CN104370795B - 一种双靶向卵巢癌细胞微管蛋白及其周围血管的茚酮化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学技术领域，具体为一种双靶向肿瘤细胞微管蛋白和肿瘤周围血管的茚酮化合物及其合成方法与应用。本发明设计合成了一种茚酮类化合物。该化合物可以与肿瘤细胞的微管蛋白结合，促进其聚合，干扰其解聚，从而干扰肿瘤细胞的有丝***过程；可以通过与肿瘤血管内皮细胞作用使肿瘤的血管区域被破坏。经大量实验证实，该化合物通过双靶向肿瘤细胞微管蛋白和肿瘤周围血管，可以安全有效地抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移和抑制肿瘤细胞血管生成。本发明化合物分子质量较小，口服生物利用度较高，临床用药相对灵活；能双靶向卵巢癌细胞及其周围血管，抗肿瘤活性也更高，在临床应用中更具优势。
Description
技术领域
本发明属生物医学技术领域，具体涉及一种双靶向卵巢癌细胞微管蛋白及其周围血管的茚酮化合物及其制备方法与应用。
背景技术
茚酮类药物因其独特的药理作用成为抗癌新药研发的热点。近年来，国内外的研究人员从不同角度对茚酮类化合物临床前应用、抗癌机制等方面进行研究，发现茚酮类化合物对多种癌细胞具有显著的疗效。
天然存在的茚酮化合物有100多个，其基本结构有1-茚酮、2-茚酮、1，2-茚二酮、1，3-茚二酮、茚三酮。这些茚环结构存在于天然产物、合成药物、农药等分子中。茚酮本来是一种有机发光物质合成的原料，具有很强的工业应用前景。而在肿瘤治疗方面，Indanocine及其衍生物也已被发现具有广谱而高效的抗癌活性，对于多种临床恶性肿瘤疗效显著，并且对普通抗癌药物耐药的晚期肿瘤有良好的疗效。具有开发成抗耐药性恶性疾病药物的良好前景。
目前认为茚酮类化合物抗肿瘤主要通过调控微管动力学稳定机制。它的靶位点是微管蛋白/微管***，能促进微管聚合，抑制微管降解，使细胞***阻滞。当然也有许多其他信号传导通路和机制参与茚酮类化合物对抗肿瘤细胞生长。茚酮类化合物对微管的这种结合是呈依赖性、可逆性和浓度依赖性的。即茚酮类化合物与微管蛋白的特定位点可逆地结合，使其动态平衡向着装配的方向移动，增加微管聚合的速率和产量。
一方面，茚酮类微管蛋白抑制剂具有强大的抗有丝***的作用，能够抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡。另一方面，这类微管蛋白抑制剂的水溶性较差，难以经血管给药；仅仅对抗肿瘤细胞本身的增殖，抗肿瘤谱很窄，且治疗过程中的耐药发生率高。所以针对一些已经发现的茚酮类微管蛋白抑制剂进行深入的结构修饰与改造，以期获得抗肿瘤活性更好、对多药耐药肿瘤细胞有效的化合物将成为研究与开发该类药物的一个新方向。
近年来有研究发现，带有特定基团的茚酮类化合物可以通过抑制人血管内皮因子生长的活性，对肿瘤血管生成起负调节作用。其中一类代表性化合物——氮代茚酮类化合物是从链霉菌中分离的天然产物，不仅具有良好的抗肿瘤活性，而且对体外培养的血管内皮细胞有强烈的抑制作用。这表明除了抑制肿瘤细胞微管蛋白之外，茚酮类化合物还具备抑制肿瘤血管生成的潜能。因此，经过特定基团修饰后的茚酮类化合物将具备单药双靶向特性，即同时靶向肿瘤细胞本身和靶向为肿瘤细胞提供营养物质的血管，这将为肿瘤治疗的研究开辟出一片新领域。因此需要通过进一步的构象研究，设计合成新型双靶向微管抑制剂，得到活性更强、毒性更低、对多药耐药肿瘤细胞更有效的茚酮类化合物。
本发明在前期实验中发现茚酮类化合物在体外可以抑制耐药和/或不耐药卵巢癌细胞的增殖，并能诱导耐药和/或不耐药卵巢癌细胞凋亡，初步证实其具有较为良好的抗肿瘤活性。而后，我们进一步应用SKOV3卵巢癌细胞系对其体内外抗癌活性进行了再次确认，同时与已应用于临床的抗癌药物顺铂进行了药效比较；然后分别从微管蛋白抑制方面及肿瘤血管生成抑制方面探讨了茚酮类化合物对抗卵巢癌的具体作用机制；最后，应用急慢性毒性试验来初步评估茚酮类化合物的毒性，为开发高效、安全的双靶向茚酮类抗肿瘤药物提供了实验基础。
发明内容
