CN104379742A

CN104379742A - 生产3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸的方法

Info

Publication number: CN104379742A
Application number: CN201380027849.1A
Authority: CN
Inventors: 正瑞文; 田岛义教; 横山敬一
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2013-03-05
Publication date: 2015-02-25
Also published as: EP2857510A1; US9447443B2; JP6183358B2; US20150079644A1; EP2857510A4; WO2013179711A1; JPWO2013179711A1

Abstract

本发明提供一种通过使用微生物的工艺便捷有效地生产3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的方法，所述化合物是稳定的化合物。具体地，本发明提供一种具有生产3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸能力的微生物，其经过修饰以增加自磷酸二羟基丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性，其中所述微生物经过修饰以增加N-羟基芳基胺-O-乙酰转移酶(NHoA)活性，以及提供一种使用该微生物生产3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的方法。

Description

生产3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸的方法

技术领域

本发明涉及一种生产3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸等的方法。

背景技术

氨基羟基苯甲酸型化合物可用作染料、农药、药物和其他合成有机产品中间体，以及用作具有高性能、耐热的聚合物聚苯并噁唑单体。3-氨基-4-羟基苯甲酸(3,4-AHBA)是用磷酸二羟丙酮(DHAP)和天冬氨酸半醛(ASA)作为底物，在GriI和GriH作用下通过两步反应而生物合成的，其中GriI是催化在具有氨基基团的C4化合物与C3或C4化合物之间发生碳-碳结合反应的酶，GriH是在脱羧的情况下催化C7化合物环化或C8化合物环化的酶。

[化学物1]

同时，3,4-AHBA不稳定且易氧化形成2-氨基吩噁嗪-3-酮-8-羧酸(2-aminophenoxazin-3-one-8-carboxylic acid，APOC)(见下文)。专利文献1描述了作为副产物形成的3,4-AHBA在3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸(3,4-AcAHBA)的生产中在培养基中随时间被转化为APOC。另一方面，3,4-AcAHBA比3,4-AHBA更加稳定。原因在于3,4-AcAHBA通过乙酰化作用而稳定，并能避免前述氧化作用。3,4-AcAHBA能够通过酸、碱等处理而容易转化为3,4-AHBA。3,4-AcAHBA较3,4-AHBA更易于处理，3,4-AHBA被氧化形成APOC，因而是不稳定的。因此，需要开发一种优良的生产3,4-AcAHBA的方法。

[化学物2]

以下可用作与本发明相关联的现有技术。

专利文献1描述了作为副产物形成的3,4-AHBA在3,4-AcAHBA生产中在培养基中随时间而被转化为APOC。专利文献1还公开了3,4-AcAHBA被脱乙酰化而形成3,4-AHBA。

专利文献2公开了通过使用导入有griI和griH的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)来形成3,4-AHBA。

非专利文献1公开了通过将griI和griH导入大肠杆菌(Escherichia coli)中形成3,4-AHBA和3,4-AcAHBA。

非专利文献2公开了通过删除灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的芳基胺N-乙酰转移酶(natA)基因，培养物中不形成3,4-AcAHBA。

非专利文献3公开了源于大肠杆菌的N-羟基芳基胺-O-乙酰转移酶(nhoA)基因作用为催化芳香氨基的乙酰化。同时，非专利文献4公开了大肠杆菌BAP1株形成N-乙酰化产物(3,5-AcAHBA)作为3,5-AHBA(3,4-AHBA的结构异构体)的副产物，还公开了想得到NhoA并非3,5-AHBA乙酰化的主要因素，因为3,4-AcAHBA也作为副产品形成于大肠杆菌BAP1的NhoA基因缺失菌株(MAR1株)中。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：JP 2004-283163-A

专利文献2：国际公开文本WO2010/005099

非专利文献

非专利文献1：J.Biol.Chem.281(2006)，36944-36951

非专利文献2：J.Bacteriol.189(2007)，2155-2159

非专利文献3：Biochim.Biophys.Acta.1475(2000)，10-16

非专利文献4：J.Antibiot.，vol.59(2006)，p.464

发明概述

本发明要解决的问题

本发明是根据现有技术中的这种实际情况作出，并且本发明的一个目的是提供一种通过使用微生物的工艺便捷有效地生产作为稳定化合物的3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的方法。

解决问题的方法

作为深入研究的结果，本申请的发明人已发现，nhoA参与在大肠杆菌中3,4-AcAHBA自3,4-AHBA作为副产物生成。本申请的发明人还发现可通过使用修饰为增加NhoA活性的微生物等，在没有作为副产物AHBA的生成的情况下形成AcAHBA，并完成了本发明。

也就是说，本发明如下：

[1]一种具有生产3-氨基-4-羟基苯甲酸的能力的微生物，其经过修饰而增加了自磷酸二羟基丙酮和天冬氨酸半醛生成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性，其中所述微生物经过修饰以增加N-羟基芳基胺O-乙酰转移酶(NhoA)活性。

[2]根据[1]的微生物，其中所述N-羟基芳基胺-O-乙酰转移酶活性的增加是通过用含有编码NhoA的DNA的重组载体进行转化而赋予的。

[3]根据[2]的微生物，其中所述NhoA是以下(I)至(III)中任一种的蛋白：

(I)包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白；

(II)包含在SEQ ID NO：2氨基酸序列上具有一个或几个氨基酸取代、缺失、***或添加的氨基酸序列，并具有N-羟基芳基胺O-乙酰转移酶活性的蛋白；或

(III)包含与SEQ ID NO：2氨基酸序列具有70％或更多同一性的氨基酸序列，并具有N-羟基芳基胺O-乙酰转移酶活性的蛋白。

[4]根据[2]的微生物，其中所述编码NhoA的DNA是以下(i)至(iii)中任一种的DNA：

(i)包含SEQ ID NO：3核苷酸序列的DNA；

(ii)在严格条件下与同SEQ ID NO：3核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交并编码具有N-羟基芳基胺-O-乙酰转移酶活性的蛋白的DNA；或

(iii)包含与SEQ ID NO：3核苷酸序列具有70％或更多同一性的核苷酸序列并编码具有N-羟基芳基胺-O-乙酰转移酶活性的蛋白的DNA。

[5]根据[1]至[4]中任一项的微生物，其中所述微生物属于埃希氏菌属(Escherichia)，泛菌属(Pantoea)或棒杆菌属(Corynebacterium)。

[6]根据[1]至[5]中任一项的微生物，其中所述微生物属于大肠杆菌(Escherichia coli)，菠萝泛菌(Pantoea ananatis)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

[7]根据[1]至[6]中任一项的微生物，其中所述生产3-氨基-4-羟基苯甲酸的能力是通过用包含编码以下蛋白的DNA的重组载体进行转化而赋予的，所述蛋白具有自磷酸二羟基丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性。

[8]根据[7]的微生物，其中所述具有形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性的蛋白是GriI和GriH。

[9]根据[8]的微生物，其中所述GriI是以下(A)至(C)中任一种的蛋白，且所述GriH是以下(D)至(F)中任一种的蛋白：

(A)包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：18氨基酸序列的蛋白；

(B)包含在上述(A)所示氨基酸序列上具有一个或几个氨基酸取代、缺失、***或添加的氨基酸序列并具有醛缩酶活性的蛋白；

(C)包含与上述(A)所示氨基酸序列具有70％或更多同一性的氨基酸序列并具有醛缩酶活性的蛋白；

(D)包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：20氨基酸序列的蛋白；

(E)包含在上述(D)所示氨基酸序列上具有一个或几个氨基酸取代、缺失、***或添加的氨基酸序列并具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性的蛋白；和

(F)包含与上述(D)所示氨基酸序列具有70％或更多同一性的氨基酸序列并具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性的蛋白。

[10]根据[7]的微生物，其中编码具有形成3-氨基-4-羟基苯甲酸活性的蛋白的DNA是以下(a)至(c)中任一种的DNA，且所述griH基因是以下(d)至(f)中任一种的DNA：

(a)包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：19核苷酸序列的DNA；

(b)在严格条件下与同上述(a)所示核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交并编码具有醛缩酶活性的蛋白的DNA；

(c)与上述(a)所示的核苷酸序列具有70％或更多同一性并编码具有醛缩酶活性的蛋白的DNA；

(d)包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：21核苷酸序列的DNA；

(e)在严格条件下与同上述(d)所示核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交并编码具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性的蛋白的DNA；和

(f)与上述(d)所示的核苷酸序列具有70％或更多同一性并编码具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性的蛋白的DNA。

[11]一种生产3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的方法，包括培养根据[1]至[10]中任一项的微生物以形成所述3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物。

[12]一种生产3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的方法，包括以下(1)和(2)：

(1)通过根据[11]的方法形成3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物；并

(2)使所述3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物脱乙酰化以形成3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物。

[13]一种生产含有3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物作为组分的聚合物的方法，包含以下(1’)和(2’)：

(1’)通过根据[12]的方法形成3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物；并

(2’)聚合3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物以获得含有3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物作为组分的聚合物。

[14]根据[13]的方法，其中所述聚合物是聚苯并噁唑(polybenzoxazole)聚合物。

发明效果

根据本发明，可以便捷有效地生产作为稳定化合物的3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物。

附图简述

图1显示通过反相柱色谱法对(a)大肠杆菌

BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19株培养上清液，(b)大肠杆菌

BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19-NhoA株培养上清液，和(c)3,4-AHBA标准品的分析结果。

实施本发明的实施方案

本发明提供一种具有生产3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸能力的微生物。当使用本发明的微生物时，促进了3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸(3,4-AcAHBA)的形成，并因此可抑制作为未乙酰化产物的3-氨基-4-羟基苯甲酸(3,4-AHBA)在培养基中的累积。

