CN104399130A - 一种多孔脱细胞的组织工程软骨支架及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多孔脱细胞的组织工程软骨支架，即通过将组织工程软骨材料经过打孔处理后,利用脱细胞方法制备的组织工程软骨支架，使其不但具三维多孔性，而且具有较强生物力学性能及生物相容性。该组织工程软骨支架适用于负重区软骨缺损修复，将成为组织工程修复软骨缺损的重大突破。

Description

一种多孔脱细胞的组织工程软骨支架及制备方法

技术领域

本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及新型组织工程软骨支架及制备方法。

背景技术

因创伤、炎症、退变、肿瘤切除等原因导致的关节软骨损伤是临床上常见的疾病。关节软骨再生及修复能力极为有限,一旦损伤后,难以自身修复,病情继续发展,必然导致骨性关节炎。目前的治疗方法,如微骨折术、自体或异体骨膜、软骨膜、骨软骨块移植等,都存在着种种缺陷，从而限制了临床应用。随着十九世纪组织工程技术的出现，应用组织工程技术构建组织工程软骨或骨软骨复合体被认为解决这一问题最好的技术手段。

组织工程技术出现于十九世纪，是指利用生物活性物质，通过体外培养或构建的方法，再造或者修复器官及组织的技术。组织工程技术三要素：“种子细胞、支架和信号因子”。通过将种子细胞培养在生物材料支架上，然后移植到缺损部位形成新的组织,经过重塑形并与机体组织整合在一起,是组织工程修复组织损伤的基本方式。支架材料除了提供组织的三维几何形状,还为细胞提供了生存的微环境,支持细胞的粘附、增殖、分化并最终形成新生组织。所以如何得到三维的、多孔的、生物活性的支架是组织工程的关键环节。

目前用于软骨损伤修复的组织工程支架主要有两类，即人工合成材料和天然的细胞外基质。

人工合成的聚合物具有以下特点：良好的力学强度、满意的生物相容性、可控制的降解率。然而，合成聚合物的表面是疏水性的，缺乏内在生物活性。而且，PLGA等一些聚合物的酸性降解产物可能引起炎性反应。

相对于人工合成聚合物，传统天然材料软骨支架多是将软骨粉碎后通过冷冻干燥及交联方法等制备成为有三维多孔结构的支架，虽然保留了或者仿生了天然组织的主要生化成份，具有更好的生物活性和功能性，能利于种子细胞的识别、粘附、增殖和分化。但其初始力学强度较低，在复合细胞培养过程中出现“空心”现象，不能完全模拟天然软骨的各项性能。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种多孔脱细胞的组织工程软骨支架，即通过打孔技术制备多孔的脱细胞组织工程软骨支架，使其不但具三维多孔性，而且具有较强生物力学性能及生物相容性，该组织工程软骨支架适用于负重区软骨缺损修复，将成为组织工程修复软骨缺损的重大突破。

本发明的又一目的在于提供上述组织工程软骨支架的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种多孔脱细胞的组织工程软骨支架，是通过将组织工程软骨材料经过打孔处理后,利用脱细胞方法制备的组织工程软骨支架。

进一步地，将组织工程软骨材料经过打孔处理使其孔隙率达到50-98％，优选85％。为使其达到上述要求，打孔的深度、孔径及间隔，需根据所需的不同形状、薄厚的组织工程软骨进行调整，使孔能均匀分布于组织工程软骨上。

较高的孔隙率有利于细胞的增殖和分化，支架的孔隙率越高，内部细胞的增值数目越多，支架材料的表面积大，材料与细胞的可接触面积也更大，可进行更多的成软骨诱导因子的吸附及离子交换，促进软骨细胞在材料中的黏附和增殖以及软骨组织的生成。但孔隙率过大会影响材料的力学性能，还会影响其降解速率。

进一步地，上述的组织工程软骨材料可以是同种异体或异种动物的肩关节、膝关节、髋关节等关节内软骨。

进一步地，所述关节内软骨在打孔处理前进行分离、清洗并制备成软骨片，所软骨片可带有软骨下骨(即骨软骨复合体)或不带，软骨片的直径为1-40mm，厚度为0.1-20mm。

进一步地，打孔处理的孔径大小为10-1000μm，孔间距为10-1000μm。

进一步地，上述的脱细胞方法可以是化学试剂法(酸碱法、渗透法、去污剂法、聚乙二醇法、醇类法等)、物理法(冻融法、压力法、电击穿法等)、生物试剂法(酶处理法、非酶试剂法)。

