CN104357461A - 一种仔猪腹泻病毒变异株部分s基因及其原核表达载体的构建方法 - Google Patents
一种仔猪腹泻病毒变异株部分s基因及其原核表达载体的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104357461A CN104357461A CN201410710763.5A CN201410710763A CN104357461A CN 104357461 A CN104357461 A CN 104357461A CN 201410710763 A CN201410710763 A CN 201410710763A CN 104357461 A CN104357461 A CN 104357461A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- variant part
- virus variant
- expression vector
- grice diarrhoea
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因及其原核表达载体的构建方法，该构建方法由以下步骤组成：(a)以F1与R1为引物，F1：5’-GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3’；R1：5’-GTCGACTTAATTAAATGATGG-3’；利用PCR反应扩增得到如SEQ ID NO.1所示的编码仔猪腹泻病毒变异株部分S基因的基因序列；(b)将上述编码的仔猪腹泻变异株部分S基因序列连接至pET32a载体上，得重组表达载体pET32a-bs1；(c)将重组表达载体pET32a-bs1质粒转入大肠杆菌BL21菌株，250rpm震荡培养至对数期OD600＝0.6～0.7，加入1mmol/L IPTG，37℃诱导6h表达目的蛋白即仔猪腹泻病毒变异株部分S基因原核表达载体的构建，完成。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因及其原核表达载体的构建方法。
背景技术
猪流行性腹泻是由病毒引起的以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种急性、高度接触性肠道传染病。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)，只有一个血清型，属于冠状病毒科冠状病毒属，能感染各种年龄的猪都发病。
PEDV临床表现为水样腹泻，并伴有呕吐；所有日龄猪均可发生，其中出生10日龄以内哺乳仔猪，常常在维持腹泻2-4天后，脱水大量死亡(50％-100％)。一些地方的养猪场几乎整窝发病，呈水样腹泻，发病率高，病死率高，不死的仔猪成为弱仔和僵猪。日龄较大的哺乳仔猪的发病率和病死率相对较低一些。PEDV以感染乳猪、造成严重损失为特征；自2000年左右韩国大流行以来，周边地区均有暴发，我国一直处于地方性流行状态；PEDV在局部地区首先暴发后，未能及时有效控制，逐渐蔓延后，出现大流行。
自PEDV发现以来，各国学者使用多种方法尝试使病毒适应细胞，进行体外培养扩增。1988年瑞典Hoffman等首次在Vero传代细胞的培养液中加入胰酶，通过细胞上连续盲传成功获得病毒的细胞培养。随后日本和韩国也相继有培养成功的报道。但不同来源的Vero细胞、不同毒株和培养条件都是影响病毒分离的重要因素。PEDV的体外细胞培养适应难度大，繁殖条件复杂，病毒在细胞中繁殖滴度低，细胞病变不明显，一直是PEDV体外增殖过程的一个重要技术瓶颈。要分离到一株该病毒需要时间较长，工作量大，相关疫苗的发展也受到影响与限制。
目前，虽然商品化PEDV疫苗已普遍使用，有多个厂家的灭活苗和弱毒苗供选择，但免疫效果一直不理想，该病在我国仍有流行，并引起严重的经济损失。通过对病毒的分析，猪流行性腹泻病毒的结构蛋白与其他冠状病毒相似，糖基化纤突(spike)蛋白为主要结构蛋白。2010PED野毒在纤突蛋白基因区域出现***性突变，该区域为病毒的抗原决定区域。经典毒株CV777制备的疫苗以及变异前毒株(与经典毒株处于同一进化分支的)制备的疫苗，在病毒S蛋白发生变异后，疫苗治疗效果大打折扣，治疗效果不明显。为了对已变异的仔猪腹泻病毒PEDV进行有效的治疗，研制一种新的有效的PEDV疫苗十分必要。
发明内容
本发明的目的：(1)提供一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因；(2)提供一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因原核表达载体的构建方法；(3)一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因在大肠杆菌中的表达方法。
本发明的技术方案：(1)一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因，所述S基因由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列组成。(2)一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因原核表达载体的构建方法，其特征在于：该构建方法由以下步骤组成：
