CN104382948A - 乳酸乳球菌在治疗肠道疾病中的一种应用方法 - Google Patents

乳酸乳球菌在治疗肠道疾病中的一种应用方法 Download PDF

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杜斌
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Abstract

本发明属生物医药技术领域，具体涉及乳酸乳球菌在治疗肠道疾病中的一种应用方法。主要用于治疗肠道疾病如肠炎、肠道肿瘤等疾病。乳酸乳球菌不属于人和动物的正常微生物群，不会定植于口腔或胃肠道，在一定程度上避免了因为长期刺激形成的免疫耐受。而且乳酸乳球菌是位于胃肠道中的益生菌，本身不攻击肠黏膜，并且不引起强的免疫反应，因此非常适合治疗肠道疾病如肠炎、肠道肿瘤等疾病。

Description

乳酸乳球菌在治疗肠道疾病中的一种应用方法
技术领域
本发明公开了乳酸乳球菌在治疗肠道疾病中的一种应用方法，属于生物医药领域。 
背景技术
乳酸菌(lactis acid bacteria,LAB)是一群能大量发酵碳水化合物并产生乳酸的***,包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是一类长期应用于食品发酵业的有益微生物，这种食品级微生物能经受胃肠液考验并在人体内存活2～3天，其本身不攻击肠黏膜并且不引起强的免疫反应，其中最有前景的应用即是乳酸乳球菌作为活载体将治疗性蛋白或抗原传递至黏膜表面，继而同时诱导黏膜免疫和***免疫。乳酸乳球菌以其生长迅速、易于操作等优点成为表达外源蛋白、作为活载体疫苗传递抗原的理想选择。乳酸乳球菌不属于人和动物的正常微生物群，不会定植于口腔或胃肠道，在一定程度上避免了因为长期刺激形成的免疫耐受。 
肠道作为一个免疫器官，起着阻隔细菌和内毒素的屏障作用。正常情况下，胃肠道中绝大多数细菌是对人体有益的，我们称之为“益生菌”，可帮我们消化乳糖、降解并***多余胆固醇；为我们的机体提供多种维生素；刺激我们的免疫器官发育，并促使其功能不断地演进、完善，有益人体健康。益生菌与我们的胃肠道粘膜共同筑成了一道生态屏障，抵御和抗击各种外来的病原微生物，但在某些特定的情况下，如严重疾病、营养不良、过度疲劳或外来刺激时，机体的抵抗力会下降，一些原本无害的细菌可能会乘虚而入，对机体造成伤害，引起肠粘膜屏障功能下降。本实验成功重组了能够表达具有生物活性IL-12乳酸乳球菌，鉴于乳酸乳球菌是位于胃肠道中的益生菌，因此非常适合治疗肠道疾病如肠炎、肠道肿瘤等疾病。 
发明内容：
本发明公开了乳酸乳球菌在治疗肠道疾病中的一种应用方法，用于治疗肠道疾病如肠炎、肠道肿瘤等疾病。 
本发明通过以下实验证明乳酸乳球菌在治疗肠道疾病中的一种应用方法：在乳酸乳球菌中表达白细胞介素-12(IL-12)基因。用內切酶NSI(Nsi)和內切酶ECOR(EcoR)双酶切表达载体pGEM-IL-12后与经同样酶切的含有乳链杆菌肽A(nisA)启动子的表达载体pGEC-E7连接，从而构建成pSEC-IL-12质粒；经电击转化，将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中，转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养。用乳链杆菌肽(nisin)诱导白细胞介素-12表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PACE)、免疫印迹试验(Western blot)鉴定表达产物；用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测IL-12的量。建立了IL-12乳酸菌基因表达***。在nisin的诱导下，NZ9000能够产生并分泌IL-12约80ng/L。实验证明乳酸乳球菌能够表达一定数量的IL-12。成功重组了能够表达具有生物活性IL-12乳酸乳球菌，鉴于乳酸乳球菌为存在于胃肠道中的益生菌，因此非常适合于治疗肠道疾病如肠炎、肠道肿瘤等疾病。 