<1>修饰为增加N-羟基芳基胺O-乙酰转移酶的活性(NhoA)

可以通过修饰本发明的微生物以提高N-羟基芳基胺O-乙酰转移酶(NhoA)的活性来促进3,4-AcAHBA的生产，并因此可以抑制培养基中3,4-AHBA的累积。所述NhoA活性是N-羟基芳基胺O-乙酰转移酶活性，是指与3,4-AHBA有关的从3-氨基-4-羟基苯甲酸(3,4-AHBA)形成3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸(3,4-AcAHBA)的活性。

“修饰为增加NhoA活性”是指NhoA的活性比未修饰的菌株(如微生物的野生株)的比活变得更高。与未修饰菌株的NhoA活性相比，所述NhoA的活性优选增加至每个微生物细胞为150％或更高，优选至每个微生物细胞为180％或更高，更优选至每个微生物细胞为200％或更高。本发明的微生物仅需要具有较野生菌株或未修饰的菌株更为增加的NhoA活性，但是本发明的微生物中3,4-AcAHBA的累积与这些菌株相比较有所提高是更为可取的。“修饰为增加NhoA活性”还对应于每个细胞中NhoA分子数增加的情况和每个分子的NhoA活性增加的情况，以及其他情况。具体地，所述修饰为增加NhoA活性可由常规的诱变或基因工程处理而引入。诱变的例子包括X射线和紫外线辐射，和使用诸如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍等致突变剂处理。所述修饰的例子可包括在染色体中向nhoA基因(包括表达调控区)引入突变从而NhoA的活性比非突变体菌株有所增加。优选地，所述修饰可通过向需要的微生物中转化包含编码具有NhoA活性的蛋白的DNA的重组载体实现。

可通过测量候选微生物菌株细胞抽提物或其纯化组分的酶活性，并使之与野生型菌株或未修饰菌株中的活性相比较确认目标酶活性及活性的增加程度。例如，可通过描述于Biochim.Biophys.Acta.1475(2000)，10-16的方法测量NhoA的活性。

修饰为增加NhoA活性的微生物可包括本来具有生产3,4-AHBA能力的微生物，以及尽管本来没有生产3,4-AHBA的能力，但已被赋予了生产3,4-AHBA的能力的微生物。所述生产3,4-AHBA的能力可通过随后描述的方法赋予。本发明中使用的微生物的例子可包括，但不限于，细菌、放线菌和真菌。所述微生物优选属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌、属于泛菌属(Pantoea)的细菌、或棒状细菌。

可以用于本发明的属于埃希氏菌属的细菌没有特别限定，且包含描述于，例如，由Neidhardt等写的书(Neidhardt，F.C.Ed.1996.Escherichia coli andSalmonella：Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp.2477-2483.Table 1.American Society for Microbiology Press，Washington，D.C.)中的那些菌株。大肠杆菌的例子可包括K12株(ATCC10798)或其亚株(例如，BW25113(CGSC7630)，DH1(ATCC33747)，MG1655(ATCC700926)，W3110(ATCC27325))，B菌株或其亚株(例如，BL21(ATCC BAA-1025)，REL606(CGSC12149))等。前述细菌菌株中具有CGSC号的菌株可获自大肠杆菌遗传库存中心(Coli Genetic Stock Center)(http://cgsc.biology.yale.edu/)。前述细菌菌株中那些具有ATCC号的菌株可获得自美国典型培养物保藏中心(http://www.atcc.org/)。

属于泛菌属的细菌是指细菌通过由微生物学专家所知的分类法被分入泛菌属。最近，基于对16S rRNA等核苷酸序列的分析(Int.J.Syst.Bacteriol.1993.43：162-173)，聚团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)的一些物种已被重新分类入成团泛菌(Pantoea agglomerans)、菠萝泛菌(Pantoeaananatis)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)等。本发明中，属于泛菌属的细菌也包括那些重新分类入泛菌属的此类细菌。泛菌属中代表性细菌菌株可包括菠萝泛菌、斯氏泛菌、成团泛菌、以及柠檬泛菌。其具体的例子可包括菠萝泛菌AJ13355株(FERM BP-6614)(欧洲专利申请公开号0952221)，菠萝泛菌AJ13356株(FERM BP-6615)(欧洲专利申请公开号No.0952221)等。这些细菌菌株在欧洲专利申请公开号0952221中被描述为属于成团肠杆菌的细菌，但基于前述对16S rRNA等核苷酸序列的分析，最近被重新分类入菠萝泛菌。

棒杆菌的组包含常规被分入短杆菌属(Brevibacterium)但现已被并入棒杆菌属(Corynebacterium)的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))，也包括那些与属于棒杆菌属的细菌关系密切的属于短杆菌属的细菌，且下述细菌被特别举例(国际公布WO2010/005099)：

嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidphilum)，

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)，

链烷醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)，

美棒杆菌(Corynebacterium callunae)，

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，

百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)(谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum))，

以栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)，

热产氨基棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)，

力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)，

扩展短杆菌(Brevibacterium divaricatum)(谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum))，

黄色棒杆菌(Brevibacterium flavum)(谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum))，

Brevibacterium immariophilum，

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)，

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)，

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)，

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)，

白色短杆菌(Brevibacterium album)，

蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)，和

嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)。

NhoA可包括与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，进一步地更优选95％过更高，特别优选98％或99％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有NhoA活性的蛋白。nhoA基因也可包括与SEQ ID NO：3所示核酸序列具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，进一步地更优选95％或更高，特别优选98％或99％或更高的同一性的核酸序列，并编码具有NhoA活性的基因。

氨基酸序列间或核酸序列间的同源性(例如，同一性或相似性)可以使用例如Karlin和Altschul的算法BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90，5873(1993))和Pearson的FASTA(Methods Enzymol.，183，63(1990))来确定。基于该算法BLAST，开发出被称为BLASTIN和BLASTX的程序(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。因此氨基酸序列间以及核酸序列间的同源性可以通过默认设定下使用这些程序计算。此外，可以使用如下的数值作为氨基酸序列间的同源性，所述数值通过以百分比计算获得，其使用ORF中编码的多肽的全长部分以比较单元大小(Unit Size to Compare)＝2的设置使用GENETYX Ver.7.0.9软件(其可购自Genetyx公司软件，采用Lipman-Pearson法)进行。可以采用源自这些计算的数值中的最低值作为氨基酸序列以及核苷酸序列的同源性。

nhoA基因的核苷酸序列有时是不同的，这取决于不同的微生物菌株。由nhoA基因编码的蛋白的例子可包括包含在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的一个或多个位置上具有一个或几个氨基酸的替换，缺失，***或添加的氨基酸序列，并具有NhoA活性的蛋白。这里“几个”基于氨基酸残基在蛋白三维结构上的位置或基于氨基酸残基的类型而变，但优选指1到100，更优选1到50，进一步地更优选1到30，最为优选1到20或1到10(如1，2，3，4或5)。所述取代，缺失，***，添加等包括基于具有nhoA基因的微生物的个体差异的天然存在的突变(突变体或变体)。

前述取代可以是保守取代，即不导致功能性变化的中性突变。所述保守突变是一类突变，其中当要取代的位点是芳香氨基酸时，所述取代相互发生在Phe，Trp和Tyr之间；当要取代的位点是一疏水氨基酸时，所述取代相互发生在Leu，Ile和Val之间；当要取代的位点是极性氨基酸时，所述取代相互发生在Gln和Asn之间；当要取代的位点是一碱性氨基酸时，所述取代相互发生在Lys，Arg和His之间；当要取代的位点是酸性氨基酸时，所述取代相互发生在Asp和Glue之间；当要取代的位点是具有羟基的氨基酸时，所述取代相互发生在Ser和Thr之间。更为具体的，所述保守取代可包括将Ala取代为Ser或Thr，将Arg取代为Gln，His或Lys，将Asn取代为Glu，Gln，Lys，His或Asp，将Asp取代为Asn，Glu，或Gln，将Cys取代为Ser或Ala，将Gln取代为Asn，Glu，Lys，His，Asp或Arg，将Glu取代为Gly，Asn，Gln，Lys或Asp，将Gly取代为Pro，将His取代为Asn，Lys，Gln，Arg或Tyr，将Ile取代为Leu，Met，Val或Phe，将Leu取代为Ile，Met，Val或Phe，将Lys取代为Asn，Glu，Gln，His或Arg，将Met取代为Ile，Leu，Val或Phe，将Phe取代为Trp，Tyr，Met，Ile或Leu，将Ser取代为Thr或Ala，将Thr取代为Ser或Ala，将Trp取代为Phe或Tyr，将Tyr取代为His，Phe或Trp，将Val取代为Met或Ile或Leu。

所述nhoA基因也可以是在严格条件下与同SEQ ID NO：3核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，并编码具有NhoA活性的蛋白的DNA。这里，“严格杂交”指一种形成所谓特异性的杂合物，而不形成非特异性杂合物的条件。一个实例为如下的条件，其中具有高同源性(同一性或相似性)，如具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，进一步地更优选95％或更高，以及特别优选98％或更高同源性的多核苷酸彼此杂交，而具有比所述同源性低的同源性的多核苷酸彼此不杂交。具体地，所述条件可包含在6×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)、约45℃杂交，紧接着在0.2×SSC和0.1％SDS中在50℃至65℃洗涤1或2次或更多次。