(a)以F1与R1为引物，F1：5’-GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3’；R1：5’-GTCGACTTAATTAAATGATGG-3’；利用PCR反应扩增得到如SEQ ID NO.1所示的编码仔猪腹泻病毒变异株部分S基因的基因序列；所述PCR反应体系为：2×Ex Taq PCR premix 10μl，cDNA 2μl，引物混合物1μl，双蒸水7μl；反应参数分为3步，第1步为95℃5min，第2步为95℃30s，57℃30s，72℃2min，35个循环，第3步为72℃延伸10min；
(b)将上述编码的仔猪腹泻变异株部分S基因序列连接至pET32a载体上，得重组表达载体pET32a-bs1；
(c)将重组表达载体pET32a-bs1质粒转入大肠杆菌BL21菌株，250rpm震荡培养至对数期OD600＝0.6～0.7，加入1mmol/L IPTG，37℃诱导6h表达目的蛋白即仔猪腹泻病毒变异株部分S基因原核表达载体的构建，完成。
(3)一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因在大肠杆菌中的表达方法，该表达方法有如下步骤组成：(1)挑取权利要求2中所述的大肠杆菌BL21菌落，接入含有抗生素的LB培养基，培养过夜；(2)取过夜培养物转接入含有抗生素的新鲜LB培养液中，250rpm震荡培养至对数期OD600＝0.6～0.7；(3)在培养物中加入浓度为1mmol/L的IPTG，37℃，诱导表达6h后，8000rpm，20min离心处理收集含有重组仔猪腹泻病毒变异株部分S基因的大肠杆菌菌体沉淀。
所述的质粒载体是含有SEQ ID NO.1基因，通过***pET32a载体构建成的。所述的重组工程菌是由上述质粒载体转化原核宿主细胞株得到的。该重组工程菌的原核宿主细胞株是大肠杆菌。所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。在合适的条件下于培养基中培育上述大肠杆菌。
本发明构建了仔猪腹泻病毒变异株部分S基因原核表达载体。通过应用PCR技术合成了仔猪腹泻变异株部分S基因序列，将该基因序列克隆至pET32a中，得到重组表达载体pET32a-bs1，再通过CaCl2转化大肠杆菌，根据生长情况快速筛选出表达量较高的阳性克隆转化子bs1，该表达蛋白目前可以通过大肠杆菌发酵生产，具有良好的应用前景。
有益效果：S蛋白是在PEDV的重要结构蛋白，可诱导机体产生中和抗体，是研究PEDV基因工程疫苗的主要目的基因。本发明成功构建了一株重组原核表达蛋白，能够稳定表达PEDV部分S基因蛋白。通过western-blotting试验证明重组蛋白具有反应原性；仔猪免疫试验证实，免疫激发了机体产生了针对仔猪流行性腹泻病毒变异株部分S蛋白的特异性的抗体，抗体中和效价达到≥1:32，所构建重组蛋白具有免疫原性。本发明所构建部分S基因包含纤突蛋白基因区域出现的***性突变部分，为PEDV新型变异株基因工程疫苗的研究奠定了重要基础。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明的构建流程图；
图2重组蛋白在E.coli BL21中的表达产物电泳图。其中，条带1：pET-32a空载体诱导；条带2：重组表达载体pET-32a-bs1未诱导；条带3：重组表达载体pET-32a bs1诱导4h；条带4：重组表达载体pET-32a bs1诱导5h；条带5：重组表达载体pET-32a bs1诱导6h；条带6：重组表达载体pET-32a bs1诱导7h；M：标准蛋白Marker
具体实施方式
实施例1.仔猪腹泻病毒变异株部分S基因序列的获得，根据仔猪腹泻病毒变异株的基因序列，设计以下引物：F1：5’-GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3’；R1：5’-GTCGACTTAATTAAATGATGG-3’；
利用PCR反应扩增编码腹泻病毒变异株部分S基因序列，PCR反应体系为(20μl)：2×Ex TaqPCR premix 10μl，cDNA 2μl，引物混合物1μl，双蒸水7μl。反应参数分为3步，第1步为95℃5min，第2步为95℃30s，57℃30s，72℃2min，35个循环，第3步为72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，回收产物连接pMD19-T克隆载体，筛选阳性质粒送上海生工生物工程有限公司测序，所得序列例如SEQ ID NO.1所示。
实施例2.重组大肠杆菌表达载体的构建
用EcoRⅠ和SalⅠ分别双酶切PCR扩增产物和pET32a质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，用T4DNA连接酶连接回收的目的条带，得到原核表达载体pET32a-bs1，用CaCl2法热激90秒将其转化到大肠杆菌BL 21(DE3)。利用Amp抗性筛选单菌落。所选转化克隆经PCR，酶切鉴定证明克隆正确后送北京博迈德生物工程有限公司测序。具体构建流程见图1.
实施例3.重组大肠杆菌表达载体的转化和筛选