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。 
1质粒、菌株及培养条件：大肠杆菌DH5α用于质粒pSEC-E及其衍生质粒保存或扩增的标准菌株，乳酸乳球菌NZ9000用作IL-12基因重组表达质粒pGEC-IL-12的表达菌株。大肠杆菌用LB培养基、乳酸乳球菌及其电穿孔转化子用脑心浸液培养基培养。氨苄青霉素使用浓度为100mg/L，氯霉素使用浓度大肠杆菌为10mg/L、乳酸乳球菌为5mg/L。乳酸乳球菌是一类长期应用于食品发酵业的有益微生物，这种食品级微生物能经受胃肠液考验并在人体内存活2～3天，其本身不攻击肠黏膜并且不引起强的免疫反应。 
2重组质粒的构建及转化：重组质粒构建如下：用NSI I和EcoR I双酶切pGEM-IL-12质粒后，与经同样酶切的含有nisA启动子的pSEC-E7质粒连接，从而构建成pSEC-IL-12质粒，pSEC-IL-12质粒含有Usp45信号肽。乳酸乳球菌转化采用电穿孔转化法，脉冲参数为1.25kV/mm，25μF和200欧姆。重组质粒经电击转化乳酸乳球菌NZ9000，转化子在含有氯霉素的脑心浸液琼脂糖平板上生长。再从重组乳酸乳球菌中提取质粒pSEC-IL-12，进行电泳鉴定。在DH5α和NZ9000中提抽到的质粒DNA分子(条带1和2)与转化前的pSEC-IL-12(条带1)在Marker的对照下，条带处于同一位置高度，说明转化是成功的。 
3 HO-1基因在乳酸乳球菌中的诱导表达：含重组质粒pSEC-IL-12的乳酸乳球菌NZ9000在脑心浸液培养基中30℃静置培养过夜，用新鲜培养基1:50稀释，培养至OD600＝0.5时，加入诱导物Nisin至终浓度10mg/L，继续培养3h。终止培养后，取2ml培养菌液，4℃、8000r/min离心5min，上清液浓缩50倍后经电泳分离，通过Bio-Rad印迹仪转移至硝酸纤维素膜。以空载体Lactococcus lactis为对照，取1ml培养菌液用ELISA试剂盒测定IL-12的产量。由于NICE表达***具有食品级的诱导物和宿主菌、严谨性高、本底表达水平低、诱导效率高及表达产量高等优点，所以被广泛地用于外源性基因在乳酸乳球菌中表达。 
4 IL-12蛋白质的表达：在Nisin的诱导下，NZ9000能够产生并分泌rmIL-12约80ng/L，和野生菌比较，Western blot分析含目的基因的工程菌组在相应部位分子量处有条带出现，而野生菌组则不明显。由于具有自身分泌的蛋白少且不含质粒的菌株不产生胞外蛋白水解酶等优点，所以越来越多的将乳酸乳球菌作为异源性蛋白表达载体。如果把乳酸乳球菌用作人类或动物消化道中的蛋白载体，那么乳酸乳球菌能够分泌异源性蛋白则是更佳选择，因为这样将更有利于异源性蛋白与其靶位相互作用。正如其他革兰阳性细菌，乳酸乳球菌分泌的蛋白首先被合成前体蛋白，即含有信号肽和成熟的蛋白分子；然后宿主分泌***识别前体蛋白并将其跨膜转运；最后成熟蛋白释放至培养基中。因此，信号肽在乳酸乳球菌蛋白分泌中起至关重要作用。本实验成功重组了能够表达具有生物活性IL-12乳酸乳球菌，鉴于乳酸乳球菌为存在于胃肠道中的益生菌，因此非常适合于治疗肠道疾病如肠炎、肠道肿瘤等疾病。 
实例一 
临床上，有多种原因造成引起肠道菌群失调，肠屏障功能损伤，引起肠道炎症、肠道肿瘤等疾病。乳酸乳球菌能够有效减轻或改善肠道菌群的失调，控制肠道内环境的正常，对肠内环境具有保护作用，乳酸乳球菌在治疗肠道疾病，特别是在肠炎、肠道肿瘤等疾病中效果较好。治疗方法为口服咀嚼乳酸菌素片，3.6克/次，每天三次。 

Claims (2)

1.乳酸乳球菌在治疗肠道疾病中的一种应用方法。 
2.根据权利要求1所述的乳酸乳球菌在治疗肠道疾病中的一种应用方法，其特征在于：乳酸乳球菌是位于胃肠道中的益生菌，不会定植于口腔或胃肠道，在一定程度上避免了因为长期刺激形成的免疫耐受；而且乳酸乳球菌本身不攻击肠黏膜，并且不引起强的免疫反应，因此非常适合治疗肠道疾病如肠炎、肠道肿瘤等疾病。应用方法为口服咀嚼乳酸菌素片，3.6克/次，每天三次。 
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