<2>修饰为增加从磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4羧基苯甲酸的活性

本发明的微生物可以为经修饰以增加从磷酸二羟丙酮(DHAP)和天冬氨酸半醛(ASA)形成3-氨基-4羧基苯甲酸(3,4-AHBA)活性的微生物。所述修饰可通过例如使用包含具有从DHAP和ASA形成3,4-AHBA活性的蛋白的编码基因的重组载体转化需要的微生物来实现。所述具有从DHAP和ASA形成3,4-AHBA活性的蛋白并不特别限定，只要所述蛋白有助于从DHA和ASA形成3,4-AHBA，包括例如，具有催化形成DHAP和ASA之间的碳-碳键的酶活性(此后有时简称为“醛缩酶活性”)的蛋白，和具有催化通过DHAP和ASA间碳-碳键形成所获取的C7化合物的环化的酶活性(此后有时简称为3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性)的蛋白。下文中前述两种活性有时被称为生物合成3,4-AHBA的能力。

具有催化DHAP和ASA之间碳-碳键形成的酶活性的蛋白的编码基因可包括源于灰色链霉菌的griI基因或griI基因同源物(所述griI基因和所述griI基因同源物两者有时被简称为griI基因)。所述griI基因同源物指源于其他微生物的基因，其展现出与前述源于灰色链霉菌的基因的高度同源性，并编码具有醛缩酶活性的蛋白。所述基因可通过BLSAT检索检索到。例如，所述基因可包括源于Streptomyces murayamaensis的nspI基因(SEQ ID NO：18和19)，源于弗兰克氏菌属(Frankia sp.)的果糖-二磷酸醛缩酶(登录号YP_483282)和果糖-二磷酸醛缩酶(登录号YP_481172)，源于疥链霉菌(Streptomycesscabies)的果糖-二磷酸醛缩酶(http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/s_scabies)，源于伯克霍尔德氏菌物种383(Burkholderia sp.383)的果糖-二磷酸醛缩酶(登录号Q39NQ9)，源于詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的果糖-二磷酸醛缩酶(登录号NP_247374)，和源于大肠杆菌的dhnA基因(登录号NC_000913)(Journal of Biochemistry vol.281，NO.48，pp.36944-36951，补充数据)。

编码具有催化C7化合物发生环化的酶活性的蛋白质的基因可以包括源于灰色链霉菌的griH基因或griH基因同源物(griH基因和griH基因同源物两者有时均简称为griH基因)，所述C7化合物通过在DHAP和ASA之间形成碳-碳键而获得。griH基因同源物是指来源于其他微生物，其与上述来源于灰色链霉菌的基因具有高同源性，并编码具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质的基因。所述基因可被Blast检索来检索。举例而言，所述基因可包括源于Streptomyces murayamaensis的nspH基因(SEQ ID NO：20和21)，源于弗兰克氏菌属物种(Frankia sp.)的3-脱氢奎尼酸合酶(登录号YP_483283)和3-脱氢奎尼酸合酶(登录号YP_481171)，源于伯克霍尔德氏菌sp.383(Burkholderia sp.383)的3-脱氢奎尼酸合酶(登录号YP_366552)和3-脱氢奎尼酸合酶(登录号YP_366553)，源于疥链霉菌(Streptomyces scabies)的3-脱氢奎尼酸合酶(http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/s_scabies)，以及源于詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(Journal of Biochemistry vol.281，NO.48，pp.36944-36951，补充数据)的3-脱氢奎尼酸合酶(登录号NP_248244)。

源于任何微生物的GriI和GriH或griI基因和griH基因可用于本发明，例如，它们可源于如前文所述的细菌或放线菌微生物，并优选源于放线菌。放线菌的例子可包括属于链霉菌属的微生物。属于链霉菌属的微生物可包括灰色链霉菌(Streptomyces griseus)，Streptomyces murayamaensis，变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)，和疥链霉菌(Streptomyces scabies)。GriI和GriH或griI基因和griH基因可源于相同微生物或不同微生物。

如下的蛋白质可期望作为GriI同源物，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：9或18具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，更为优选95％或更高，特别优选98％或99％或更高同一性的氨基酸序列，并具有醛缩酶活性，SEQ ID NO：9或18是由前述griI基因编码的蛋白的氨基酸序列。例如，其例子可包括国际公布WO2010/005099中的SEQ ID NOS：9，11，13，15，17，19和21。以下也可期望作为griI基因同源物：包含与SEQ ID NO：10或19具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，更为优选95％或更高，特别优选98％或99％或更高同一性的核苷酸序列，并编码具有醛缩酶活性的蛋白的，所述SEQ ID NO：10或19是griI基因的核苷酸序列。例如，其例子可包括国际公布WO2010/005099中的SEQ ID NO：8，10，12，14，16，18和20。

如下的蛋白质可期望作为GriH同源物，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：11或20具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，更为优选95％或更高，特别优选98％或99％或更高同一性的氨基酸序列，且具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性，所述SEQ ID NO：11或20是由前述griH基因编码的蛋白质的氨基酸序列。其例子可包括国际公布WO2010/005099中的SEQ IDNO：23，25，27，29，31，33，和35。如下的核酸序列也可期望作为griH基因同源物，该核酸序列包含与SEQ ID NO：12或21具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，更为优选95％或更高，特别优选98％或99％或更高同一性的核苷酸序列，并编码具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性的蛋白所述SEQ ID NO：12或21是上述griH基因的核苷酸序列。例如，其可包括国际公布WO2010/005099中的SEQ ID NO：22，24，26，28，30，32，和34。

不因其在氨基酸序列中的突变而影响活性的氨基酸残基的一个或多个位点是本领域技术人员所显而易见的，并且可以进一步参照序列比对结果得到蛋白突变体。具体地，本领域技术人员可以(1)比对多个同源蛋白的氨基酸序列，(2)确定相对保守区域和相对非保守区域；然后(3)分别预测对于功能起重要作用的区域，相对保守区域和相对非保守区域中对其功能不能起重要作用的区域，并因此识别其结构/功能的相互关系。国际公布WO2010/005099公开了上述griI基因同源物间氨基酸序列比对结果(国际公布WO2010/005099中的图1和2)，上述griH基因同源物间氨基酸序列比对结果(国际公布WO2010/005099中的图3和4)，以及它们的共有(公用)序列(国际公布WO2010/005099中的SEQ ID NOS：36和37)。griI基因同源物包括编码国际公布WO2010/005099中SEQ ID NO：36所示氨基酸序列的基因。且griH基因同源物包括编码国际公布WO2010/005099中SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的基因。

可用前面描述的方法确定氨基酸序列间的以及核酸序列间的同源性(如同一性或相似性)。

griI基因或griH基因的核苷酸序列可能因微生物的物种和微生物菌株而不同。因此，griI基因和griH基因仅需要能够通过将它们在大肠杆菌中表达(如增加它们的表达)而增强在大肠杆菌中产生3,4-AHBA的能力。例如，包含在由griI基因编码的蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：9或18)的一个或多个位点具有一个或几个氨基酸取代，缺失，***，添加等的氨基酸序列，并具有醛缩酶活性的蛋白可期望作为griI基因编码蛋白。例如，可包括国际公布WO2010/005099中的SEQ ID NO：9，11，13，15，17，19，和21。包含在由griH基因编码的蛋白质的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：11或20)的一个或多个位点具有一个或几个氨基酸取代，缺失，***，添加等的氨基酸序列，并具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性的蛋白可期望作为由griH基因编码的蛋白。例如，可包括国际公布WO2010/005099中的SEQ ID NO:23，25，27，29，31，33，和35。这里，“几个”因蛋白的三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸残基的种类不同而变化，但优选指1到50，更优选1到20，更为优选1到10，以及特别优选1到5。上述氨基酸的取代，缺失，***，添加等包括基于具有所述girI基因或girH基因的微生物的个体差异或物种差异等的天然存在的突变(突变体或变体)。所述取代优选保守取代，其是不改变功能的中性取代。所述保守取代在前面已经有所描述。

此外，griI基因和griH基因的简并性随导入有所述基因的宿主而变。因此密码子可被替换为可用于期望的微生物的密码子。同样，griI基因和griH基因可以是编码在N端侧和/或C端侧延伸或截短的蛋白质的基因，只要基因在微生物中具有增加3,4-AHBA生产能力的功能。例如，延伸或截短残基的长度是50或更少，优选20或更少，更优选10或更少，且特别优选5或更少的氨基酸残基。更为具体地，所述基因可以是编码如下蛋白的基因，其中已经延伸或截短N端侧的50到5个氨基酸残基或C端侧的50到5个氨基酸残基。

与griI或griH基因同源的此类基因可如下获得，例如通过位点特异性诱变来修饰编码氨基酸序列的基因，从而位于编码蛋白特定位点的氨基酸残基可包括取代，缺失，***或添加。这样的同源基因也可通过如下的常规已知的突变处理获得。体外使用羟胺等处理griI基因或griH基因的方法和用紫外线或突变剂如通常用于突变处理的N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS)处理携带所述基因的微生物的方法、易错PCR(Cadwell，R.C.PCR Meth.Appl.2，28(1992))，DNA改组(Stemmer，W.P.Nature 370，389(1994))，和StEP-PCR(Zhao，H.Nature Biotechnol.16，258(1998))可作为突变处理。使用这些处理，突变可以通过基因重组人为地引入到griI基因或griH基因中从而获得编码具有高活性酶的基因。

griI基因还可以是如下的DNA，其在严谨条件下与互补于griI基因或其同源基因(如，国际公布WO2010/005099中SEQ ID NO：10或19，或SEQ IDS NO：8，10，12，14，16，18或20)的核酸序列杂交，并编码具有醛缩酶活性蛋白。griH基因也可以是在严谨条件下与互补于griH基因或其同源基因(如，国际公布WO2010/005099中SEQ ID NO：12或21，或SEQ ID NO:22，24，26，28，30，32或34)的核酸序列杂交，并编码具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性蛋白的DNA。所述“严谨条件”与前面描述的相同。