将鉴定正确的重组表达载体pET32a-bs1质粒转入大肠杆菌BL21菌株，加入1mmol/L的IPTG诱导表达6h，加入磷酸缓冲液重悬细胞。
实施例4.变异株部分S基因在大肠杆菌中的表达
在10ml含100μg/ml Amp的LB液体培养基中，按1:1000接种BL21-pET32a-bs1菌液，37℃，250rpm震荡培养过夜；次日按1:50接种培养过夜的菌液至含100μg/ml的新LB液体培养基中，37℃，250rpm震荡培养至OD600＝0.6～0.7；每管分别加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达；分别在诱导4h，5h，6h，7h后收集菌液，4℃，8000rpm离心收集菌体；加入10ml 0.01M的磷酸盐缓冲液(简称PBS，pH 7.4)重悬菌体。4℃，8000rpm离心20min，弃上清。重复洗涤菌体一次。加入5ml上述缓冲液重悬菌体。SDS-PAGE电泳检测，如图2所示。在69kDa位置附近出现一条高表达量的特异性条带，分子量大小约69kDa，与理论值相符。
本发明的重组载体pET32a-bs1可以表达获得重组蛋白，小量制备蛋白免疫仔猪，免后2周检测抗体，可产生特异性抗体。本发明的成果将为PEDV基因工程疫苗的研究奠定基础。
SEQUENCE LISTING
<110> 新疆天康畜牧生物技术股份有限公司
<120> 一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因原核表达载体的构建方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1476
<212> DNA
<213> 仔猪腹泻病毒变异株部分S基因
<400> 1
gaattcgatg tcaccaggtg ctcagctaac actaatttta ggcggttctt ttcaaaattt 60
aatgttcagg cgcctgcagt tgttgtactg ggcggttatt taccttttgg tgaaaaccag 120
ggtgtcaatt caacttggta ctgtgctggc caacatccaa ctgctagtgg cgttcatggt 180
atctttgtta gccatattag aggtggtcat ggctttgaga ttggcatttc gcaagagcct 240
tttgacccta gtggttacca gctttattta cataaggcta ctaacggtaa cactaatgct 300
actgcgcgac tgcgcatttg ccagtttcct agcattaaat cattgggccc cactgctaat 360
aatgatgtta caacaggtcg taattgccta tttaacaaag ccatcccagc tcatatgagt 420
gaacatagtg ttgtcggcat aacatgggat aatgatcgtg tcactgtctt ttctgacaag 480
atctattatt tttattttaa aaatgattgg tcccgtgttg cgacaaagtg ttacaacagt 540
ggaggttgtg ctatgcaata tgtttacgaa cccacctatt acatgcttaa tgttactagt 600
gctggtgagg atggtatttc ttatcaactc tgtacagcta attgcattgg ttattctgcc 660
aatgtatttg ctactgagcc caatggccac ataccagaag gttttagttt taataattgg 720
tttcttttgt ccaatgattc cactttggtg catggtaagg tggtttccaa ccaaccattg 780
ttggtcaatt gtcttttggc cattcctaag atttatggac taggccaatt tttctccttt 840
aatcaaacga tcgatggtgt ttgtaatgga gctgctgtgc agcgtgcacc agaggctctg 900
aggtttaata ttaatgacac ctctgtcatt cttgctgaag gctcaattgt acttcatact 960
gttttaggaa caaatttttc ttttgtttgc agtaattcct cagatcctca cttagccacc 1020
ttcgtcatac ctctgggtgc tatccaagta ccctattatt gttttcttaa agtggatact 1080
tacaactcca ctgtttataa attcttggct gttttacctc ctaccgtcag ggaaattgtc 1140
atcaccaagt atggtgatgt ttatgccaat gggtttggct acttgcatct cggtcttttg 1200
gatgctgtca caattaattt cactggtcat ggcactgacg atgacgtttc tggtttttgg 1260
accatagcat cgactaattt tgttgatgca cttatcgaag ttcaaggaac tgccattcag 1320