本发明目的在于提供一种双靶向卵巢癌细胞微管蛋白及其周围血管的茚酮化合物及其制备方法与应用。
本发明提供的双靶向卵巢癌细胞微管蛋白及其周围血管的茚酮化合物1，其结构式为：
。
本发明提供的茚酮化合物1的合成路线为：
具体合成步骤如下：
首先，1-(2-炔基苯基)-2-烯基酮与异氰基乙酸乙酯环化生成中间体二氢吡咯类化合物，然后，该中间体在AgOTf（三氟甲磺酸银）的作用下发生炔烃的水解，随后发生分子内的Aldol缩合，生成茚酮骨架；最后，在氧气作用下氧化芳构化，得到目标化合物。
合成方法的具体操作步骤为：
在试管中依次加入1-(2-炔基苯基)-2-烯基酮（0.2-20 mmol），AgOTf（三氟甲磺酸银）（0.10-0.12当量），碳酸铯（2.0-2.5当量），异氰基乙酸乙酯（1.2-1.3当量）以及1-100mL乙腈，上述混合物在封闭的体系下加热至105-110℃反应2-3小时，快速柱层析分离，即得到目标化合物。
化合物1的表征：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.80 (s, 1H), 7.49 (d, J =6.4Hz, 1H), 7.30 (t, J = 6.8Hz, 1H), 7.22 (t, J = 7.2Hz, 1H), 7.11-7.16 (m,4H), 6.95-7.01 (m, 5H), 6.84 (d, J = 7.2Hz, 2H), 4.19 (f, J = 6.8Hz, 2H),1.16 (t, J = 6.8Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3 ) δ 196.2, 160.8, 149.1,145.1, 133.4, 133.1, 132.7, 131.6, 131.3, 131.0, 130.8, 129.5, 129.3, 128.9,127.8, 127.4, 122.6, 122.4, 120.9, 120.5, 117.5, 60.8, 14.1; HRMS (ESI) calcdfor C28H20ClNO3: 454.1210 (M + H+), found: 454.1194.。
本发明设计合成了一种能够双靶向卵巢癌细胞微管蛋白及其周围血管的茚酮化合物。该化合物一方面通过干扰纺锤体微管的动力学组装从而起到抑制细胞增殖的作用，另一方面通过与肿瘤血管内皮细胞作用使肿瘤的血管区域被破坏。与传统的抗微管蛋白抑制剂单独针对肿瘤细胞来***细胞相比，解决了肿瘤细胞形状不稳定、基因突变频率高，容易发生耐药或变异耐药等问题。因此，本发明设计合成的茚酮化合物，可用于制备抗卵巢癌、逆转卵巢癌耐药的抑制剂（药物）。
本发明的茚酮化合物通过双靶向卵巢癌细胞的微管蛋白及其周围血管起到促进卵巢癌凋亡，抑制卵巢癌增殖、转移和血管生成，逆转卵巢癌耐药的作用。经CCK-8、Hochest染色、流式细胞术、粘附实验、迁移实验、细胞划痕实验、体内裸鼠皮下移植肿瘤实验、Western Blot、免疫组化、免疫荧光、RT-PCR、ELISA法得以证实。本发明化合物分子质量较小，口服生物利用度较高，临床用药相对灵活；能双靶向卵巢癌细胞及其周围血管，作用对象和途径更为广阔，抗肿瘤活性也更高，因此在临床应用中更具优势。
具体说明如下：
（1）化合物1的作用靶位为肿瘤细胞微观蛋白及肿瘤区血管；
（2）化合物1的作用机制为以下两种：Ⅰ通过干扰纺锤体微管的动力学组装从而起到抑制细胞增殖的作用，Ⅱ通过与肿瘤血管内皮细胞作用使肿瘤的血管区域被破坏；
（3）化合物1对卵巢癌；A2780cisR及A2780的IC50，见表1；
（4）
（5）化合物1的体外作用浓度为其A2780IC50；
（6）化合物1体外增强肿瘤细胞的凋亡能力；
（7）化合物1体外抑制肿瘤细胞的转移能力；
（8）化合物1体外能够有效逆转卵巢癌耐药；
（9）化合物1的体内作用浓度为其致死剂量（40mg/mL）的1/10，即高剂量组：4mg/mL溶于PBS，低剂量组：2mg/mL溶于PBS，阳性对照组： DDP2mg/mL溶于PBS，阴性对照组：PBS。腹腔给药，间日给，共7次。总给药时间为2周；