本说明书中涉及的前述基因同源物和保守取代同样适用于以同样方式在此描述的其他基因。

这些griI基因和griH基因及其同源基因编码还是不编码增强产生3,4-AHBA的能力的蛋白可以如下确认：通过将这些基因导入到如下的细菌等中，并检查形成3,4-AHBA的能力增强与否，所述细菌具有编码突变天冬氨酸激的基因，其中消除了反馈抑制。在此情况下，通过使用根据例如，Suzuki等的反向色谱法[J.Bio.Chem.，281，823-833(2006)]定量3,4-AHBA，从而更为清晰地验证效果。

<3>重组载体

能够用于本发明的重组载体可通过将所需的基因导入表达载体而获得。例如，当共同使用nhoA，griI和griH基因时，它们每个可携带在不同的重组载体上用于转化，或nhoA，griI和griH可通过合适的间隔物(spacer)连接并携带在同一个重组载体用于转化，只要它们每个以可表达的状态包含于转化体中。griI基因和griH基因可源于同一微生物或不同微生物。当griI基因和griH基因来源于同一微生物且在染色体上的位置彼此接近时，包含griI和griH两者的DNA片段可被切出并携带于载体上。

用于本发明的重组载体通常具有启动子，本发明前面所述的DNA(例如nhoA，griI和griH)和重组微生物中位于合适位置以使它们发挥作用对基因表达必须的调节区(操纵子和终止子)。

可用作重组载体的表达载体并无特别的限制，只需是在需要的微生物中能起作用的载体，也可以是在染色体外自主复制的质粒或整合到细菌染色体中的质粒。具体地，表达载体的例子可包括pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，pSTV28，pSTV29(pHSG和pSTV可从Takara Bio Inc.获得)，pMW119，pMW118，pMW219，MW218(pMW系列可从Nippon GeneCo.，Ltd.获得)，等，它们是当引入到属于埃希氏菌属或泛菌属的细菌中时，能够在属于肠道菌组的细菌中自主复制的质粒。噬菌体DNA可以代替质粒用作载体。当引入属于棒杆菌属(Corynebacterium)的细菌时，表达载体的例子可包括pCRY30(描述于JP 3-210184-A中)，pCRY21，pCRY2KE，pCRY2KX，pCRY31，pCRY3KE和pCRY3KX(描述于JP 2-72876-A和美国专利号5,185,262中)，pCRY2和pCRY3(描述于JP 1-191686中)，pAM330(描述于JP 58-67679-A中)，pHM1519(描述于JP 58-77895-A中)，pAJ655，pAJ611和pAJ1844(描述于JP 58-192900-A中)，pCG1(描述于JP 57-134500-A中)，pCG2(描述于JP 58-35197-A中)，pCG4和pCG11(描述于JP 57-183799-A中)，pVC7(描述于JP 9-070291-A中)，pVK7(描述于JP 10-215883-A中)，所述质粒能够在属于棒杆菌属和其衍生属的微生物中自主复制。

可用于本发明中的启动子并无特别的限制，且可以使用通常用于在需要的微生物中生产外源蛋白的启动子。例如，T7启动子，lac启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子，λ噬菌体的PR启动子和PL启动子，T5启动子等应用于埃希氏菌属或泛菌属中是公知的。强启动子诸如源于棒杆菌属细胞表面蛋白PS1和PS2的编码基因的启动子(描述于JP 6-502548-A中)和源于棒杆菌属细胞表面蛋白SlpA的编码基因的启动子(描述于JP 10-108675-A)可用作棒杆菌属的启动子。

<4.转化体>

本发明的微生物无特别的限制，只要所述微生物具有产生3-氨基-4-羟基苯甲酸的能力并且被修饰以增加N-羟基芳基胺-O-乙酰转移酶(nhoA)的活性即可，但优选为转化体。本发明的转化体优选通过用包含编码蛋白的DNA的重组载体转化获得，所述蛋白具有自磷酸二羟基丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性。

作为宿主的微生物优选为能够有效提供作为3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的生物合成底物的磷酸二羟基丙酮，天冬氨酸半醛和乙酰基供体(如乙酰CoA)的微生物。微生物中的天冬氨酸激酶(AK)本来受如赖氨酸的协同反馈抑制。例如，大肠杆菌具有天冬氨酸激酶III(AKIII)，其是非共轭酶且单独起作用。大肠杆菌中的AKIII本来受赖氨酸的反馈抑制。另一方面，已知棒杆菌微生物中的AK是由α-亚基和β-亚基组成的异质蛋白(heteroprotein)，α-亚基和β-亚基的编码区在基因上部分重叠。棒杆菌细菌中的AK本来受到赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。具有突变的AK基因而基本上消除所述反馈抑制的微生物是特别优选的微生物。

已经报道了能够消除由氨基酸如赖氨酸带来的所述反馈抑制的源于多种微生物的天冬氨酸激酶的突变，所述微生物如大肠杆菌(Escherichia coli)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，灵杆菌(Serratia marcescens)等。例如，250位的谷氨酸到赖氨酸的突变(E250K)，318位的苏氨酸到异亮氨酸的突变(M318I)，344位的苏氨酸到甲硫氨酸(T344M)的突变，345位的丝氨酸到亮氨酸(S345L)的突变，352位的苏氨酸到异亮氨酸的突变(T352I)已被报道能够消除大肠杆菌AKIII受赖氨酸的反馈抑制(参见，例如Kikuchi etal.,FEMS Microbiology Letters 173,211-215(1999),和Falco et al.,BioTechnology 13,577-582(1995))。通过以获得源于谷氨酸棒杆菌(乳酸发酵短杆菌)ATCC 13869(参见例如国际公布WO2010/005099中SEQ ID NO：38)的野生型AKα-亚基为例，解释了能够消除棒杆菌AK的反馈抑制的突变。通过引入突变的方式消除了AK中的反馈抑制，其中所述突变包括α-亚基上从N端起279位丙氨酸残基用苏氨酸残基取代，或从N端起311位的苏氨酸残基用异亮氨酸残基取代，或从N端起301位的丝氨酸残基用酪氨酸残基取代，或从N端起380位的苏氨酸残基用异亮氨酸残基取代，或从N端起308位的苏氨酸残基用异亮氨酸残基取代，或从N端起320位的精氨酸残基用甘氨酸残基取代，或从N端起345位的甘氨酸残基用天冬氨酸残基取代(国际公布WO94/25605,国际公布WO00/63388,美国专利号6,844,176,国际公布WO01/049854等)。甚至来源于野生型的AK的氨基酸序列与国际公布WO2010/005099中的SEQ ID NO：38的氨基酸序列在几个氨基酸残基上有所不同，这取决于衍生AK的棒杆菌的类型和菌株。AK可以是等位变体。所述突变的定义与前述对griI和griH的描述相同。

本发明中，可以使用具有引入了前文描述突变的AK基因的微生物。根据AK所来源的棒杆菌类型和菌株，甚至源于野生型的AK的氨基酸序列在几个氨基酸残基上存在差异。可以使用该等位变体。可通过进行本领域技术人员公知的序列比对来鉴定消除所述反馈抑制所需要修饰的位点。消除所述对AK反馈抑制的修饰可通过本领域技术人员公知的方法实现，例如，获得对赖氨酸类似物(如2-氨基乙基半胱氨酸)具有抗性的突变株或利用同源重组通过基因替换进行定点突变。同样，也可通过用包含突变的AK基因的质粒转化消除了所述反馈抑制的微生物而获得具有提升的突变AK活性且消除了反馈抑制的微生物。

丙酮酸羧化酶基因的表达可在具有突变的AK基因且消除了反馈抑制的微生物中进一步增强。

可以依照本领域已知方法，用含有编码蛋白质的DNA的重组载体转化微生物，所述蛋白质具有从磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性。例如，可使用原生质体方法(Gene,39,281-286(1985))，电穿孔法(Bio/Technology,7,1067-1070(1989))等。当进行消除对AK的反馈抑制的转化时，赋予形成3,4-AHBA的活性的转化或是消除对AK的的反馈抑制的转化可以首先实施。

<5>生产3-乙酰氨基-4羟基苯甲酸型化合物的方法，以及生产3-氨基-4羟基苯甲酸型化合物和包含3-氨基-4羟基苯甲酸型化合物作为组分的聚合物的方法

<5-1>生产3-乙酰氨基-4羟基苯甲酸型化合物的方法

本发明提供一种生产3-乙酰氨基-4羟基苯甲酸型化合物的方法，包括培养本发明的微生物以形成3-乙酰氨基-4羟基苯甲酸型化合物。3-乙酰氨基-4羟基苯甲酸型化合物可以由磷酸二羟丙酮，天冬氨酸半醛和乙酰基供体(如乙酰CoA)生物合成。因此微生物优选为能够有效提供作为3-乙酰氨基-4羟基苯甲酸型化合物生物合成底物的磷酸二羟丙酮，天冬氨酸半醛和乙酰基供体(如乙酰CoA)的微生物。同样，微生物可培养于含有大量磷酸二羟丙酮，天冬氨酸半醛和乙酰基供体的培养基中。

本发明中的3-乙酰氨基-4羟基苯甲酸型化合物包括具有下述结构的3-乙酰氨基-4羟基苯甲酸(在下文有时简称“3,4-AcAHBA”)及其衍生物和盐。

[化学物3]

