CN104356214B - 一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsBET11a与应用 - Google Patents
一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsBET11a与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104356214B CN104356214B CN201410604973.6A CN201410604973A CN104356214B CN 104356214 B CN104356214 B CN 104356214B CN 201410604973 A CN201410604973 A CN 201410604973A CN 104356214 B CN104356214 B CN 104356214B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- plant
- gsbet11a
- sequence
- gscbrlk
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 55
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 claims description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 5
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 abstract description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 21
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 20
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 8
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 8
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 229910009891 LiAc Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005267 amalgamation Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 3
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 3
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000104 Actin-related protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000793832 Arabidopsis thaliana Calmodulin-binding receptor kinase CaMRLK Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000010663 Gene Expression Interactions Effects 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000353097 Molva molva Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000004176 azorubin Substances 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsBET11a与应用。该蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。通过实验证明，本发明的蛋白具有提高植物抗盐胁迫的功能，该蛋白在植物育种方面具有重要应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsBET11a与应用。
背景技术
目前，受全球气候变化、人口不断增长的影响，土壤盐碱化日趋严重。我国长江以北以及沿海许多地区，土壤中盐碱含量往往过高，对植物造成危害。这种由于土壤盐碱含量过高对植物造成的危害称为盐害，植物对盐害的适应能力叫抗盐性。根据许多研究报道，土壤含盐量超过0.2％～0.25％时就会造成危害。据***教科文组织和粮农组织不完全统计，我国盐碱地总面积为9913万hm2，东北松嫩平原西部有盐碱地373万hm2，其中黑龙江省盐碱地面积就高达1740余万亩。为确保我国粮食供给的安全，全国耕地面积必须保证在18亿亩以上，但实际上我国的耕地面积却逐年减少，目前已逼近这一红线。因此，开发利用盐碱地和挖掘逆境生态区的生产潜力成为了保障我国农业稳定持续高效发展的重要课题。
近年来，随着分子生物学技术的飞速发展和基因工程技术的日臻成熟，通过挖掘耐盐碱的关键调控基因，借助转基因分子育种手段来改良作物的抗盐碱性，进而提高作物产量也已成为可能。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白质。
本发明所提供的蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。
本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B6)中的任一种：