（10）给药期间至最终结束，活性化合物不会对裸鼠的心肝脾肺肾等重要脏器产生重大伤害，初步证实活性化合物相对安全；
（11）化合物1体内抑制肿瘤细胞的增殖能力；
（12）化合物1体内促进肿瘤细胞的凋亡能力；
（13）化合物1体内抑制肿瘤细胞的转移能力；
（14）化合物1体内抑制肿瘤细胞的血管新生能力。
附图说明
图1：化合物1对肿瘤细胞的生长抑制曲线。CCK-8结果显示，化合物1对卵巢癌细胞A2780 and A2780cisR生长的抑制呈浓度依赖性。其中，横坐标为化合物作用浓度，单位为ug/mL，纵坐标为细胞抑制率。(a) 为卵巢癌细胞系A2780的细胞生长抑制曲线；(b)为卵巢癌细胞系顺铂耐药的A2780的细胞生长抑制曲线。注：该图横坐标为化合物作用浓度，单位为ug/mL，横坐标为细胞抑制率。
图2：化合物1对肿瘤细胞的凋亡促进情况。Hochest结果显示，相比于空白对照组，化合物1对卵巢癌细胞SKOV3细胞有明显的凋亡促进作用。其中，(a)为卵巢癌细胞系A2780的Hochest染色图像；(b)为卵巢癌细胞系顺铂耐药的A2780的Hochest染色图像。
图3：化合物1抑制肿瘤细胞生长的作用机制。Western Blot结果显示，相比于空白对照组，给化合物1后裸鼠肿瘤组织中的微管蛋白表达均明显增高。其中，Tublin为微管蛋白；β-actin为内参。注：Tublin为微管蛋白；β-actin为内参。
图4：化合物1抑制肿瘤细胞生长的作用机制。免疫组化结果显示，相比于空白对照组，给化合物1后裸鼠肿瘤组织的微血管密度相关指标CD31表达明显降低。其中，(a)、(b)、(c)各图依次为三组(空白组，阳性对照组，阴性对照组)肿瘤组织的CD31免疫组化染色图像。
具体实施方式
实施例1 CCK-8法检测细胞活力证实化合物1对卵巢癌A2780、A2780cisR具有对抗肿瘤的作用，见图1所示。通过CCK-8法，我们对化合物1作用后的A2780、A2780cisR细胞进行了细胞活力的检测。发现化合物1可以抑制卵巢癌细胞增殖，并且这种抑制作用呈现浓度依赖性。其中在10μg/mL的浓度下对细胞抑瘤率达49.3%。同时根据肿瘤细胞生长抑制曲线计算出化合物1对A2780、A2780cisR的IC50分别为5.48和5.98μg/mL。
实施例2 Hochest染色法检测细胞凋亡率证实化合物1对卵巢癌SKOV3的凋亡具有促进作用。见图2所示。通过Hochest染色的方法，对化合物1作用后的卵巢癌SKOV3进行凋亡能力的分析。其中相比于空白对照组，经过化合物1处理后的卵巢癌A2780和A2780cisR细胞中凋亡细胞数量增多，数量依次为（76.3±64.2）个和（26.1±14.2）个，与空白对照组比较均有统计学差异（P<0.05）。细胞染色结果如图2所见，在化合物1处理过的卵巢癌细胞中可以看到很多核碎裂、核固缩现象，同时也可以在其中见到部分聚核积聚的现象。
实施例3 Western Blot法检测各组肿瘤组织中微管蛋白Tublinα表达，证实化合物1体内对卵巢癌SKOV3细胞具有促进微管蛋白凝聚、抑制其解聚的作用，见图3所示。Tublinα是微管的主要组成部分，因此我们这里应用Western Blot的方法检测了Tublinα在各组肿瘤组织中的表达。结果显示，各组中Tublinα表达有差异，给化合物1组的裸鼠肿瘤组织中Tublinα表达最高。
实施例4 免疫组化法检测各组肿瘤组织中微血管的密度。证实化合物1体内对卵巢癌SKOV3细胞具有抑制肿瘤血管生成的作用，见图4所示。CD31是又称为血小板-内皮细胞粘附分子，主要用于反应内皮细胞组织的存在。因此我们这里应用免疫组化的方法检测CD31在各组肿瘤组织中的表达，用于评估肿瘤血管生成的情况。结果显示，各组中CD31表达有差异，给化合物1组的裸鼠肿瘤组织中CD31表达最低。
Claims (1)
1.一种茚酮化合物在制备同时双靶向卵巢癌及卵巢癌周围血管的抑制剂中的应用，所述茚酮化合物的具体结构式为：
。
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