3-乙酰氨基-4羟基苯甲酸型化合物的衍生物中，(1)至少一个选自下组的基团是衍生化的：1位的羧基，3位的乙酰氨基和4位的羟基，(2)1位的羧基，3位的乙酰氨基和4位的羟基是保留的，选自第2、5和6位的碳原子中的至少一个碳原子上的氢原子用其他原子或基团取代，或(3)组合(1)和(2)。前述(2)中的其他原子或基团的例子可包括卤素原子(如氟原子、溴原子、氯原子和碘原子)、烷基(如，具有1到6个碳原子的烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基)、羟基、烷氧基(烷基部分与前述相同)，氨基、一或二烷基氨基(烷基部分与前述相同)、氰基、硝基、磺酰基和羧基。具体的，前述(1)中所述衍生物的例子可以包括1位的羧基被衍生化的衍生物(如，3-氨基-4-羟基苯甲酸，其中3-乙酰氨基-4羟基苯甲酸的羧基是醛化的)，3位乙酰氨基被衍生化的衍生物(如，3-乙酰烷基氨基衍生物)，和4位羟基被基团(如前述烷基)衍生化的衍生物(如4-烷氧基衍生物)。

碱盐，如碱金属(如钠、钾、锂)盐和碱土金属(如钙、镁)羧酸盐，和酸式盐(acid addition salts)如盐酸盐、硫酸盐、铅盐和磷酸盐作为盐的例子。

所述3-乙酰氨基-4羟基苯甲酸化合物可通过培养本发明的微生物并回收在培养基中产生的3-乙酰氨基-4羟基苯甲酸型化合物来产生。

本发明的用于微生物培养的培养基并无特别的限制，只要所需微生物生长即可，且所述微生物可根据本领域公知的方法培养。例如，所述微生物可在包含碳源、氮源，和无机离子的常规培养基中培养。如有需要，可添加有机微量元素如维生素和氨基酸以获得高增殖。

培养温度通常为25到42℃，最好控制pH于5至8。培养时间通常为20到90小时。

需要在控制氧供应条件下进行本发明微生物的培养。具体而言，当微生物生长进入对数生长期时，最好保持氧为2.0ppm或更少。

从培养基中回收和纯化3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的步骤中使用的回收方法可从公知方法中适当选取。例如，优选将培养基pH调整为所述3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物具有高溶解度的酸性pH，然后通过离心或膜过滤去除微生物细胞，从所得培养基上清进行回收。从去除了微生物细胞的培养基上清回收3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸的方法可包括：利用多孔吸附剂纯化，结晶和沉淀。

用于本发明的多孔吸附剂是具有大表面积的多孔固体吸附剂，并具体包括亲水吸附剂，典型地如硅胶、矾土、沸石、铁矾土(bauxite)、氧化镁(magnesia)、活性白土(activated white earth)、和丙烯酸合成吸附剂等，以及疏水吸附剂，典型地如木炭(vegetable charcoal)、骨炭(bone charcoal)、活性炭和芳族合成吸附剂等。在本发明中，可以使用任何吸附剂，而无特别限制，只要通过吸附杂质可提高3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的纯度即可。然而，对于这一点，被所述多孔吸附剂吸收的杂质含有大量主要在生物化学合成中产生的芳族化合物。因此可容易地吸附这些化合物的疏水吸附剂，典型地如活性炭和芳族合成吸附剂，适用于本发明。这些疏水吸附剂可单独使用，或两种或更多种组合使用。

当使用活性炭时，其原料并无特别的限制，可包括但不限于，植物原料如木粉和椰子壳、基于煤/石油的原料如无烟煤、石油沥青和焦炭，基于合成树脂的原料如丙烯酸树脂、酚树脂、环氧树脂和聚酯树脂。所述活性炭的形状包括粉状、粒状和纤维状，以及二次加工所得的制品，如过滤器和筒(cartridge)状等，可适当选择容易操作者。

同时，当使用芳族合成吸附剂时，其原料并无特别的限制，例如，可使用多孔树脂如1)未取代芳族树脂，2)具有疏水取代基的芳族树脂，和3)通过对未取代的芳族树脂进行特别处理所得的芳族树脂。具体的化合物包括，例如，苯乙烯和二乙烯基苯的树脂。

如上所述，使培养基中的3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物与多孔吸附剂相接触的目的，是使杂质吸附至所述多孔吸附剂以提高所述3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的纯度。然而，在一些情况下，作为目标产物的3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物也有不少与杂质一起被吸附到所述多孔吸附剂。因此，也可通过使培养基中的3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物与多孔吸附剂接触，然后使所述多孔吸附剂与极性有机溶剂相接触以将所述3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物解离并溶解至极性有机溶剂中，来分离并回收所述3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物。用于本发明的极性有机溶剂是指由具有高介电常数的极性分子组成的有机溶剂，且可以无任何限制地使用，只要所述3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物与所述多孔吸附剂解离并溶解至极性有机溶剂中即可。所述极性有机溶剂可单独使用或以所需的比例两种或更多种组合使用。

本发明中所述结晶或沉淀指通过将溶解了目标物质的溶剂蒸发浓缩，或降低温度，或向溶解了目标物质的溶剂中添加不良溶剂，使得浓度高于饱和溶解度以产生结晶或沉淀的操作，且没有特别限制，包括常规的和公知的方法。产生的晶体或沉淀可通过沉淀、过滤、离心等进行分离。

<5-2>生产3-氨基-4-苯甲酸型化合物的方法

本发明同样提供了生产3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的方法。该方法包括以下(1)和(2)：

(1)通过前面提及的方法形成3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物；和

本发明中的3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物包括具有下述结构的3-氨基-4-羟基苯甲酸(在下文有时简称“3,4-AHBA”)，及其衍生物和盐。

[化学物4]

所述3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的衍生物中，(1)至少一个选自下组的基团是衍生化的：1位的羧基，3位的氨基和4位的羟基，(2)1位的羧基，3位的氨基和4位的羟基是保留的，选自第2，5和6位的碳原子中的至少一个碳原子上的氢原子被其他原子或基团替代，或(3)合并(1)和(2)。前述(2)中的其他原子或基团的例子可包括卤素原子(如氟原子、溴原子、氯原子和碘原子)，烷基(如，具有1到6个碳原子的烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基等)、羟基、烷氧基(烷基部分与前述相同)、氨基、单-或二-烷基氨基(烷基部分与前述相同)、氰基、硝基、磺酰基和羧基。具体的，前述(1)中所述衍生物的例子包括1位的羧基被衍生化的衍生物(如，3-氨基-4-羟基苯甲醛，其中3-氨基-4羟基苯甲酸的羧基是醛化的)，3位氨基被如前述烷基基团衍生化的衍生物(如，3-乙酰烷基氨基衍生物)，和4位羟基被如前述烷基基团衍生化的衍生物(如4-烷氧基衍生物)。

碱盐，如碱金属(如钠、钾、锂)盐和碱土金属(如钙、镁)羧酸盐，和酸式盐(acid addition salts)如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐作为盐的例子。

本发明前述方法中的步骤(1)可以与前文中生产3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的方法相同的方式实施。

本发明前述方法的步骤(2)中的脱乙酰化可以以任何已知的方法实施。例如，可通过使用酸或碱水解实施脱乙酰化。只要Ac-AHBA型化合物的脱乙酰化反应进行，酸并无特别限制，并且优选例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等的强酸。只要Ac-AHBA型化合物脱乙酰化反应进行，碱并无特别限制，并且在能够提高脱乙酰化反应的活性方面，优选使用例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化钡、氢氧化锂等的强碱。可以回收和纯化获得的3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物。可按照前述回收和纯化3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物同样的方式实施3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的回收和纯化。

<5-3>生产含有3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物作为组分的聚合物的方法

本发明同样提供一种生产含有3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物作为组分的聚合物的方法。该方法包括以下(1’)和(2’)：

(1’)通过前文的方法形成3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物；并

本发明前述方法中的步骤(1’)可以与前文中生产3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的方法相同的方式实施。

本发明前述方法中的步骤(2’)可以以本领域任何已知的方法实施。例如，可通过高温下在如甲磺酸或多聚磷酸的非氧化性酸溶剂下发生缩合聚合(参见如WO91/01304)将由前述方法获得的3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物聚合化。根据本发明的多聚物生产方法中，3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物可与其他聚合物的组分聚合。其他组分的例子包括对苯二酸和双酚A，或对苯二酸和苯二胺。可使用各种已知方法(美国专利号5,142,021,5,219,981和5,422,416，和Kricheldorf等人,(1992)Makromol.Chem.,193,2467-2476，和Marcos-Fernandez等人,(2001)Polymer,42,7933-7941)实施聚合化方法。包含由本发明的方法生产的3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物作为组分的聚合物的例子包括聚苯并口恶唑聚合物，聚酯和聚酰胺。

实施例

下面参考如下实施例描述本发明，但本发明不受这些实施例的限制。实施例中作为宿主的微生物为那些能够有效提供作为3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物生物合成底物的磷酸二羟基丙酮，天冬氨酸半醛和乙酰基供体乙酰CoA的微生物。

实施例1：通过向大肠杆菌引入源于灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的3,4-AHBA合成酶基因的组(gene group)和源于大肠杆菌的nhoA基因来构建3,4-AcAHBA-生产细菌，并评价3,4-AcAHBA累积的量