cgtattcttt attgtgatga tcctgttagc caactcaagt gttctcaggt tgcttttgac 1380
cttgacgacg gtttctaccc tatttcttct agaaaccttc tgagtcatga acagccaagt 1440
tcttttgtta ctttgccatc atttaattaa gtcgac 1476
Claims (3)
1.一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因，其特征在于：所述S基因由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列组成。
2.一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因原核表达载体的构建方法，其特征在于：该构建方法由以下步骤组成：
(a)以F1与R1为引物，F1：5’-GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3’；R1：5’-GTCGACTTAATTAAATGATGG-3’；利用PCR反应扩增得到如SEQ ID NO.1所示的编码仔猪腹泻病毒变异株部分S基因的基因序列；所述PCR反应体系为：2×Ex Taq PCR premix 10μl，cDNA 2μl，引物混合物1μl，双蒸水7μl；反应参数分为3步，第1步为95℃5min，第2步为95℃30s，57℃30s，72℃2min，35个循环，第3步为72℃延伸10min；
(b)将上述编码的仔猪腹泻变异株部分S基因序列连接至pET32a载体上，得重组表达载体pET32a-bs1；
(c)将重组表达载体pET32a-bs1质粒转入大肠杆菌BL21菌株，250rpm震荡培养至对数期OD600＝0.6～0.7，加入1mmol/L IPTG，37℃诱导6h表达目的蛋白即仔猪腹泻病毒变异株部分S基因原核表达载体的构建，完成。
3.一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于：该表达方法有如下步骤组成：(1)挑取权利要求2中所述的大肠杆菌BL21菌落，接入含有抗生素的LB培养基，培养过夜；(2)取过夜培养物转接入含有抗生素的新鲜LB培养液中，250rpm震荡培养至对数期OD600＝0.6～0.7；(3)在培养物中加入浓度为1mmol/L的IPTG，37℃，诱导表达6h后，8000rpm，20min离心处理收集含有重组仔猪腹泻病毒变异株部分S基因的大肠杆菌菌体沉淀。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410710763.5A CN104357461A (zh) | 2014-11-27 | 2014-11-27 | 一种仔猪腹泻病毒变异株部分s基因及其原核表达载体的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410710763.5A CN104357461A (zh) | 2014-11-27 | 2014-11-27 | 一种仔猪腹泻病毒变异株部分s基因及其原核表达载体的构建方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104357461A true CN104357461A (zh) | 2015-02-18 |
Family
ID=52524770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410710763.5A Pending CN104357461A (zh) | 2014-11-27 | 2014-11-27 | 一种仔猪腹泻病毒变异株部分s基因及其原核表达载体的构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104357461A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106554944A (zh) * | 2015-09-28 | 2017-04-05 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 猪流行性腹泻病毒弱毒株及其制备的疫苗组合物和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103088039A (zh) * | 2013-01-14 | 2013-05-08 | 广东大华农动物保健品股份有限公司 | 一种猪流行性腹泻病毒s基因抗原表位的扩增方法 |
-
2014
- 2014-11-27 CN CN201410710763.5A patent/CN104357461A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103088039A (zh) * | 2013-01-14 | 2013-05-08 | 广东大华农动物保健品股份有限公司 | 一种猪流行性腹泻病毒s基因抗原表位的扩增方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 毕玉敏等: "猪流行性腹泻病毒Ｓ蛋白部分抗原表位基因的原核表达及表达产物的免疫原性分析", 《中国兽医科学》 * |
