CN104357583B - 巴马哈森林病毒的实时荧光rt-pcr检测试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测巴马哈森林病毒的实时荧光RT‑PCR试剂盒和方法，检测巴马哈森林病毒的实时荧光RT‑PCR试剂盒中包括2×RT‑PCR Buffer，25×RT‑PCRenzymeMix，上下游引物，探针，所用引物和探针的核酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；阴性对照，阳性对照。本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒使用方便，试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，减少了在操作过程的污染，检测特异性强，灵敏度高，适用于快速检测巴马哈森林病毒。

Description

巴马哈森林病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂盒和方法

技术领域

本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种用于检测巴马哈森林病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂盒和方法。

背景技术

巴马哈森林病毒(Barmah Forest virus，BFV)属于甲病毒属单链RNA病毒，1974年首次从澳大利亚环纹库蚊中分离出，主要传播媒介是伊蚊属蚊虫和致倦库蚊。BFV感染可出现发热、头痛及肌肉和关节疼痛等症状，有时出疹，通常是在身躯或四肢上。大量的生活史分析和序列分析证实该病毒属于甲病毒属塞姆利基森林病毒的分支。

现在虽然我国尚未分离到BFV，但鉴于我国存在有相关媒介蚊虫，且随着我国与世界其他国家之间的贸易、旅游、人员往来日益频繁，BFV通过各种途径传入的可能性很大。有相关报道人群中曾检测出BFV抗体，如贵州省健康人群BFV IgG抗体阳性率为1.49％，不明原因发热患者中检出BFV IgM阳性率为1.96％，提示我国人群可能存在该病毒的感染。

目前，针对BFV的检测方法有血清学、组织免疫学检测、RT-PCR检测方法，但是采用血清学或组织免疫学的检测方法，费时、费力，且检测灵敏度低，不能满足通关要求快速、高效、安全、低风险的目的；其次，RT-PCR检测方法检测灵敏度低，易出现假阴性结果。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一组用于检测巴马哈森林病毒的核酸。本发明的另一个目的是提供一种用于检测巴马哈森林病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒及其检测方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于PCR检测巴马哈森林病毒的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示。

一组用于检测巴马哈森林病毒的实时荧光RT-PCR核酸，该组核酸包括引物对、探针和作为阳性对照的扩增产物，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述扩增产物为包含有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

一种检测巴马哈森林病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，该试剂盒包括：

2×RT-PCR缓冲液(buffer)；

25×RT-PCR酶的混合物(enzymeMix)；

上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

探针：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；

阴性对照：无核酸酶水；

阳性对照：包含有核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的基因。

如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光基团为FAM、CY3、HEX中任意一种，所述淬灭基团为BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

一种实时荧光RT-PCR方法检测巴马哈森林病毒的方法，该方法包括以下步骤：

(1)从样品中提取病毒RNA；

(2)对提取的RNA进行实时荧光RT-PCR扩增；其中，RT-PCR扩增时，反应体系采用上下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；

(3)收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。

如上所述的实时荧光RT-PCR方法检测巴马哈森林病毒的方法，优选地，所述步骤(2)中荧光RT-PCR扩增的反应体系具体如下：

1×RT-PCR缓冲液(Buffer)，

1×RT-PCR酶的混合物(Enzyme Mix)，

上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，

其中，所述探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；上下游引物和探针浓度分别为0.01～1μM样品RNA；同时设置无核酸酶水为阴性对照。

如上所述实时荧光RT-PCR方法检测巴马哈森林病毒的方法，优选地，上下游引物浓度为400nmol/L，探针的终浓度为200nmol/L。

如上所述的实时荧光RT-PCR方法检测巴马哈森林病毒的方法，优选地，所述步骤(2)中荧光RT-PCR扩增的反应程序为：

如上所述的实时荧光RT-PCR方法检测巴马哈森林病毒的方法，优选地，所述收集荧光信号的步骤包括，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了实时荧光RT-PCR检测巴马哈森林病毒的试剂盒，同时建立了一种比较高效、灵敏的巴马哈森林病毒的快速检测方法。提供的检测试剂盒使用方便，操作简便，自动化程度高，有效替代传统病毒分离来获得检测结果，且试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，并减少了在操作过程的污染，检测效果好，特异性强，灵敏度高。

