CN104357369B - 生物防治链霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物防治链霉菌及其应用。本发明的生物防治链霉菌，命名为链霉菌Lnu‑12(Streptomyces sp.lnu‑12)，保藏编号为CCTCCNO：M2014554。本发明采用平板对峙法，检测Lnu‑12对多种植物病原菌具有拮抗作用，其中对瓜类枯萎病菌抑制作用最强，抑菌带平均宽度达到19～21mm，对番茄叶霉病菌、番茄早疫病菌有很强的抑制作用，抑菌带宽分别为15mm和17mm，对辣椒根腐病菌有一定的抑制作用，抑菌带宽13mm，链霉菌Lnu‑12在大棚蔬菜土传病害的生物防治中具有很好的应用前景。

Description

生物防治链霉菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种具有高效、广谱的抗多种植物病害病原菌的链霉菌菌株及其应用。
本发明所称的生物防治链霉菌，命名为链霉菌Lnu-12(Streptomyces sp.lnu-12)，已于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014554。
背景技术
利用化学药剂防治害虫的方法，是目前农作物防治害虫的最常用方法，然而化学农药的过量使用所引起的环境污染和人畜安全问题已成为全球高度关注热点，是人类可持续发展战略的实施亟待解决的问题。近年来，符合环保、健康、持续发展理念的生物农药开发已成为解决上述难题的主要手段，生物防治作为植物病害防治的一项重要措施，已引起人们的高度重视。
发明内容
本发明的目的在于提供一种绿色环保，高效、广谱的抗多种植物病害病原菌的生物防治链霉菌。
本发明的另一目的是提供链霉菌Lnu-12在抑制植物病原菌中的应用。
本发明的生物防治链霉菌，命名为链霉菌Lnu-12(Streptomyces sp.lnu-12)，已于2014年11月6日，在武汉中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014554。
本发明的链霉菌Lnu-12，是从沈阳市东陵区蔬菜大棚土壤中分离筛选而得。将土壤样品稀释105，利用高氏一号培养基，采用常规的平板划线分离法进行分离培养，挑取放线菌单菌落，编号备用，筛选而得。
1、链霉菌Lnu-12形态特征：
Lnu-12在高氏一号培养基上生长良好，图1为Lnu-12在光学显微镜100X下的孢子丝和气生菌丝形态，气生菌丝发达，多分枝；孢子丝多为直或波曲形，无紧密螺旋；孢子呈圆形、卵圆形。图2为Lnu-12在高氏一号培养基上培养特征(正面)，图3为Lnu-12在高氏一号培养基上培养特征(反面)，图2和3显示在菌落边缘无吸水斑，无可溶性色素产生。均符合链霉菌属的特征。
2、Lnu-12生理生化特性：
明胶液化、过氧化氢实验、纤维素水解、卵磷脂酶实验均呈阳性；牛奶凝固与胨化、淀粉水解、MR实验、硫化氢实验、色氨酸分解实验、硝酸盐还原实验均为阴性；可利用葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、淀粉、蔗糖、半乳糖、纤维二糖作为碳源生长,生理生化反应特性与淀粉链霉菌一致。
3、链霉菌Lnu-12的16S rDNA序列分析方法：
(1)链霉菌Lnu-12的DNA提取采用反复冻融法，以此为模板进行PCR扩增。
(2)PCR引物：正向引物BSF8/27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
反向引物BSR1541/1522：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。
(3)PCR引物由上海生物工程有限公司合成。
(5)PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃1.5min；30个循环；72℃5min。
本发明链霉菌Lnu-12菌株，PCR产物测序由上海生物工程有限公司完成，测得的序列如SCQ ID No.1所示，将所测得的16S rDNA序列用BLAST搜索工具从GeneBank中调出与其相关的16S rDNA序列，然后用CLASTAL X软件进行多序列比对，并采用MEGA4.1软件中的邻位相接法(Neighbor-Joining)进行***进化树的构建与同源性比较，所构建的***进化树见图4。
链霉菌Lnu-12菌株经PCR技术，DNA测序仪分析，它的16S rDNA序列全长1424bp，将其与GeneBank数据库中相关菌株的16S rDNA序列进行比较，结果与已报道的淀粉链霉菌瓦灰亚种(S.diastaticus subsp.Ardesiacus)同源性达到99％。
本发明从沈阳东陵区蔬菜大棚土壤中分离得到生防菌株Lnu-12，通过生理生化反应，并利用PCR反应扩增该菌株的16S rDNA，经过测序鉴定，利用CLASTAL X软件进行多序列比对，然后用MEGA4.1软件中的邻位相接法(Neighbor-Joining)进行***进化树的构建，鉴定链霉菌Lnu-12(Streptomyces sp.lnu-12)菌株为淀粉链霉菌瓦灰亚种(S.diastaticussubsp.Ardesiacus)。
