlaLeuValLeuIleAlaPheAlaGln

101 TyrLeuGlnGlnCysProPheGluAspHisValLysLeuValAsnGluValThrGluPhe

121 AlaLysThrCysValAlaAspGluSerAlaGluAsnCysAspLysSerLeuHisThrLeu

141 PheGlyAspLysLeuCysThrValAlaThrLeuArgGluThrTyrGlyGluMETAlaAsp

161 CysCysAlaLysGlnGluProGluArgAsnGluCysPheLeuGlnHisLysAspAspAsn

181 ProAsnLeuProArgLeuValArgProGluValAspValMETCysThrAlaPheHisAsp

201 AsnGluGluThrPheLeuLysLysTyrLeuTyrGluIleAlaArgArgHisProTyrPhe

221 TyrAlaProGluLeuLeuPhePheAlaLysArgTyrLysAlaAlaPheThrGluCysCys

241 GlnAlaAlaAspLysAlaAlaCysLeuLeuProLysLeuAspGluLeuArgAspGluGly

261 LysAlaSerSerAlaLysGlnArgLeuLysCysAlaSerLeuGlnLysPheGlyGluArg

281 AlaPheLysAlaTrpAlaValAlaArgLeuSerGlnArgPheProLysAlaGluPheAla

301 GluValSerLysLeuValThrAspLeuThrLysValHisThrGluCysCysHisGlyAsp

321 LeuLeuGluCysAlaAspAspArgAlaAspLeuAlaLysTyrIleCysGluAsnGlnAsp

341 SerIleSerSerLysLeuLysGluCysCysGluLysProLeuLeuGluLysSerHisCys

361 IleAlaGluValGluAsnAspGluMETProAlaAspLeuProSerLeuAlaAlaAspPhe

381 ValGluSerLysAspValCysLysAsnTyrAlaGluAlaLysAspValPheLeuGlyMET

401 PheLeuTyrGluTyrAlaArgArgHisProAspTyrSerValValLeuLeuLeuArgLeu

421 AlaLysThrTyrGluThrThrLeuGluLysCysCysAlaAlaAlaAspProHisGluCys

441 TyrAlaLysValPheAspGluPheLysProLeuValGluGluProGlnAsnLeuIleLys

461 GlnAsnCysGluLeuPheGluGlnLeuGlyGluTyrLysPheGlnAsnAlaLeuLeuVal

481 ArgTyrThrLysLysValProGlnValSerThrProThrLeuValGluValSerArgAsn

501 LeuGlyLysValGlySerLysCysCysLysHisProGluAlaLysArgMETProCysAla

521 GluAspTyrLeuSerValValLeuAsnGlnLeuCysValLeuHisGluLysThrProVal

541 SerAspArgValThrLysCysCysThrGluSerLeuValAsnArgArgProCysPheSer

561 AlaLeuGluValAspGluThrTyrValProLysGluPheAsnAlaGluThrPheThrPhe

581 HisAlaAspIleCysThrLeuSerGluLysGluArgGlnIleLysLysGlnThrAlaLeu

601 ValGluLeuValLysHisLysProLysAlaThrLysGluGlnLeuLysAlaValMETAsp

621 AspPheAlaAlaPheValGluLysCysCysLysAlaAspAspLysGluThrCysPheAla

641 GluGluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGlnAlaAlaLeuGlyLeu

Claims

1.一种GLP-1类似物蛋白质的设计方法，其特征为：蛋白序列结构为T-S-X-GGH；其中T代表的蛋白序列为生物亲和标签；S代表的蛋白序列为蛋白酶酶切位点；X代表一个氨基酸；G代表GLP-1类似物蛋白；H代表人血清白蛋白。

2.如权利要求1所述的设计方法，其特征为：T代表的蛋白序列为亲和标签蛋白序列，优先为His-tag、His-flag、GST-tag、MBP-tag、Strep-tag中的一种，但不仅局限于所列举的亲和蛋白标签。

3.如权利要求1所述的设计方法，其特征为：S代表的蛋白序列为蛋白酶酶切位点的蛋白序列，优先为肠激酶酶切位点DDDDK、凝血酶酶切位点LVPRGS、凝血因子Xa即IE/DGR、烟草蚀纹病毒蛋白酶ENLYFQ中的一种，但不仅局限于所列举的蛋白酶酶切位点。

4. 如权利要求1所述的设计方法，其特征为：X代表的氨基酸为Gly、Pro、Arg、Val、Phe、Trp、Met、Lys、Ala和Tyr中的一种；优先选择Gly、Pro、Lys、Ala中的一种。

5. 如权利要求1所述的方法，其特征为，所设计的重组蛋白包含序列为以下的任何一种：T-S-GGH， T-S-X-GGH，X-GGH和GGH；T-S-GGH是T-S与GGH直接融合的蛋白，T-S-X-GGH为T-S，X和GGH按照权利1顺序融合的蛋白，X-GGH为X与GGH直接融合的蛋白，GGH为GLP-1类似物蛋白的二联体与人血清白蛋白的融合蛋白。

6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所设计的重组蛋白在中国仓鼠卵巢细胞CHO中进行表达，优选在CHO-S细胞中悬浮培养表达。

7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，由高效表达质粒pMH₃整合到CHO基因组中进行表达。

8. 如权利要求6所述的方法，其特征为：培养表达的培养基为优化后高效表达的培养基，CHO细胞的贴壁培养基为D001，悬浮培养基为B001，流加培养基为F001；按照1:3比例放大培养悬浮细胞，最后在10 L生物反应器中连续发酵12 d，蛋白产率高达4.58-9.43μg*d^-1*10⁶cells；发酵表达获得的重组蛋白，先通过Blue亲和柱Ni层析，再经脱盐柱置换缓冲液，再通过肠激酶剪切后获得N端均一的重组蛋白。

9. 如权利8所述的方法，其特征在于：制备获得的重组蛋白可用于2型糖尿病和通过降低血浆葡萄糖而受益的其它疾病的治疗；可用于诱导细胞分化为β胰腺细胞的1型糖尿病的治疗；可用于刺激神经***产生饱腹感和抑制胃蠕动而受益的其他疾病。