提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号的变化来获得定量的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的检测。

本发明提供的检测试剂盒用于检测巴马哈森林病毒时，为了确认所用引物的特异性，避免出现假阳性结果的发生，经试验验证，与正布尼亚病毒属拉克罗斯病毒(La Crossevirus，LAC)、雪靴野兔病毒(Snowshoe hare virus，SSH)，黄病毒属乙脑病毒(Japaneseencephalitis virus，JEV)、黄热病毒(yellow fever virus，YFV)、库京病毒(Kunjinvirus，KUNV)、甲病毒属马雅罗病毒(Mayaro virus，MAYV)和东南亚十二节段RNA病毒属版纳病毒(Banna virus，BAV)等病毒均无交叉反应，特异性较好；且检测灵敏度高，可达4.55×10^-1fg/μL。

被巴马哈森林病毒感染，一般很难发现和控制，而本发明试剂盒具有较高的检测灵敏度，可以有助于提前发现感染巴马哈森林病毒者出现病症症状的潜伏期及不发病的隐性感染者，为能及时有效控制巴马哈森林病毒的传播与扩散，提供有效的技术支持。

附图说明

图1为本发明实时荧光PCR试剂盒检测巴马哈森林病毒灵敏度的扩增曲线。

图2为巴马哈森林病毒实时荧光PCR特异性扩增曲线。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

本发明的试剂盒的工作原理是根据核酸聚合酶链式反应(PCR)，通过设计巴马哈森林病毒特异性TaqMan探针及配套引物组成的荧光PCR反应体系，实现对巴马哈森林病毒核酸的检测。本发明的引物和探针可用于对巴马哈森林病毒E基因的特异性检测。

实施例1引物、探针、验证模板设计

通过对截止至2013年3月17日所公布的巴马哈森林病毒共计40株病毒的E基因进行的核酸序列比对分析，得到其保守性区域，并分析所有巴马哈森林病毒的E基因序列，寻找巴马哈森林病毒的特异性位点，用于设计实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针，以及靶基因保守片段序列片段。将得到的靶基因保守序列片段序列，与GenBank中所有序列进行比对分析，验证靶基因保守序列的特异性。在得到E基因上的保守片段序列上，设计引物序列及探针序列。应用分析软件包括Beacon Designer7.0、MEGA4和DNA Star等生物信息分析软件。

靶基因保守片段序列如下SEQ ID No.5所示(5’-3’)：

CTAGTGTCCAATACAGGTAAGTCGTACTCATTAGACCCAAAGACGAAGACCATCAAGTACAAATGCACTTGCGGCGAGACTGTAAAAGAAGGTACTGCTACGAACAAAATCACACTGTTCAATTGTGACACCGCCCCAAAGTGTATTACATATGCAGTGGATAACACAGTGTGGCAGTACAACTCCCAATACGTGCCCAGGTCCGAAGTTACGGAGGTGAAAGGAAAGATCCATGTGCCTTTCCCTCTGACCGACAGCACGTGTGCAGTCAGCGTAGCACCTGAACCGCAAGTGACATACAGACTGGGGGAAGTGGAGTTCCACTTCCACCCTATGTACCCCACCCTCTTCTCCATTAGGAGCCTCGGAAAGGATCCGAGCCACAGTCAAGAATGGATAGATACACCCATGAGCAAGACAATCCAAGTTGGGGCAGAAGGCGTGGAGTATGTCTGGGGAAA

其中，引物和探针的设计原则如下：

引物设计原则：

1.序列选取应在基因的保守区段；

2.避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；

3.避免引物自身形成环状发卡结构；

4.典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交交慢，从而降低了产量。Tm值在55-65℃，GC含量在40％-60％；