(1)基于大肠杆菌基因组信息检索催化3,4-AHBA的N-乙酰化的酶

已经报道了芳基胺N-乙酰转移酶(arylamine N-acetyltransferase)(又称：NatA；NCBI登录ID：BAF46971.1)催化灰色链霉菌(Streptomyces griseus)IFO13350株中3,4-AHBA的N-乙酰化反应(Suzuki等人,(2007)J.Bacteriol.,189,2155-2159)。NatA的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1。为了检索与NatA具有同样功能的酶，从大肠杆菌K-12株的基因组信息中检索了与NatA表现出同源性的序列。作为利用发表的数据库(EcoCyc,http://ecocyc.org/,Keseler etal.,(2005)Nucleic Acids Res.,33,334-337)和使用BLASTP检索的结果，在大肠杆菌K-12株中发现了与源于灰色链霉菌IFO13350株的NatA表现出49％同源性的N-羟基芳基胺O-乙酰转移酶(又称NhoA，EC：2.3.1.118，NCBI登陆ID：NP_415980.1)。NhoA的氨基酸序列和NhoA编码基因(又称：nhoA：GenBank登陆号：NC_000913.2，核苷酸1532048到1532893，GI:947251)的核酸序列分别示于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

(2)构建表达nhoA基因的质粒

通过下述步骤构建在大肠杆菌中表达nhoA基因的表达质粒。以大肠杆菌BW25113株基因组DNA为模板，用在3’末端具有HindIII限制酶识别序列并示于SEQ ID NO：4的合成的寡核酸和在3’末端具有EcoRI限制酶识别序列并示于SEQ ID NO：5的合成的寡核酸为引物，以及使用PrimeStar GXL聚合酶(由Takara提供)进行PCR。根据试剂盒中所附的试剂制备反应液，在98℃10s，55℃15s和68℃60s下反应30个循环。结果，获得了约1.1kb含有nhoA基因天然启动子和nhoA基因片段的PCR产物。用EcoRI和HindIII消化该片段，并接着克隆入用同样的限制酶消化的pUC19(由Takara提供)中。将得到的载体命名为pUC19-NhoA。pUC19-NhoA的全长序列示于SEQ ID NO：6。

(3)构建表达质粒pSTV28-Ptac-Ttrp

构建表达质粒pSTV28-Ptac-Ttrp以赋予大肠杆菌生产3,4-AHBA的能力。首先，化学合成如下的DNA片段(核苷酸序列示于SEQ ID NO：7)，其包含tac启动子(又称：Ptac)区域(deBoer等人,(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80,21-25)和源于大肠杆菌的色氨酸操纵子的终止子区域(又称：Ttrp)(Wu等人,(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75,5442-5446)，并且具有5’端的KpnI位点和3’末端的BamHI位点。用KpnI和BamHI消化获得的DNA片段得到包含Ptac和Ttrp的DNA片段。纯化的DNA片段与用Kpn和BamHI消化的pSTV28(由Takara Bio Inc.提供)通过使用DNA连接酶的连接反应连接。获得的质粒命名为pSTV28-Ptac-Ttrp(核苷酸序列示于SEQ ID NO：8)，可通过克隆该质粒的Ptac的下游目标基因表达和扩增目标基因。

(4)化学合成与大肠杆菌中的密码子选择对应的griI基因和griH基因。

已知灰色链霉菌(Streptomyces griseus)IFO13350株中，由醛缩酶(又称：SGR_4249,GriI)和3,4-AHBA合成酶(又称：SGR_4248,GriH)组成的3,4-AHBA合成酶基因的组催化合成3,4-AHBA(Suzuki等人.,(2006)J.Biol.Chem.,281,36944-36951)。GriI由griI基因(GenBank登录号AB259663.1,核酸13956到14780；GI：117676060)编码。GriI蛋白的氨基酸序列和griI基因的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。同样，GriH由griH基因(GenBank登录号AB259663.1,核苷酸12690到13880；GI：117676059)编码。GriH蛋白的氨基酸序列和griH基因的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

为了在大肠杆菌中有效表达griI基因和griH基因，griI基因和griH基因的序列改变为使其与大肠杆菌中密码子选择相对应，设计为以操纵子表达，这命名为EcGriIH。分别在EcGriIH的5’末端和3’末端加入EcoRI和HindIII限制酶识别位点，并化学合成该片段(示于SEQ ID NO：13)。用EcoRI和HindIII消化两端添加有限制酶识别序列的EcGriIH，接着克隆入用同样的限制酶消化的Puc57(由Genscript提供)中。得到的质粒命名为pUC57-EcGri。pUC57-EcGri的全长序列示于SEQ ID NO：14。

(5)构建表达griI基因和griH基因的质粒

通过下述步骤构建在大肠杆菌中表达griI基因和griH基因的表达质粒。以pUC57-EcGri为模板，SEQ ID NO：15所示合成的寡核苷酸和SEQ ID NO：16所示合成的寡核苷酸为引物，以及使用PrimeStar GXL聚合酶(由Takara提供)进行PCR。根据试剂盒中所附的试剂制备反应液，在98℃10s，55℃15s和68℃150s下反应30个循环。结果，获得约2.1kb含有EcGriIH基因片段的PCR产物。接着，使用In-Fusion HD Cloning Kit(由Clontech提供)连接纯化的EcGriIH基因片段和用SmaI消化的pSTV28-Ptac-Ttrp。得到的表达griIH基因的质粒被命名为pSTV28-EcGri。pSTV28-EcGri的全长序列示于SEQ ID NO：17。

(6)构建3,4-AcAHBA-生产细菌

准备大肠杆菌BW25113株的感受态细胞，并通过电穿孔将pSTV28-EcGri引入所述细胞。接着，细胞被均匀地涂布到含30mg/L氯霉素的LB平板上，并在37℃下培养18小时。从平板中获得氯霉素抗性的转化体。引入有pSTV28-EcGri的大肠杆菌BW25113株被命名为BW25113/pSTV28-EcGri株。接着，准备BW25113/pSTV28-EcGri株的感受态细胞，然后通过电穿孔将pUC19或pUC19-NhoA引入所述细胞。细胞被均匀地涂布到含30mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，并在37℃下培养18小时。从平板中获得氯霉素和氨苄青霉素抗性的转化体。引入有pUC19的大肠杆菌BW25113/pSTV28-EcGri株被命名为BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19株。引入有pUC19-NhoA的大肠杆菌BW25113/pSTV28-EcGri株被命名为BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19-NhoA株。

(7)3,4-AcAHBA-生产培养

BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19株和BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19-NhoA株的细菌细胞被均匀涂布到含30mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，并在37℃下培养18小时。从结果平板上取一环的细菌细胞接种于含4mL MS葡萄糖/天冬氨酸培养基的试管中，所述培养基含30mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素，并在往复振荡培养装置(reciprocal shaking cultivation apparatus)中30℃培养48小时。MS葡萄糖/天冬氨酸培养基的组成描述于下面的表1中。

[表1]

表1.MS葡萄糖/Asp培养基的组成

组分	终浓度
		葡萄糖	40(g/L)
(NH₄)₂SO₄	24(g/L)
		天冬氨酸	5(g/L)
KH₂PO₄	1(g/L)
		MgSO₄·7H₂O	1(g/L)
FeSO₄·7H₂O	10(mg/L)
		MnSO₄·7H₂O	8.2(mg/L)
细菌培养用酵母提取物	2(g/L)
		CaCO₃	50(g/L)

用KOH调节培养基pH到7.0，121℃高压灭菌20分钟。但将葡萄糖和MgSO₄·7H2O混合并与前述培养基分开灭菌。干热灭菌后添加CaCO₃。

(8)分析自3,4-AHBA转化的化合物的分子量(室温，9.5分钟)

BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19株和BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19-NhoA株(描述于实施例1(7)中)的培养上清液以及3,4-AHBA的标准品(货号A0859，由Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.提供)的反相柱色谱图示于图1(分析条件记载于Suzuki等人,(2006)J.Biol.Chem.,281,36944-36951中)。在BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19-NhoA株培养上清液中未检出3,4-AHBA，且在保留时间(R.T.)9.5分钟处检出的峰高较作为对照的BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19有所增加。这表示3,4-AHBA被过表达的NhoA转化为保留时间9.5分钟处的化合物。

用LC/MC分析了所述自3,4-AHBA转化的化合物(R.T.,9.5分钟)的分子量，其包含于BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19-NhoA株细胞培养后的的培养上清液中。所述分析条件如下：

色谱柱：Inertsil ODS-32μm,2.1×75mm(由GL Science提供)

流动相：A＝0.1％甲酸/H₂O

B＝0.1％甲酸/乙腈

梯度方案(Gradient program)

流速：0.2mL/分钟

柱温：室温(25℃)

检测波长：254nm(PDA)

MS电离方式：ESI

分析仪：Agilent Infinity 1290(LC)

Agilent Quadrupole LC/MS 6130(MS)

作为分析的结果，转化化合物(R.T.,9.5分钟)的m/z值为195.1，且与计算的乙酰化3,4-AHBA的m/s值(195.1)相符。下文中，转化化合物(R.T.,9.5分钟)称为3,4-AcAHBA。

(9)培养基的吸光度和培养上清液中累积的3,4-AHBA和3,4-AcAHBA的定量

使用分光光度计(HITACHI U-2900)在600nm处测量描述于实施例1(7)中BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19株和BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19-NhoA株细胞培养基的光密度(OD)值。使用反相柱色谱法分离培养上清液中的3,4-AHBA和3,4-AcAHBA，并定量它们的累积量(Suzuki等人,(2006)J.Biol.Chem.,281,36944-36951)。培养液于600nm处的OD值、3,4-AHBA的累积量，和3,4-AcAHBA的累积量示于表2。BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19-NhoA株的培养上清液中未检测出3,4-AHBA，且与作为对照的BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19菌的培养上清液相比，3,4-AcAHBA的累积量有所提高。BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19-NhoA株培养上清液中3,4-AHBA和3,4-AcAHBA浓度的总量是BW25113/pSTV28-EcGri/pUC19株中的1.67倍。

[表2]