B1)编码上述所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组质粒、或含有B2)所述表达盒的重组质粒；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组菌、或含有B2)所述表达盒的重组菌、或含有B3)所述重组载体的重组菌；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
上述所述蛋白质或上述所述相关生物材料在提高植物抗逆性中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述抗逆性为抗盐胁迫。
上述蛋白质在与GsCBRLK蛋白相互作用中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种构建转基因植物的方法。
本发明所提供的构建转基因植物的方法，包括如下步骤：使上述蛋白质在出发植物中过表达，进而使植物的抗逆性提高。
上述方法中，所述使上述蛋白质在出发植物中过表达的方法为：向出发植物中导入上述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；转基因植物与出发植物相比，抗逆性提高。
上述方法中，所述抗逆性为抗盐胁迫。
上述方法中，所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
本发明提供了一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsBET11a与应用。通过实验证明，本发明的蛋白具有提高植物抗盐胁迫的功能，该蛋白在植物育种方面具有重要应用价值。
附图说明
图1为GsCBRLK蛋白在酵母细胞NMY51中的表达。
图2为酵母双杂交筛选及回转验证。图2A为在10mM3-AT的SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上的复筛；图2B为在2mM3-AT、10mM3-AT、40mM3-AT的SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上的回转验证。
图3为采用酵母双杂交技术在酵母体内验证GsBET11a与GsCBRLK蛋白相互作用。
图4为采用BiFc技术在植物体内验证GsBET11a与GsCBRLK蛋白相互作用。
图5为GsBET11a蛋白在植物细胞内的亚细胞定位分析。
图6为在盐胁迫条件下的野生型与转基因拟南芥种子的萌发情况、种子萌发率、幼苗展叶率和鲜重的比较。
图7为在盐胁迫条件下的野生型与转基因拟南芥幼苗的根长、叶绿素含量和丙二醛含量的比较。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验材料：野生大豆G50109种子在文献“Liang Yang,Wei Ji,Yanming Zhu,PengGao,Yong Li,Hua Cai,Xi Bai and Dianjing Guo.GsCBRLK,a calcium/calmodulin-binding receptor-like kinase,is a positive regulator of plant tolerance tosalt and ABA stress.Journal of Experimental Botany,2010,61(9):2519-33.”中公开过，公众可从东北农业大学处获得。
pA7-NYFP和pA7-CYFP载体在文献“Chen S,Tao L,Zeng L,Vega-Sanchez ME,Umemura K,Wang GL.A highly efficient transient protoplast system foranalyzing defence gene expression and protein-protein interactions inrice.Mol Plant Pathol.2006,7(5):417-27.”中公开过，公众可从东北农业大学获得。
pCAMBIA330035Su载体在文献“Hussam H.Nour-Eldin,Bjarne G.Hansen,MortenH.H.Jacob K.Jensen and Barbara A.Halkier.Advancing uracil-excisionbased cloning towards an ideal technique for cloning PCR fragments.NucleicAcids Research,2006,3(18):e122.”中公开过，公众可从东北农业大学获得。
实施例1、野生大豆中耐盐相关蛋白编码基因GsBET11a的分离
一、野生大豆cDNA文库的构建
1、选取饱满的野生大豆G50109种子，用浓H2SO4处理10min，无菌水冲洗3～4次，25℃暗培养2-3d催芽。待芽长到1～2cm时，将其转移至1/4Hogland营养液中，置于人工气候箱中培养。
2、取3周龄野生大豆幼苗的根(根尖3cm)和叶(未完全展开的第3个三出复叶)，采用RNaprep pure Plant Kit(天根，货号DP441)试剂盒提取总RNA。
3、以总RNA为模板，采用EasyClone reverse transcriptase(DUAL，货号P01011)反转录合成第一链cDNA。
4、采用EasyClone Polymerase Mix(DUAL，货号P01011)进行LD-PCR获得dsDNA，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，观察到0.3～6Kb的弥散状条带。采用SfiI(Fermentas，货号FD1824)酶切dsDNA，通过CHROMA SPINTM-400(Clontech，货号636076)纯化dsDNA去除小片段。
5、将纯化后的dsDNA与SfiI酶切后的pPR3-N(DUAL，货号P03234)载体连接，电转化大肠杆菌感受态细胞DH10B(Invitrogen,货号12033015)，共获得约1.2×106个单克隆，文库复杂度符合要求。