5.引物之间的TM相差避免超过2℃；

6.引物的3’端避免使用碱基A；

7.引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；

8.为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

探针设计原则：

1.探针位置尽可能地靠近上游引物；

2.探针长度通常在22-32bp，Tm值在65-70℃，通常比引物TM高5-10℃，GC含量在40％-70％；

3.探针的5’端应避免使用碱基G；

4.整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量；

5.为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在数据中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。

实施例2普通PCR检测巴马哈森林病毒

根据实施例1筛选巴马哈森林病毒E基因片段的保守序列，设计一对寡聚核苷酸序列(引物)和探针。最终确定引物扩增片段大小为109bp，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

设计的引物和探针如下：

BFV-F(SEQ ID No.1)：5′-ATGTGCCTTTCCCTCTGACC-3′

BFV-R(SEQ ID No.2)：5′-GGGTACATAGGGTGGAAGTGG-3′

BFV-P(SEQ ID No.3)：5′-CGTAGCACCTGAACCGCAAGTGACA-3′

SEQ ID No.4：

ATGTGCCTTTCCCTCTGACCGACAGCACGTGTGCAGTCAGCGTAGCACCTGAACCGCAAGTGACATACAGACTGGGGGAAGTGGAGTTCCACTTCCACCCTATGTACCC

应用设计的引物对巴马哈森林病毒进行普通PCR扩增，采用Takara OneStep RT-PCR Kit试剂盒，25μL反应体系：BFV-F、BFV-R引物终浓度各为0.2×10³nmol/L；2×RT-PCRbuffer 12.5μL；25×Enzyme mix1μL模板3μL，其余用无核酸酶水补足。

PCR扩增反应条件优选为：

反应条件：50℃，30min；94℃，2min；94℃，30sec；56℃，30sec；72℃，1min；72℃，10min；35个循环。

其中，设有阳性和阴性对照样品的检测，阴性对照为无核酸酶水；阳性对照为携带有如序列表SEQ ID No.4所示序列的质粒DNA。

对扩增产物进行电泳，结果显示，所设计的引物可有效扩增巴马哈森林病毒。

实施例3巴马哈森林病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒

巴马哈森林病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒包括以下成分：

2×RT-PCR Buffer；

25×RT-PCRenzymeMix；

上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

探针：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

阴性对照：无核酸酶水；

阳性对照：携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。

其中，所述2×RT-PCR Buffer和25×RT-PCRenzymeMix可选用ABI公司AgPath-IDTM One-step RT-PCR Kit；引物、探针、质粒委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，探针在合成时探针5＇端连接HEX荧光基团和3＇端连接BHQ1淬灭基团。

实施例4巴马哈森林病毒实时荧光RT-PCR检测的方法

本发明检测巴马哈森林病毒方法包括以下步骤：

(1)病毒RNA提取

病毒RNA提取可选用QIAamp Viral RNA提取试剂盒进行提取。

(2)RT-PCR扩增

采用实施例2制备的试剂盒配置反应体系，其组分及其体积优选采用下表1中组分配置。

表1反应体系

扩增条件：优选以下扩增条件：

(3)收集荧光信号信号，选择VIC(ABI 7500没有检测HEX的通道，但是两者波长相同，所以选择VIC替代)的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，即样品中含有巴马哈森林病毒核酸，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。

本发明所述的方法中，探针与荧光和淬灭基团相连，荧光-淬灭基团为优选为HEX-BHQ1，其它荧光-淬灭基团组合也同样适用，比如，HEX-TAMRA、FAM-TAMRA、FAM-BHQ1、CY3-BHQ1、CY3-BHQ2等，检测时选择相应的荧光检测模式。

上述RT-PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR***(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad实时PCR检测***、Stratagene定量多聚酶链反应仪(例如MX4000，MX3000，MX3005)。

实施例5本发明试剂盒灵敏度的检测

选择含有核苷酸序列如SEQ ID No.4的巴马哈森林病毒阳性质粒制备阳性模板，巴马哈森林病毒阳性质粒由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