表2.转化来源于灰色链霉菌3,4-AHBA合成酶基因的组和源于大肠杆菌nhoA基因的大肠杆菌培养上清液中3,4-AHBA和3,4-AcAHBA的累积量以及它们的总和。

N.D.:未检出

每一数值代表取自三次培养的平均值。

实施例2：通过将源于Streptomyces murayamaensis的3,4-AHBA合成酶基因的组和源于大肠杆菌的nhoA基因引入大肠杆菌来构建3,4-AHBA生产细菌，以及评价3,4-AcAHBA的累积量

(1)化学合成与大肠杆菌密码子选择相一致的nspI基因和nspH基因。

已知由Streptomyces murayamaensis中的醛缩酶(又称：NspI；NCBI登录号：BAJ08171)和3,4-AHBA合成酶(又称：NspH；NCBI登录号：BAJ08172.1)组成的3,4-AHBA合成酶基因组群催化合成3,4-AHBA(Noguchi等人,(2010)Nat.Chem.Biol.,6,641-643)。NspI由nspI基因(Genbank登录号：AB530136，核酸8730到9584；GI：296784943)编码。NspI蛋白的氨基酸序列和nspI基因的核酸序列分别示于SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19。同样，NspH由nspH基因(GenBank登录号AB530136,核苷酸9599到10702；GI:296784944)编码。NspH蛋白的氨基酸序列和nspH基因的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21。

为了在大肠杆菌中有效表达nspI基因和nspH基因，nspI基因和nspH基因的序列被改变为与大肠杆菌密码子选择相一致，并设计为作为操纵子表达，将其命名为EcNspIH。分别在EcNspIH的5’末端和3’末端加入EcorI和HindIII的限制酶识别序列，且化学合成该片段(示于SEQ ID NO：22)。使用EcoRI和HindIII消化两末端添加了内切酶识别序列的EcNspIH，并接着克隆入被同样的内切酶消化的pUC57(由Genscript提供)中。获得的载体被命名为pUC57-EcNsp，其序列示于SEQ ID NO：23。

(2)构建表达nspI基因和nspH基因的质粒

使用下述程序构建大肠杆菌中表达nspI基因和nspH基因的表达质粒。以pUC57-EcNsp为模板，使用SEQ ID NO：24所示合成的寡核苷酸和SEQ IDNO：25所示合成的寡核苷酸作为引物以及使用PrimeStar GXL聚合酶(由Takara提供)进行PCR反应。根据试剂盒中所附的试剂配置反应液，在98℃10s，55℃15s和68℃150s下反应30个循环。结果获得约2.1kb含有EcNspIH基因片段的PCR产物。接着，使用In-Fusion HD Cloning Kit(由Clontech提供)连接纯化的EcNspIH基因片段和用SmaI消化的pSTV28-Ptac-Ttrp[描述于实施例1(3)中]。得到的表达nspIH基因的质粒被命名为pSTV28-EcNsp。pSTV28-EcNsp的全长序列示于SEQ ID NO：26。

(3)构建3,4-AcAHBA-生产细菌

准备大肠杆菌BW25113株感受态细胞，然后通过电穿孔将pSTV28-EcNsp引入所述细胞。所述细胞被均匀地涂布到含30mg/L氯霉素的LB平板上，并在37℃下培养18小时。从平板中获得氯霉素抗性的转化体。引入了pSTV28-EcNsp的大肠杆菌BW25113株被命名为BW25113/pSTV28-EcNsp株。接着，准备BW25113/pSTV28-EcNsp株的感受态细胞，然后通过电穿孔将pUC19或pUC19-NhoA[描述于实施例1(2)]引入所述细胞。细胞被均匀地涂布到含30mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，并在37℃下培养18小时。从所述平板中获得氯霉素和氨苄青霉素抗性的转化体。引入了pUC19的大肠杆菌BW25113/pSTV28-EcNsp株被命名为BW25113/pSTV28-EcNsp/pUC19株。引入了pUC19-NhoA的大肠杆菌BW25113/pSTV28-EcNsp株被命名为BW25113/pSTV28-EcNsp/pUC19-NhoA株。

(4)评价3,4-AcAHBA-生产培养

BW25113/pSTV28-EcNsp/pUC19株和BW25113/pSTV28-EcNsp/pUC19-NhoA株的微生物细胞被均匀地涂布到含30mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，并在37℃下培养18小时。从结果平板上取一环的细菌细胞接种于含4mL MS葡萄糖/天冬氨酸培养基的试管中，所述培养基含30mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素，并在往复振荡培养装置中30℃培养48小时。MS葡萄糖/天冬氨酸培养基的组成描述于所述表1中。

培养结束后，使用分光光度计(HITACHI U-2900)在600nm处测量了培养基的OD值。同样使用反相柱色谱法分离累积于培养上清液中的3,4-AHBA和3,4-AcAHBA，并以实施例1同样的方式测量它们的量。培养液600nm处的OD值，3,4-AHBA的累积量，和3,4-AcAHBA的累积量示于表3。BW25113/pSTV28-EcNsp/pUC19-NhoA株的培养上清液中未检测出3,4-AHBA，且与作为对照的BW25113/pSTV28-EcNsp/pUC19株的培养上清液相比，3,4-AcAHBA的累积量有所提高。BW25113/pSTV28-EcNsp/pUC19-NhoA株培养上清液中3,4-AHBA和3,4-AcAHBA浓度的总量是BW25113/pSTV28-EcNsp/pUC19株中的1.69倍。

[表3]

表3.转化入源于Streptomyces murayamaensis的3,4-AHBA合成酶基因组群和源于大肠杆菌nhoA基因的大肠杆菌培养上清液中3,4-AHBA和3,4-AcAHBA的累积量以及它们累积量的总和

N.D.:未检出

每一数值代表取自三次培养的平均值。

实施例3：通过将源于灰色链霉菌的3,4-AHBA合成酶基因的组和源于大肠杆菌的nhoA基因引入菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来构建3,4-AcAHBA生产细菌，以及评价3,4-AcAHBA的累积量

(1)构建表达nhoA基因的质粒

使用下述程序构建菠萝泛菌中表达nhoA基因的表达质粒。以大肠杆菌BW25113株基因组DNA为模板，用在3’末端具有HindIII限制酶识别序列并示于SEQ ID NO：4的合成的寡核酸和在3’末端具有EcoRI限制酶识别序列并示于SEQ ID NO：5的合成的寡核酸为引物，以及使用PrimeStar GXL聚合酶(由Takara提供)进行PCR。根据试剂盒中所附的试剂配置反应液，在98℃10s，55℃15s和68℃60s下反应30个循环。结果，获得了约1.1kb含有nhoA基因天然启动子和nhoA基因片段的PCR产物。用EcoRI和HindIII消化该片段，并接着克隆入用同样的内切酶消化的pMW219(由Takara提供)中。将得到的载体命名为pMW219-NhoA。pMW219-NhoA的全长序列示于SEQ ID NO：27中。

(2)构建3,4-AcAHBA-生产细菌

准备菠萝泛菌SC17株感受态细胞(描述于JP 2006-230202-A中)，接着通过电穿孔将pSTV28-EcGri引入所述细胞。细胞被均匀地涂布到含30mg/L氯霉素的LB平板上，并在37℃培养24小时。从平板中获得氯霉素抗性的转化体。引入了pSTV28-EcGri的菠萝泛菌SC17株被命名为SC17/pSTV28-EcGri株。接着，准备SC17/pSTV28-EcGri株的感受态细胞，然后通过电穿孔将pMW219或pMW219-NhoA引入所述细胞。细胞被均匀地涂布到含30mg/L氯霉素和50mg/L卡那霉素的LB平板上，并在37℃下培养24小时。从平板中获得氯霉素和卡那霉素抗性的转化体。引入了pMW219的SC17/pSTV28-EcGri株被命名为SC17/pSTV28-EcNsp/pMW219株。引入了pMW219-NhoA的SC17/pSTV28-EcGri株被命名为SC17/pSTV28-EcGri/pMW219-NhoA株。

(3)评价3,4-AcAHBA-生产培养

SC17/pSTV28-EcGri/pMW219株和SC17/pSTV28-EcGri/pMW219-NhoA株的微生物细胞被均匀地涂布到含30mg/L氯霉素和50mg/L卡那霉素的LB平板上，并在37℃下培养24小时。从结果平板上取一环的细菌细胞接种于含4mL MS葡萄糖/天冬氨酸培养基的试管中，所述培养基含30mg/L氯霉素和50mg/L卡那霉素，并在往复振荡培养装置中30℃培养32小时。MS葡萄糖/天冬氨酸培养基的组成描述于所述表1中。

培养结束后，使用分光光度计(HITACHI U-2900)在600nm处测量了培养基的OD值。同样使用反相柱色谱法分离累积于培养上清液中的3,4-AHBA和3,4-AcAHBA，并以实施例1(9)同样的方式测量它们的量。培养液600nm处的OD值，3,4-AHBA的累积量，和3,4-AcAHBA的累积量示于表4。SC17/pSTV28-EcGri/pMW219-NhoA株的培养上清液中未检测出3,4-AHBA，且与作为对照的SC17/pSTV28-EcGri/pMW219株的培养上清液相比，3,4-AcAHBA的累积量有所提高。SC17/pSTV28-EcGri/pMW219-NhoA株培养上清液中3,4-AHBA和3,4-AcAHBA浓度的总量是SC17/pSTV28-EcGri/pMW219株培养上清液中的2.46倍。

[表4]

表4.转化入源于灰色链霉菌的3,4-AHBA合成酶基因的组和源于大肠杆菌nhoA基因的菠萝泛菌培养上清液中3,4-AHBA和3,4-AcAHBA的累积量以及它们累积量的总和