6、随机挑选20个阳性克隆进行PCR检测，发现扩增条带大小在200-2000bp之间，文库覆盖度较大。
7、收集所有单克隆，提取质粒备用。
二、耐盐碱蛋白激酶基因GsCBRLK酵母双杂交诱饵表达载体的构建
1、设计GsCBRLK基因PCR扩增的引物，并在引物两端添加SfiI酶切位点(下划线所示序列为酶切识别位点)。引物序列如下：
5’-ATTAACAAGGCCATTACGGCCATGAAGAAAACACCAG-3’；
5’-AACTGATTGGCCGAGGCGGCCCCAGCAGATACAAATT-3’。
2、以pET32b-GsCBRLK质粒为模板，采用上述步骤1中的引物PCR扩增GsCBRLK基因全长CDS区，用SfiI酶切PCR回收产物和pBT3-STE空载体，并回收酶切产物。
3、将酶切回收后的GsCBRLK基因与pBT3-STE载体连接，构建pBT3-STE-GsCBRLK诱饵表达载体，使GsCBRLK蛋白与LexA-VP16-Cub融合表达。
三、GsCBRLK蛋白表达及拓扑结构分析
为了检测GsCBRLK诱饵蛋白是否表达，采用LiAc法制备酵母NMY51感受态细胞，通过LiAc/PEG法将pBT3-STE-GsCBRLK诱饵表达载体转化酵母感受态细胞，再用液体SD/-Leu培养基活化重组酵母菌，采用TCA法提取酵母总蛋白，进行Western blot检测。结果显示在含pBT3-STE-GsCBRLK质粒的酵母总蛋白中能够检测到目的条带，说明GsCBRLK蛋白在酵母细胞NMY51中能够正常表达(图1)。
为了统计重组酵母菌在不同选择培养基上的生长情况，将pBT3-STE-GsCBRLK/pOst1-NubI、pBT3-STE-GsCBRLK/pPR3-N、pTSU2-APP/pNubG-Fe65、pTSU2-APP/pPR3-N共转化酵母NMY51感受态细胞，并涂板至SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His、SD/-Trp-Leu-His-Ade筛选培养基，30℃倒置培养3-7d后发现：含pBT3-STE-GsCBRLK/pOst1-NubI的重组酵母菌在SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培养基上均能正常生长，说明GsCBRLK蛋白拓扑结构符合该酵母双杂交***；含pBT3-STE-GsCBRLK/pPR3-N的酵母菌在SD/-Trp-Leu培养基上正常生长，但在SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上则不生长(表1)。因此，在进行大规模酵母双杂交筛选时，我们采用SD/-Trp-Leu-His作为筛选培养基。
表1、GsCBRLK蛋白拓扑结构分析
四、利用酵母双杂交技术从野生大豆cDNA文库中筛选GsBET11a基因
采用PEG/LiAc法，将文库质粒转化含pBT3-STE-GsCBRLK的酵母NMY51感受态细胞，并涂板至SD/-Trp-Leu-His培养基，共筛选获得了131个阳性克隆。将阳性克隆划线至含10mM3-AT的SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上进行复筛，共获得66个阳性克隆(图2A)。提取重组酵母质粒，转化大肠杆菌使Prey质粒大量复制，与pBT3-STE-GsCBRLK共转化酵母NMY51感受态。经过2mM3-AT、10mM3-AT和40mM3-AT的SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上的复筛，共获得24个阳性克隆(图2B)。将阳性克隆送交测序，发现其中2个克隆均编码全长或部分GsBET11a基因。根据栽培大豆同源基因序列设计PCR扩增引物，同源克隆GsBET11a基因。
引物序列如下：5’-ATGAATGCTAGAAGAGATGGTCG-3’；
5’-TTACCTAGTCAGATAGTATATTATAAGAAAAAG-3’
实施例2、GsBET11a与GsCBRLK蛋白相互作用验证
为了证明GsBET11a与GsCBRLK蛋白能否相互作用，本发明采用酵母双杂交Y2H和免疫双分子荧光互补BiFc技术进行验证。
一、采用酵母双杂交技术在酵母体内验证GsBET11a与GsCBRLK蛋白相互作用
1、以3周龄野生大豆幼苗的cDNA为模板，采用特异引物PCR扩增GsBET11a基因全长CDS区(下划线所示序列为酶切识别位点)。引物序列如下：
5’-TTTGAATTCCATGAATGCTAGAAGAG-3’；
5’-AAGGTCGACTTACCTAGTCAGATAGTATATT-3’。
2、扩增产物经EcoRI和SalI双酶切后与pPR3-N载体(DUAL，货号P03234)连接，构建酵母双杂交表达载体，使GsBET11a蛋白与NubG融合表达，将得到的重组载体记作pPR3-N-GsBET11a。
将载体pPR3-N-GsBET11a进行测序验证，结果表明：在pPR3-N载体的EcoRI和SalI酶切位点间***的GsBET11a基因序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第1-381位核苷酸所示，表明载体正确。
3、采用PEG/LiAc法，将pBT3-STE-GsCBRLK与pPR3-N(阴性对照)、pOst1-NubI(阳性对照)和pPR3-N-GsBET11a载体共转化酵母NMY51感受态细胞，PCR鉴定获得阳性克隆。
4、用液体SD/-Trp-Leu培养基，将PCR鉴定阳性的重组酵母菌活化至OD600＝0.6，按1:10、1:100、1:1000稀释菌液。分别取1μL在SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade、SD/-Trp-Leu-His-Ade+40mM3-AT固体培养基上点点，于30℃培养箱中倒置培养4d。