| 王萃瑜: "猪流行性腹泻病毒部分S基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106554944A (zh) * | 2015-09-28 | 2017-04-05 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 猪流行性腹泻病毒弱毒株及其制备的疫苗组合物和应用 |
| CN106554944B (zh) * | 2015-09-28 | 2020-04-14 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 猪流行性腹泻病毒弱毒株及其制备的疫苗组合物和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104248762B (zh) | 一种猪流行性腹泻疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| CN103585625B (zh) | 一种猪流行性腹泻重组杆状病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用 | |
| CN103194472B (zh) | 猪流行性腹泻s1蛋白融合基因及重组巨大芽孢杆菌和应用 | |
| CN103539842B (zh) | 草鱼呼肠孤病毒ⅱ型s10基因编码的重组蛋白、由其制备的多克隆抗体及应用 | |
| CN101903399A (zh) | 梭菌毒素netb | |
| CN103304642B (zh) | 猪轮状病毒δvp8*亚单位重组蛋白及其应用 | |
| CN105087624A (zh) | 一种猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达载体及其构建方法和应用 | |
| CN109078178B (zh) | 一种产气荚膜梭菌β毒素重组亚单位疫苗及其生产方法 | |
| CN107899008A (zh) | 一种猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪丁型冠状病毒病三联亚单位疫苗 | |
| Zhao et al. | Reducing microbial ureolytic activity in the rumen by immunization against urease therein | |
| CN104693310A (zh) | 一种嵌合蛋白、病毒样颗粒及其应用 | |
| CN103881956A (zh) | 一种以乳酸乳球菌为载体的抗幽门螺杆菌疫苗 | |
| CN110038124B (zh) | 猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位的疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN107753940A (zh) | 一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法 | |
| CN101721696A (zh) | 猪副嗜血杆菌血清4型、5型、13型三价油乳剂灭活疫苗 | |
| CN103103205B (zh) | 编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用 | |
| CN102816246A (zh) | 一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法和用途 | |
| CN107880120B (zh) | 一种猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体及其制备方法 | |
| CN101838658A (zh) | O型***病毒变异株及其编码基因和应用 | |
| CN103525782A (zh) | 一种突变的有机磷农药降解酶基因及其应用 | |
| CN103421832A (zh) | 包含氟苯尼考耐药基因蛋白的卵黄抗体及制备与应用 | |
| CN103451195A (zh) | 突变的噬菌体裂解基因e、含有该裂解基因的裂解质粒载体和在制备菌影疫苗中的应用 | |
| CN104357461A (zh) | 一种仔猪腹泻病毒变异株部分s基因及其原核表达载体的构建方法 | |
| CN104894045A (zh) | 一种共表达***病毒vp1基因与免疫佐剂牛il-6基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用 | |
| CN102031262A (zh) | 一种表达faeG的基因工程益生菌的构建方法及用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150218 |