N.D.:未检出

每一数值代表取自三次培养的平均值。

实施例4：通过将源于灰色链霉菌的3,4-AHBA合成酶基因的组和源于大肠杆菌的nhoA基因引入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)来构建3,4-AcAHBA生产细菌，以及评价3,4-AcAHBA的累积量

(1)构建表达nhoA基因的质粒

使用下述程序构建谷氨酸棒杆菌中表达nhoA基因的表达质粒。以大肠杆菌BW25113株基因组DNA为模板，用在3’末端具有HindIII内切酶识别序列并示于SEQ ID NO：4的合成的寡核酸和在3’末端具有EcoRI内切酶识别序列并示于SEQ ID NO：5的合成的寡核酸为引物，以及使用PrimeStar GXL聚合酶(由Takara提供)进行PCR。根据试剂盒中所附的试剂配置反应液，在98℃10s，55℃15s和68℃60s下反应30个循环。结果，获得了约1.1kb含有nhoA基因天然启动子和nhoA基因片段的PCR产物。用EcoRI和HindIII消化该片段，并接着克隆入用同样的内切酶消化的pVC7(描述于JP 9-070291-A)中。将得到的载体命名为pVC7-NhoA。pVC7-NhoA的全长序列示于SEQ ID NO：28中。

(2)构建3,4-AcAHBA-生产细菌

使用描述于JP 2010-005099-A中的pPK4griIH质粒以便在谷氨酸棒杆菌中表达griI基因和griH基因。pPK4griIH包含源于谷氨酸棒杆菌ATCC 13869株(Peyret et al.,(1993)Mol.Microbiol.,9,97-109)细胞表面蛋白基因的启动子序列以及在其下游连接的griI基因和griH基因的序列。且pPK4griIH是能够在谷氨酸棒杆菌中有效表达griI基因和griH基因的质粒。准备谷氨酸棒杆菌ATCC 13869株感受态细胞接着通过电穿孔将pPK4griIH引入所述细胞。细胞之后被均匀地涂布到含25mg/L卡那霉素的CMDex平板上，并在30℃培养24小时。所述CMDex平板的组分示于表5中。

[表5]

表5.CMDex的组成

组分	终浓度
		葡萄糖	5(g/L)
KH₂PO₄	1(g/L)
		MgSO₄·7H₂O	0.4(g/L)
FeSO₄·7H₂O	10(mg/L)
		MnSO₄·5H₂O	10(mg/L)
多聚蛋白胨	10(g/L)

细菌培养用酵母提取物	10(g/L)
		尿素	3(g/L)
水解大豆产品(基于总氮量)	1.2(g/L)
		生物素	10(μg/L)
琼脂	20(g/L)

用KOH调节pH值至7.5。所述成分在121℃高压灭菌20分钟。但在调节pH值之后添加琼脂。

从结果平板中获得卡那霉素抗性的转化体。引入了pPK4griIH的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869株被命名为ATCC13869/pPK4griIH株。随后准备ATCC13869/pPK4griIH株的感受态细胞，然后通过电穿孔将pCV7或pCV7-NhoA引入所述细胞。之后，细胞被均匀地涂布到含20mg/L卡那霉素和5mg/L氯霉素的CMDex平板上，并在30℃培养24小时。从平板中获得卡那霉素和氯霉素抗性的转化体。引入了pVC7的ATCC13869/pPK4griIH株被命名为ATCC13869/pPK4griIH/pVC7株。引入了pVC7-NhoA的ATCC13869/pPK4griIH株被命名为ATCC13869/pPK4griIH/pVC7-NhoA株。

(3)评价3,4-AcAHBA-生产培养

ATCC13869/pPK4griIH/pVC7株和ATCC13869/pPK4griIH/pVC7-NhoA株的微生物细胞被均匀地涂布到含20mg/L卡那霉素和5mg/L氯霉素的CMDex平板上，并在30℃下培养24小时。从结果平板上取一环的细菌细胞接种于含4mL生产3,4-AcAHBA用培养基的试管中，所述培养基含20mg/L卡那霉素和5mg/L氯霉素，并在往复振荡培养装置(reciprocal shaking cultivationapparatus)中30℃培养56小时。所述生产3,4-AcAHBA用培养基的组成优选描述于下述表6中。

[表6]

表6.用于生产3,4-AcAHBA的培养基的组成

使用KOH调节pH值到7.5。组分于121℃高压灭菌20分钟。但将葡萄糖和MgSO₄·7H2O混合并与前述培养基分开灭菌。干热灭菌后添加CaCO₃。

培养结束后，使用分光光度计(HITACHI U-2900)在600nm处测量了培养基的OD值。同样使用反相柱色谱法分离累积于培养上清液中的3,4-AHBA和3,4-AcAHBA，并以实施例1(9)同样的方式测量它们的量。培养液600nm处的OD值，3,4-AHBA的累积量，和3,4-AcAHBA的累积量示于表7。ATCC13869/pPK4griIH/pVC7-NhoA株的培养上清液中未累积3,4-AHBA且与作为对照的ATCC13869/pPK4griIH/pVC7株的培养上清液相比，ATCC13869/pPK4griIH/pVC7-NhoA株培养上清液中3,4-AcAHBA的累积量有所提高。

[表7]

表7.转化入源于灰色链霉菌的3,4-AHBA合成酶基因的组和源于大肠杆菌nhoA基因的谷氨酸棒杆菌培养上清液中3,4-AHBA和3,4-AcAHBA的累积量以及它们累积量的总和

N.D.:未检出

每一数值代表取自三次培养的平均值。

工业应用性

根据本发明，可以便捷有效地生产易于转化为氨基-羟基苯甲酸型化合物的乙酰氨基-羟基苯甲酸型化合物，其中氨基-羟基苯甲酸型化合物可用作染料、农药、药物和其他有机合成产品中间体以及用作聚苯并噁唑的单体。因此，例如，由本发明获得的3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸可转化为3-氨基-4-羟基苯甲酸，随后，转化的3-氨基-4-羟基苯甲酸可以通过聚合生成聚苯并噁唑(PBO)，并因而能够廉价地提供具有高强度，高弹性模数和高耐热的PBO纤维和PBO膜。所述3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物是一种稳定的化合物并能容易地转化为作为原材料的，可通过生物合成生产的3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物。因此本发明的方法作为对环境压力小的工艺，是对地球环境友好的方法。

Claims

1.一种具有生产3-氨基-4-羟基苯甲酸能力的微生物，其经过修饰以增加自磷酸二羟基丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性，其中所述微生物经过修饰以增加N-羟基芳基胺-O-乙酰转移酶(NhoA)活性。

2.根据权利要求1的微生物，其中所述N-羟基芳基胺-O-乙酰转移酶活性的增加是通过用含有编码NhoA的DNA的重组载体转化赋予的。

3.根据权利要求2的微生物，其中所述NhoA是以下(I)至(III)中任一种的蛋白：

(I)包含SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白；

(II)包含在SEQ ID NO:2氨基酸序列上具有一个或几个氨基酸取代、缺失、***或添加的氨基酸序列，并具有N-羟基芳基胺-O-乙酰转移酶活性的蛋白；或

(III)包含与SEQ ID NO:2氨基酸序列具有70％或更多同一性的氨基酸序列，并具有N-羟基芳基胺-O-乙酰转移酶活性的蛋白。

4.根据权利要求2的微生物，其中所述编码NhoA的DNA是以下(i)至(iii)中任一种的DNA：

(i)包含SEQ ID NO:3核苷酸序列的DNA；

(ii)在严格条件下与同SEQ ID NO:3核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交并编码具有N-羟基芳基胺-O-乙酰转移酶活性的蛋白的DNA；或

(iii)包含与SEQ ID NO:3核苷酸序列具有70％或更多同一性的核苷酸序列并编码具有N-羟基芳基胺-O-乙酰转移酶活性的蛋白的DNA。

5.根据权利要求1-4中任一项的微生物，其中所述微生物属于埃希氏菌属(Escherichia)，泛菌属(Pantoea)或棒杆菌属(Corynebacterium)。

6.根据权利要求1-5中任一项的微生物，其中所述微生物属于大肠杆菌(Escherichia coli)，菠萝泛菌(Pantoea ananatis)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

7.根据权利要求1-6中任一项的微生物，其中所述生产3-氨基-4-羟基苯甲酸的能力是通过用包含编码以下蛋白的DNA的重组载体转化赋予的，所述蛋白具有自磷酸二羟基丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性。

8.根据权利要求7的微生物，其中所述具有形成3-氨基-4-羟基苯甲酸活性的蛋白是GriI和GriH。

9.根据权利要求8的微生物，其中所述GriI是以下(A)至(C)中任一种的蛋白，且所述GriH是以下(D)至(F)中任一种的蛋白：

(A)包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:18氨基酸序列的蛋白；

(D)包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:20氨基酸序列的蛋白；

10.根据权利要求7的微生物，其中编码具有形成3-氨基-4-羟基苯甲酸活性的蛋白的DNA是以下(a)至(c)中任一种的DNA，且所述griH基因是以下(d)至(f)中任一种的DNA：

(a)包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:19核苷酸序列的DNA；

(d)包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:21核苷酸序列的DNA；

11.一种生产3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的方法，包括培养根据权利要求1-10中任一项的微生物以形成所述3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物。

12.一种生产3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的方法，包括以下(1)和(2)：

(1)通过根据权利要求11的方法形成3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸型化合物；并

13.一种生产含有3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物作为组分的聚合物的方法，包含以下(1’)和(2’)：

(1’)通过根据权利要求12的方法形成3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物；并

14.根据权利要求13的方法，其中所述聚合物是聚苯并口恶唑聚合物。