结果表明：含pBT3-STE-GsCBRLK/pPR3-N(阴性对照)的重组酵母菌能在SD/-Trp-Leu培养基上正常生长，而不能在SD/-Trp-Leu-His-Ade、SD/-Trp-Leu-His-Ade+40mM3-AT培养基上生长。而含pBT3-STE-GsCBRLK/pOst1-NubI(阳性对照)和pBT3-STE-GsCBRLK/pPR3-N-GsBET11a的重组酵母菌在SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade、SD/-Trp-Leu-His-Ade+40mM3-AT培养基上均能正常生长(图3)。该结果表明GsBET11a能够在酵母体内与GsCBRLK蛋白相互作用。
二、采用BiFc技术在植物体内验证GsBET11a蛋白与GsCBRLK蛋白相互作用
1、采用含酶切位点的基因特异引物，以pBT3-STE-GsCBRLK和pPR3-N-GsBET11a质粒为模板，PCR扩增GsCBRLK和GsBET11a基因。引物序列如下(下划线代表酶切位点)：
GsCBRLK的扩增引物：5’-TAACTCGAGATGAAGAAAACACCAGCCC-3’，
5’-GGGACTAGTAGCAGATACAAATTTATAG-3’；
GsBET11a的扩增引物：5’-TATCTCGAGATGAATGCTAGAAGAG-3’，
5’-GGGACTAGTCCTAGTCAGATAGTATATT-3’。
2、PCR产物双酶切后分别与pA7-NYFP和pA7-CYFP载体连接，构建植物瞬时表达载体，使GsCBRLK与NYFP融合表达(GsCBRLK-NYFP)，GsBET11a与CYFP融合表达(GsBET11a-CYFP)，将两种载体分别记作pGsCBRLK-NYFP和pGsBET11a-CYFP。
3、采用PEG法将pGsCBRLK-NYFP/pGsBET11a-CYFP、pA7-NYFP/pA7-CYFP(阴性对照)和pAtbZIP63-NYFP/pAtbZIP63-CYFP(阳性对照)分别共转化拟南芥原生质体，用激光共聚焦观察YFP荧光信号。
激光共聚焦结果如图4所示，其中NYFP/CYFP(阴性对照)共表达时未观察到YFP荧光信号，而共表达AtbZIP63-NYFP/AtbZIP63-CYFP(阳性对照)和GsCBRLK-NYFP/GsBET11a-CYFP的原生质体中能观察到黄色荧光信号。结果表明：GsBET11a能够在植物体内与GsCBRLK蛋白相互作用。
实施例3、GsBET11a蛋白在植物细胞内的亚细胞定位分析
为了定位GsBET11a蛋白在植物细胞内的分布，对GsBET11a蛋白进行了亚细胞定位分析。具体步骤如下：
1、采用基因特异引物PCR扩增GsBET11a基因全长CDS区(下划线所示序列为酶切识别位点)。引物序列如下：
5’-TTACTCGAGATGAATGCTAGAAGAGAT-3’；
5’-GGGACTAGTCCTAGTCAGATAGTATATTAT-3’。
2、将扩增产物与pBSK-eGFP载体连接，构建GsBET11a-eGFP融合表达载体，记作pBSK-GsCBRLK-eGFP。
将载体进行测序验证，结果表明：连入pBSK-eGFP载体的GsBET11a基因序列如SEQID No.1中自5’末端起第1-378位核苷酸所示，表明载体正确。
3、通过PEG法将pBSK-GsCBRLK-eGFP和pBSK-eGFP(阳性对照)转化拟南芥原生质体，通过激光共聚焦显微镜在488nm激发波长下观察绿色荧光蛋白的表达情况。
结果表明：GFP阳性对照在原生质体细胞中遍在表达，而GsBET11a蛋白主要定位在细胞质膜和转运囊泡等膜转运***，如图5所示。
实施例4、GsBET11a转基因拟南芥植株的获得及耐盐性分析
一、植物表达载体的构建
1、以pPR3-N-GsBET11a质粒为模板，采用如下引物PCR扩增GsBET11a基因全长CDS区。引物序列如下(下划线所示序列为酶切识别位点)：
5’-GGCTTAAUATGAATGCTAGAAGAG-3’；
5’-GGTTTAAUTTACCTAGTCAGATAGTATATT-3’。
2、采用pCAMBIA330035Su载体作为植物超量表达载体，将扩增产物与pCAMBIA330035Su载体连接，构建GsBET11a植物超量表达载体pCAMBIA330035Su-GsBET11a。
将载体pCAMBIA330035Su-GsBET11a进行测序验证，结果表明：***表达载体的GsBET11a基因序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第1-381位核苷酸所示，表明载体正确。GsBET11a基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3、采用冻融法，将pCAMBIA330035Su-GsBET11a载体转化根癌农杆菌GV3101，经PCR鉴定获得重组农杆菌。
二、GsBET11a转基因拟南芥的获得及鉴定
1、将上述重组农杆菌通过Floral-dip法侵染野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)，收取T0代种子。
2、将T0代种子表面消毒后，播种于含25mg/L固杀草(Glufosinate ammonium)的1/2MS培养基上进行筛选。
3、待种子萌发后，将绿色的T0代抗性苗移栽至营养钵中培养，并收集种子进行T1代筛选。
4、将T1代抗性苗移栽至营养钵中培养，采用EasyPure Plant Genomic DNA Kit(全式金，货号EE111-12)提取抗性植株基因组DNA进行PCR鉴定。
5、采用RNaprep pure Plant Kit(天根，货号DP441)试剂盒提取抗性植株总RNA并反转录成cDNA，采用GsBET11a基因特异引物，以拟南芥ACTIN2基因为内参，以野生型拟南芥为对照，通过半定量RT-PCR分析GsBET11a基因在转基因植株中的表达量。引物序列如下：