具体地，阳性模板的制备如下：

对英潍捷基(上海)贸易有限公司合成的巴马哈森林病毒阳性质粒的菌液进行扩增、提取质粒、酶切、纯化和电泳鉴定。取电泳鉴定为阳性扩增的片段，相对应的纯化后的片段进行体外转录，SP6 5×Buffer 20μL，rNTP s 30μL，酶切纯化产物30μL，SP6Enzyme Mix10μL，Nuclease-Free Water 10μL，混合均匀，短暂离心，放入PCR扩增仪中，37℃，反应4h。加入1μL RQ1DNase到100μL体系，放入PCR扩增仪中37℃，15min。再次取出反应物，用酚氯仿法抽提RNA，得到的沉淀为巴马哈森林病毒阳性模板，用Nuclease-Free Water溶解，-80℃保存。

上述过程中相应步骤如无特殊说明均采用常规方法，其中，采用的试剂盒等试剂及其来源如下，高纯度质粒小提试剂盒为TIANGEN公司，XhoI酶为New England BioLabs公司，质粒回收纯化试剂盒为QIAGEN公司，SP6体外转录试剂盒为Promega公司的试剂盒。

将上述获得巴马哈森林病毒阳性模板，其浓度为4550ng/μL，进行10倍比稀释，即获得浓度从4.55×10^-1ng/μL至4.55×10^-9ng/μL的阳性模板样品。

利用实施例2制备的试剂盒进行巴马哈森林病毒的检测，其中，

1)NTC：无核酸酶水；

2)反应体系按照实施例3中表2进行配制，样本RNA采用上述稀释的阳性模板进行检测，每个梯度做三个平行样。

结果判定：Ct值≤37为阳性结果，Ct值＞37为阴性结果。检测结果的荧光值图，如图1所示。其中，样品中阳性模板的浓度分别为1：4.55×10^-1ng/μL，2：4.55×10^-2ng/μL，3:4.55×10^-3ng/μL，4：4.55×10^-4ng/μL，5：4.55×10^-5ng/μL，6：4.55×10^-6ng/μL，7：4.55×10^-7ng/μL，8：4.55×10^-8ng/μL，9：4.55×10^-9ng/μL，10：阴性对照，从图中也可看明显看出:1-7号的阳性样品均扩增出明显的扩增曲线，也就是说，本发明设计的引物和探针检测巴马哈森林病毒的检测灵敏度为4.55×10^-7ng/μL，即4.55×10^-1fg/μL。

实施例6本发明试剂盒的特异性检测

1)选择含核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的质粒作为阳性对照(BFV)；

2)阴性对照：无核酸酶水；

3)模板：选择正布尼亚病毒属拉克罗斯病毒(La Crosse virus，LAC)、雪靴野兔病毒(Snowshoe hare virus，SSH)，甲病毒属马雅罗病毒(Mayaro virus，MAYV)，黄病毒属库京病毒(kunjin virus，KUNV)均为英潍捷基(上海)贸易有限公司合成的E基因重组质粒；黄病毒属乙脑病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、黄热病毒(yellow fever virus，YFV)，东南亚十二节段RNA病毒属版纳病毒(Banna virus，BAV)均由中国检验检疫科学研究院提供。

4)反应体系按照实施例3中表2进行配制，之后进行实时荧光RT-PCR扩增。

检测结果如图2，结果表明，所建立的巴马哈森林病毒实时荧光PCR方法及其试剂盒对于除巴马哈森林病毒外的其他病毒没有特异性的扩增，表明设计的引物及探针特异性强。

实施例7：利用本发明试剂盒对样品进行检测

本发明的试剂盒针对病毒RNA提取液进行检测。人鼻咽拭子、组织等标本的RNA提取流程可参考WHO发布标准进行，推荐使用Roche公司的High Pure Viral RNA Kit(目录号：11858882001)或Qiagen公司的OIAampViral RNA Mini Kit(目录号：52904)进行病毒样本的RNA提取操作。