一种多孔脱细胞的组织工程软骨材料的制备方法，包括以下步骤：

1)体外分离、清洗制备软骨组织薄片；

2)将制备的软骨组织薄片打孔处理后制备成多孔的组织工程软骨薄片；

3)将多孔的组织工程软骨薄片进行脱细胞处理，消除其免疫原性。

上述步骤1)中所指的软骨组织薄片，可来自同种异体、异种动物或人的关节软骨，软骨组织薄片直径1-40mm，厚度为0.1-20mm，将其用灭菌蒸馏水喷枪高压冲洗，尽量去除血液成分及脂肪组织。

上述步骤2)所述的打孔处理是指，应用打孔器对软骨组织薄片打孔，可以应用尖锐的机械力打孔器直接凿孔，如钻孔器、细针等，或是应用激光器进行激光打孔，可以是气体激光器、液体激光器、半导体激光器等。打孔的形状可以是锥形、椭圆形、圆柱形、正方形、长方形等形状，孔径大小为10-1000μm，孔间距为10-1000μm。

上述步骤3)中的脱细胞处理是指通过各种脱细胞方法(化学法、物理法、生物试剂等)将打孔后的组织工程软骨片进行脱细胞处理，制备无免疫原性的组织工程软骨支架。

上述制备方法，还包括：将制备好的组织工程软骨支架用Gamma射线辐照灭菌，辐照剂量为25kGy，辐照时间5-10小时。

本发明的多孔脱细胞的组织工程软骨支架与普通组织工程软骨支架相比具有以下优势：

1)多孔脱细胞的组织工程软骨支架，与正常软骨更为相近，有较好的生物力学性能，适用于负重区的软骨缺损修复，能够与宿主周围的软骨组织有较好的生物相容性给予力学支撑。

2)多孔脱细胞的组织工程软骨支架与相比其他组织工程支架能够更多的保留软骨内的基质成分，更接近正常软骨，能更有利于种子细胞在支架内生长，分化并保持软骨细胞的表型。

3)多孔的脱细胞组织工程软骨，材料获得容易，技术需求简单易操作，对软骨修复具有巨大的优势。

附图说明

图1.本发明激光打孔的组织工程软骨片的大体照片，图1(a)显示直径，图1(b)显示厚度(数字1和2之间为1cm，每一小格刻度为1mm)。

图2.本发明多孔脱细胞组织工程软骨的Hoechst 33258染色。

图3.本发明多孔脱细胞软骨片的HE染色。

图4.本发明多孔脱细胞组织工程软骨片的甲苯胺蓝染色。

图5.本发明多孔脱细胞组织工程软骨的电子显微镜扫描照片，图5(a)显示为打孔软骨片横截面电镜照片，图5(b)为打孔软骨片纵切面电镜照片。

图6.本发明多孔脱细胞组织工程软骨与正常关节软骨生物力学测试对照图。

图7.本发明多孔脱细胞组织工程软骨细胞毒性检验生长曲线，*P>0.05。

图8.原代的兔软骨细胞接种于本发明支架上7天后的live/dead染色图。

具体实施方式

实施例1

(1)取新鲜成年猪股骨髁的软骨，去除周围组织，灭菌蒸馏水喷枪高压冲洗，尽量去除血液成分及脂肪组织。

(2)将取得软骨用环钻制成直径4mm，厚度2mm的圆柱形软骨片5个(见图1)。

(3)置于-24℃中24h后，于-80℃冰箱冻存72h后取出。

(4)将制备好的组织工程软骨片浸泡于0.01MPBS缓冲液当中，经二氧化碳激光打孔器在上述浸泡的软骨片上进行打孔，孔径300μm，孔间距300μm，孔隙率为85％。

(5)打孔完毕后将步骤(4)中制备的多孔组织工程软骨片，用无菌三蒸水冲洗浸泡后，-20°冷冻24h后转入-80℃中冷冻72h后取出。

(6)将清洗后备用的组织工程软骨片置于10mM的Tris-HCl(含蛋白酶抑制剂)液中，7500rpm离心20min，清洗3遍；将离心后的组织工程软骨片中加入3％SDS清洗液中(内含蛋白酶抑制剂)，于37℃恒温震荡机上震荡48h，去除细胞成分，取出后4℃下用无菌PBS液，8000rmp，20min，离心冲洗3遍；冲洗后组织工程软骨在含1U/ml RNase A和50U/ml DNase I的消化酶液中，37℃消化24h后，7500rpm，7min，离心3次后取出。

(7)将取出的激光打孔的组织工程软骨片浸泡于蒸馏水连续冲洗72h后，将制备好的组织工程软骨支架用Gamma射线辐照灭菌，辐照剂量为25kGy，辐照时间5-10小时，4℃冰箱备用。

实施例2

将制备的支架冰冻切片，行Hoechst 33258染色(见图2)，无细胞核着色，说明软骨片脱细胞成功；HE染色(见图3)、甲苯胺蓝染色(见图4)，可见组织工程软骨支架的显微结构；扫描电镜显示了组织工程软骨支架的内部结构(见图5)。

将制备的组织工程软骨支架与相同大小的软骨组织进行生物力学测试，得到制备的软骨支架的压缩弹性模量为0.5734±0.021Mpa，与正常关节软骨(0.6875±0.013Mpa)虽有统计学差异(*P<0.05)，但较接近，证明制备的软骨支架有较好的生物力学强度，可用于修复负重区的软骨缺损(见图6)。

将小鼠成纤维细胞L929接种在96孔板内，设立三组，即阴性对照组，试验组，阳性对照组，阴性对照组内加入正常培养液，实验组内加入组织工程软骨的浸提液，阳性对照组加入二甲基亚砜，绘制CCK-8细胞生长曲线(见图7)，得出试验组与阴性对照组无统计学差异(*P>0.05)，与阳性对照组有显著性差异(*P<0.05)，说明制备的支架无细胞毒性。

将原代的兔软骨细胞接种于支架上7天后，通过live/dead(见图8)染色可发现细胞能够很好的在软骨孔内生长和增殖，有较好的生物效能。

上述三个实验具体实验方法可参见博士论文：

杨强.以软骨细胞外基质为基础构建组织工程软骨以及骨软骨复合体的实验研究:[D].北京：中国人民解放军军医进修学院.2008

通过上述实验证明我们制备的多孔的组织工程软骨支架脱细胞较成功，无免疫原性及细胞毒性，有较高的生物效能和良好的组织相容性，可称为组织工程软骨修复关节软骨损伤提供新的手段。

Claims (10)

1.一种多孔脱细胞的组织工程软骨支架，是通过将组织工程软骨材料经过打孔处理后,利用脱细胞方法制备的组织工程软骨支架。

2.如权利要求1所述的多孔脱细胞的组织工程软骨支架，其特征在于，所述组织工程软骨材料为同种异体或异种动物的关节内软骨，所述关节内软骨包括肩关节、膝关节或髋关节。

3.如权利要求2所述的多孔脱细胞的组织工程软骨支架，其特征在于，所述关节内软骨在打孔处理前进行分离、清洗并制备成软骨片，所述软骨片的直径为1-40mm，厚度为0.1-20mm。

4.如权利要求1所述的多孔脱细胞的组织工程软骨支架，其特征在于，打孔处理的孔径大小为10-1000μm，孔间距为10-1000μm。

5.如权利要求1所述的多孔脱细胞的组织工程软骨支架，其特征在于，所述的脱细胞方法包括化学试剂法、物理法或生物试剂法。

6.一种多孔脱细胞的组织工程软骨材料的制备方法，包括以下步骤：

1)体外分离、清洗制备软骨组织薄片；

2)将制备的软骨组织薄片打孔处理后制备成多孔的组织工程软骨薄片；

3)将多孔的组织工程软骨薄片进行脱细胞处理，消除其免疫原性。

7.如权利要求6所述的多孔脱细胞的组织工程软骨支架，其特征在于，步骤1)中所述软骨组织薄片来自同种异体、异种动物或人的关节软骨，所述软骨组织薄片直径1-40mm，厚度为0.1-20mm。

8.如权利要求6所述的多孔脱细胞的组织工程软骨支架，其特征在于，步骤2)所述的打孔处理是指应用打孔器对软骨组织薄片打孔，打孔的孔径大小为10-1000μm，孔间距为10-1000μm。

9.如权利要求6所述的多孔脱细胞的组织工程软骨支架，其特征在于，步骤3)中的脱细胞处理的方法包括化学试剂法、物理法或生物试剂法。

10.如权利要求6所述的多孔脱细胞的组织工程软骨支架，其特征在于，还包括：将制备好的组织工程软骨支架用Gamma射线辐照灭菌，辐照剂量为25kGy，辐照时间5-10小时。