5’-ATGAATGCTAGAAGAGATGGTCG-3’；
5’-TTACCTAGTCAGATAGTATATTATAAGAAAAAG-3’。
6、将RT-PCR阳性的T1代转基因拟南芥单株收种子，并分别播种于含25mg/L固杀草的1/2MS培养基上进行筛选，观察T2代分离情况。如此重复，直至得到T3代转基因拟南芥纯合体株系。
三、GsBET11a转基因拟南芥耐盐性分析
1、为了比较GsBET11a转基因拟南芥与野生型拟南芥在盐胁迫下的种子萌发情况。选取饱满的野生型和转基因拟南芥纯合体种子，用5％NaClO处理6-8min，灭菌ddH2O冲洗5-7次，4℃春化3d，播种于正常、含有125mM NaCl的1/2MS培养基，22℃培养8d，观察拟南芥种子萌发及幼苗生长状态。各株系采用90个种子，实验重复三次。
结果表明：盐胁迫严重抑制了野生型与转基因拟南芥种子的萌发和幼苗的生长(图6A)，但GsBET11a转基因株系的种子萌发率、幼苗展叶率和鲜重显著高于野生型(图6B-D)。
2、为了比较GsBET11a转基因拟南芥与野生型拟南芥幼苗在盐胁迫下的长势，统计初生根长度。将在正常1/2MS培养基上生长7d的、长势一致的野生型和转基因拟南芥幼苗，转移至新鲜的正常、或含150mM NaCl的1/2MS培养基，垂直培养10-12d，观察幼苗长势并统计初生根长度。各株系采用15棵植株，实验重复三次。
结果表明：在正常1/2MS培养基上，转基因拟南芥和野生型拟南芥幼苗长势一致，但在含150mM NaCl的1/2MS培养基上，转基因拟南芥的初生根明显长于野生型(图7A-B)。
3、为了比较GsBET11a转基因拟南芥与野生型拟南芥植株在盐胁迫下的长势，统计存活率、电导率等情况。选取饱满的野生型和转基因拟南芥纯合体种子，春化后播种于营养钵中(营养土：君子兰土：蛭石的比例为1：1：1)，置于人工气候培养箱中培养。选取长势一致的4周龄拟南芥植株，每3d浇灌1次200mM NaCl溶液进行盐胁迫处理，观察胁迫处理后植株长势，测定叶绿素含量和MDA(丙二醛)含量。每钵中种植6-8棵植株，各株系采用9钵，实验重复三次。
结果表明：盐胁迫处理后，转基因拟南芥的长势优于野生型(图7C)，叶绿素含量显著高于野生型(图7D)，而MDA含量则低于野生型(图7E)，进而说明了GsBET11a基因超量表达显著提高了植物的盐胁迫耐性。
Claims (5)
1.如下1）或2）所述蛋白质或生物材料在提高植物抗逆性中的应用；
1）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1）至B5）中的任一种：
B1）编码1）所述蛋白质的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组质粒、或含有B2）所述表达盒的重组质粒；
B5）含有B1）所述核酸分子的重组菌、或含有B2）所述表达盒的重组菌、或含有B3）所述重组载体的重组菌；
所述抗逆性为抗盐胁迫；
所述植物为双子叶植物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
3.权利要求1中所述蛋白质在与GsCBRLK蛋白相互作用中的应用。
4.一种构建转基因植物的方法，包括如下步骤：使权利要求1中所述蛋白质在出发植物中过表达，进而使植物的抗逆性提高；所述使权利要求1所述蛋白质在出发植物中过表达的方法为：向出发植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；转基因植物与出发植物相比，抗逆性提高；
所述蛋白质的编码基因序列如序列表中序列1所示；
所述抗逆性为抗盐胁迫；
所述出发植物为双子叶植物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410604973.6A CN104356214B (zh) | 2014-10-31 | 2014-10-31 | 一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsBET11a与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410604973.6A CN104356214B (zh) | 2014-10-31 | 2014-10-31 | 一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsBET11a与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104356214A CN104356214A (zh) | 2015-02-18 |
| CN104356214B true CN104356214B (zh) | 2017-05-10 |
Family
ID=52523544
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410604973.6A Expired - Fee Related CN104356214B (zh) | 2014-10-31 | 2014-10-31 | 一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsBET11a与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104356214B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101466259A (zh) * | 2005-05-10 | 2009-06-24 | 孟山都技术有限公司 | 用于植物改良的基因及其用途 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6737469B2 (en) * | 2001-09-27 | 2004-05-18 | Basf Ag | Method of adding water insoluble organic chemicals to styrene-butadiene rubber latex dispersions and resulting styrene-butadiene rubber latex dispersions |