针对目前，蚊子中存在巴马哈森林病毒可能性大，对蚊子中巴马哈森林病毒的筛查检测显得尤为重要，下面主要是对蚊子中的巴马哈森林病毒进行检测。

利用本发明试剂盒，对蚊子的提取的RNA进行模拟阳性样品的检测，具体实验步骤如下：

(1)病毒RNA提取

病毒RNA提取选用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒进行提取。

a.匀浆处理：

从-80℃冰箱或液氮中取出蚊虫样本，置于预先加入3颗直径3mm的氧化锆颗粒的2mL圆底离心管中，再加入1.5mL研磨液(含10％青链霉素的细胞培养基)，用TOMY的组织研磨器4000次/min震荡60sec，直至成匀浆，于4℃，10,000rpm离心10min。

b.将上清转移至1.5mL离心管，4℃，12,000rpm，离心2min。取140μL上清液用于RNA提取，其余匀浆液置于-40℃保存。

总RNA提取

c.选用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒，根据样本的数量分装AVL液，每管560μL；

d.取140μL研磨液上清加入到560μL分装好的AVL液，涡旋震荡15s，充分混匀，室温孵育10min；

e.每管分别加入560μL的无水乙醇(96％-100％)，震荡15s充分混匀，快速离心；

f.从Kit中取出带滤柱的2mL的收集管，做好标记，取混合液630μL加入到收集管中，8000rpm离心1min；

g.将滤柱放置到新的2mL收集管中，将剩余的液体加入滤柱，8000rpm离心1min；

h.将滤柱移至新的收集管中，加入500μL AW1液，8000rpm离心1min；

i.滤柱放置到一个新的收集管中，加入500μL AW2液，14,000rpm离心3min；

j.将滤柱移到干净的1.5mL EP管中，加入60μL AVE，室温静置2min，8000rpm离心1min，即得到RNA，放置于-80℃冰箱保存备用。

(2)实时荧光RT-PCR扩增

优选实施例2制备的试剂盒配置反应体系，其组分及其体积见表1。

表1反应体系

扩增条件优选以下扩增条件：

(3)收集荧光信号信号，选择VIC的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，即样品中含有巴马哈森林病毒核酸，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。

本发明所述的方法中，探针与荧光和淬灭基团相连，所述荧光-淬灭基团为HEX-BHQ1。

在配置反应体系时，将阳性扩增的序列加入到蚊子提取RNA的模板样本中进行检测，由检测结果得出，加入阳性扩增的序列检测结果为阳性，并经测序验证结果正确，单纯蚊子提取RNA的模板检测为阴性，说明本发明试剂盒可应用于检测蚊子中巴马哈森林病毒，且检测结果准确、可靠。

Claims (9)

1.一种用于PCR检测巴马哈森林病毒的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

2.一组用于检测巴马哈森林病毒的实时荧光定量RT-PCR核酸，其特征在于，该组核酸包括引物对、探针和作为阳性对照的扩增产物，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述扩增产物为包含有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

3.一种检测巴马哈森林病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

2×RT-PCR缓冲液；

25×RT-PCR酶的混合物；

上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

探针：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；

阴性对照：无核酸酶水；

阳性对照：包含有核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的基因。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为FAM、CY3、HEX中任意一种，所述淬灭基团为BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

5.一种实时荧光RT-PCR方法检测巴马哈森林病毒的方法，所述方法是用于非诊断目的的，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)从样品中提取病毒RNA；

(2)对提取的RNA进行实时荧光RT-PCR扩增，其中，RT-PCR扩增时，反应体系中，采用上下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；同时设置无核酸酶水为阴性对照；

(3)收集荧光信号；

(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光RT-PCR扩增的反应体系具体如下：1×RT-PCR缓冲液，1×RT-PCR酶的混合物，上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；上下游引物和探针浓度分别为0.01～1μM，样品RNA；同时设置无核酸酶水为阴性对照。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述上下游引物浓度为400nmol/L，探针的终浓度为200nmol/L。

8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光RT-PCR扩增的反应程序为：

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)收集荧光信号包括，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线。