本发明的有益效果是：本发明所提供的链霉菌Lnu-12对多种植物病原菌具有拮抗作用，其中对瓜类枯萎病菌抑制作用最强，抑菌带平均宽度达到19～21mm。本发明所提供的链霉菌Lnu-12具有高效广谱的抑菌谱，抗植物病害能力较强。以番茄叶霉病为例，以Lnu-12发酵液进行了田间药效实验，结果显示Lnu-12发酵液稀释50倍后对番茄叶霉病具有显著的防治效果，防治效果可以达到70％，明显高于对照药剂。
附图说明
链霉菌Lnu-12(Streptomyces sp.lnu-12)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称：CCTCC，保藏单位地址：中国，武汉大学，邮政编码：430072。保藏日期为2014年11月6日，保藏编号为CCTCC NO：M2014554。
图1为Lnu-12的孢子丝和气生菌丝形态(光学显微镜100X)。
图2为Lnu-12在高氏一号培养基上培养特征(正面)。
图3为Lnu-12在高氏一号培养基上培养特征(反面)。
图4为Lnu-12菌株的***发育进化树。
具体实施方式
实施例1链霉菌Lnu-12(Streptomyces sp.lnu-12)的抑菌作用
1、活化：将链霉菌Lnu-12(Streptomyces sp.lnu-12)(CCTCC NO：M 2014554)，在无菌操作台上操作，用无菌接种环沾取保藏的菌液后均匀涂在高氏1号斜面固体平板上，28℃培养3～5天。
2、采用平板对峙法，刮取经过活化的Lnu-12孢子制备悬浮液，均匀涂在高氏1号培养基固体平板上，28℃培养3～5天。
3、用直径7mm的无菌打孔器打制菌饼，放置于PDA平板中央，28℃培养2天后，再于四周靠近边缘等距离接种用同样方法打制的六种不同病原菌菌饼，28℃培养4～6天，观察记录抑菌情况。每处理重复3次。
六种不同的病原菌是：辣椒根腐病菌(Pepper Root Rot)、番茄叶霉病菌(Cladosporium fulvum)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、甜瓜枯萎病菌(Fusariwnoxysporum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.cucumerinum)。
4、结果如表1
表1
病原菌 抑菌带平均宽度
辣椒根腐病菌(Pepper Root Rot) 13mm
番茄叶霉病菌(Cladosporium fulvum) 15mm
番茄早疫病菌(Alternaria solani) 17mm
甜瓜枯萎病菌(Fusariwn oxysporum) 19mm
西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum) 20mm
黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum) 21mm
由表1可见，本发明的链霉菌Lnu-12对所有供试菌株均有一定的抑制作用。其中对瓜类枯萎病菌抑制作用最强，达到19～21mm,对番茄叶霉病菌、番茄早疫病菌有很强的抑制作用，抑菌带宽分别为15mm和17mm，对辣椒根腐病菌有一定的抑制作用，抑菌带宽13mm。
实施例2生物防治菌Lnu-12发酵液对番茄叶霉病的防治效果
将本发明获得的菌株Lnu-12在高氏一号斜面培养基上28℃培养，产生足量的孢子后制成孢子悬浮液，以3％的量接种于250ml三角瓶内的发酵培养基(玉米粉4.0％、KNO30.2％、FeSO40.02％、NaCl 0.02％，CaCO30.2％，余量为水)中，28℃，180r/min振荡培养5天。发酵液7000r/min离心20min，上清液置4℃冰箱中备用。
在玻璃温室内采用盆栽接种的方式，将番茄叶霉病菌在PDA培养基上26℃恒温培养4-5d，取7-8叶期番茄苗用5号注射器针头在中部叶片刺4针，然后将番茄叶霉病菌菌饼贴在针刺处，用无菌脱脂棉蘸无菌水覆盖其上保湿，每处理15株，3次重复，28-30℃高温培养，保湿48h后去除菌饼。将上述发酵上清液50倍稀释液，50％多菌灵WP 500倍液及清水对照均匀喷于叶片的反正面，以叶面滴水为度。接种7天后调查病情指数，计算防治效果。
本发明采用了生产中常用的抗真菌药剂多菌灵为阳性对照，盆栽实验结果显示，采用上述优化的发酵条件，菌株Lnu-12的发酵液对番茄叶霉病具有很好的药效，处理后病情指数为20.5，明显低于对照，防治效果可达69.9％。优于对照药剂50％多菌灵WP。
表2 Lnu-12发酵液对番茄叶霉病的防治效果

Claims (1)

1.链霉菌Lnu-12抑制植物病原菌的方法，其特征在于方法如下：将链霉菌Lnu-12于发酵培养基中发酵，将发酵上清液稀释50倍后，以喷洒的方式施用于已患有植物病原菌的植物叶片上，所述的植物病原菌是：甜瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)和黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum)；所述链霉菌(Streptomyces sp.)Lnu-12，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2014554；其16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示，为淀粉链霉菌瓦灰亚种(Streptomyces.diastaticus subsp.Ardesiacus)。
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