| CN1179974C (zh) * | 2002-02-11 | 2004-12-15 | 中国科学院遗传研究所 | 植物耐逆相关的信号传递基因及其编码的蛋白质 |
| FR2883568B1 (fr) * | 2005-03-24 | 2007-05-18 | Michelin Soc Tech | Composition de caoutchouc comportant un itaconimidomaleimide |
| CN103509093B (zh) * | 2012-06-25 | 2015-05-27 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 植物耐逆性相关蛋白GmNF-YC14及其编码基因与应用 |
| CN103570813B (zh) * | 2012-07-26 | 2016-05-18 | 中国农业科学院棉花研究所 | 与植物抗逆性相关蛋白Gh01399及其编码基因与应用 |
-
2014
- 2014-10-31 CN CN201410604973.6A patent/CN104356214B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101466259A (zh) * | 2005-05-10 | 2009-06-24 | 孟山都技术有限公司 | 用于植物改良的基因及其用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104356214A (zh) | 2015-02-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101503467B (zh) | 植物耐逆性相关转录因子GmNAC20及其编码基因与应用 | |
| CN103695438B (zh) | 拟南芥MYB家族转录因子AtMYB17基因、编码序列及其应用 | |
| US20230313179A1 (en) | Methods for improving traits in plants | |
| CN104004077B (zh) | 一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsMSRB2与应用 | |
| CN108486149A (zh) | 一种黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用 | |
| CN117402908A (zh) | Gl6.1基因在调控水稻粒型中的应用 | |
| CN102220330A (zh) | 一种与植物抗旱性相关的miRNA——gma-miR156b及其应用 | |
| CN104945492B (zh) | 植物耐逆性相关蛋白TaAREB3及其编码基因与应用 | |
| CN106011152A (zh) | 一种提高水稻耐盐性的转录因子tfsalt1及其应用 | |
| CN106892973A (zh) | 植物抗逆性相关蛋白GhMYB4及编码基因与应用 | |
| CN109867715A (zh) | 一种叶绿体蛋白和ATPase酶活性突变体在提高植物抗逆性中的应用 | |
| CN104356214B (zh) | 一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsBET11a与应用 | |
| CN104829698B (zh) | 一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsCHX19与应用 | |
| CN106397559B (zh) | 一种与植物碳酸盐胁迫耐性相关蛋白GsHA16及其编码基因与应用 | |
| CN113564176B (zh) | 小麦TaHAL3-7A基因及其在调控作物抗旱性中的应用 | |
| CN108841837A (zh) | 拟南芥剪接因子SR45a剪接体的编码基因在负调控植物盐胁迫应答中的应用 | |
| CN114736280A (zh) | ZmROA1蛋白在调控植物耐密性中的应用 | |
| CN103468711B (zh) | 一种水黄皮耐逆相关基因MpZFP及其编码的蛋白与应用 | |
| CN103524606B (zh) | 拟南芥erip2蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN101993479B (zh) | 植物耐逆性相关转录因子TaWRKY1及其编码基因与应用 | |
| CN101402962A (zh) | 紫花苜蓿解旋酶基因及其克隆与应用 | |
| CN105567856B (zh) | 一种甘蓝型油菜的fad2基因的基因型测定方法 | |
| CN103709239A (zh) | 一种大豆核因子蛋白GmNFYB及其编码基因与应用 | |
| CN106811448B (zh) | 棉花酪氨酸蛋白磷酸酶GhPTP1及其编码基因和应用 | |
| CN115232822B (zh) | 野生大豆肌醇转运蛋白基因GsINT1的鉴定及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170510 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |