CN104356210A - 与凡纳滨对虾Rab7具有结合活性的VP28蛋白片段的高效表达与应用 - Google Patents

与凡纳滨对虾Rab7具有结合活性的VP28蛋白片段的高效表达与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及与凡纳滨对虾蛋白分子Rab7结合的对虾白斑综合征病毒VP28羧基端84个氨基酸，对虾白斑综合征病毒VP28羧基端84个氨基酸的高效表达及在抗WSSV感染中的应用。本发明利用全基因合成技术,在不改变氨基酸序列的情况下,将编码VP28羧基端(VP28C)氨基酸的密码子改为大肠杆菌偏性密码子,将其构建入原核表达载体pBAD/gIIIA中，组成高效表达重组质粒pBAD/gIIIA-VP28C,然后转化大肠杆菌，经***糖诱导，VP28C表达量占菌体总蛋白的40％以上,大大高于文献报道的表达水平,为大规模生产VP28C用于对虾白斑综合征病毒防治,减低生产成本提供基础。本发明还涉及VP28C在防治对虾白斑病中的应用。

Description

与凡纳滨对虾Rab7具有结合活性的VP28蛋白片段的高效表达与应用
技术领域
本发明属于基因生物工程技术领域，具体涉及一种与凡纳滨对虾Rab7具有结合活性的VP28蛋白片段，该蛋白片段的高效表达方法以及该VP28蛋白片段在防治对虾白斑病中的应用。
背景技术
对虾白斑杆状病毒(WSSV)是近年来危害我国及亚洲太平洋地区人工养殖对虾的主要病毒原之一，它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾，此外还可侵染淡水及海洋生态***中多种蟹类、龙虾类、端足类、水蝇类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围，给水产养殖业造成严重的经济损失。因此针对对虾白斑综合征病毒的药物开发受到广泛关注。
对虾为无脊椎动物，不具备特异性免疫***，但近年的研究表明，对虾存在类免疫(quasi-immune)应答机制，WSSV的重组蛋白可以诱导对虾产生抗病保护效应(Johnson,K.N.,van Hulten,M.C.,Barnes,A.C.,2008.“Vaccination”of shrimp against viral pathogens:phenomenology andunderlying mechanisms.Vaccine 26,4885–4892.；Litman,G.W.,Dishaw,L.J.,Cannon,J.P.,Haire,R.N.,Rast,J.P.,2007.Alternative adaptive immunity ininvertebrate.Current Opinion in Immunology 19,526–534)。目前有关对虾白斑综合症病毒亚单位疫苗的研究大多围绕诱导产生高效免疫应答能力的囊膜蛋白进行免疫接种方式来展开。VP28是WSSV的一个重要的囊膜蛋白，WSSV的致病性与其密切相关(van Hulten，M.C.，Wstenberg，M.，andGoodall，S.D.2002.Identification of two major virion protein genes of whitespot syndrome virus of shrimp.Virology，266(2)：227-236)。VP28参与WSSV的黏附与入侵过程(Yi,G.,et al.VP28of white spot syndrome virus isinvolved in the attachment and penetration into shrimp cells[J].J.Biochem.Mol.Biol,2004,37:726-734；陈文博,谭珍一,刘庆慧,侯林,黄倢.对虾白斑综合症病毒VP28基因的表达及其与血细胞的结合.渔业科学进展.2009(4):44-49),进一步研究表明，VP28与对虾分子Rab7有互作(Sritunyalucksana,K.,et al.PmRab7Is a VP28-Binding Protein Involved inWhite Spot Syndrome Virus Infection in Shrimp.Journal of Virology.2006.10734-10742)，但Rab7与VP28作用的关键区段并不清楚。Witteveldt等在原核***中将VP28蛋白表达，并利用该蛋白对对虾进行免疫，取得了较好的免疫效果(Witteveldt J,Cifuentes C C,Vlak J M,et a1.Protection ofPenaeus monodon against white spot syndrome virus by oralvaccination.Journal of Virology,2004,78(4):2057-2061)。进一步的试验表明在通过肌肉注射或者给对虾投喂混有VP28的饲料后,对虾感染WSSV后的存活率明显上升(Jha R.K.,Xu Z.R.,Bai S.J.,Sun J.Y.,Li W.F.,Shen J.2007.Protection of Procambarus clarkii against white spot syndrome virus usingrecombinant oral vaccine expressed in Pichia pastoris.Fish&shellfishimmunology,22:295-307；Satoh J.,Nishizawa T.Yoshimizu M.2008.Protectionagainst white spot syndrome virus(WSSV)infection in kuruma shrimp orallyvaccinated with WSSV rVP26and rVP28.Diseases of AquaticOrganisms,82:89-96；Caipang C.M.A.,Verjan N.,Ooi E.L.,Kondo H.,HironoI.,Aoki T.,Kiyono H.,Yuki Y.Enhanced survival of shrimp,Penaeus(Marsupenaeus)japonicus from white spot syndrome disease after oraladministration of recombinant VP28expressed in Brevibacillus brevis.Fish&Shellfish Immunology.2008,25,315-320)。但目前采用原核表达技术重组表达VP28时，目的蛋白VP28仅占包含体总蛋白的10％以下(陈文博,谭珍一,刘庆慧,侯林,黄倢.对虾白斑综合征病毒vp28基因的表达及其与血细胞的结合.渔业科学进展.2009,30(4):44-49)，由于目标蛋白的表达量低，生产成本高,限制了VP28在防治对虾白斑综合征病毒病中的应用。本发明生产的基因工程蛋白优点在于,重组蛋白表达量高,使生产成本大大降低，且VP28C对凡纳滨对虾抗WSSV感染保护效果好。
发明内容
本发明的目的是提供一种配体多肽，是与凡纳滨对虾蛋白分子Rab7结合的对虾白斑综合征病毒VP28多肽，其特征是含VP28羧基端84个氨基酸,命名为VP28C。
本发明的再一目的是提供一种对虾白斑综合征病毒VP28羧基端84个氨基酸的高效表达方法，即在不改变氨基酸序列的情况下，将编码VP28的基因密码子改为大肠杆菌偏性密码子，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种与凡纳滨对虾蛋白分子Rab7具有结合作用的,编码对虾白斑综合征病毒VP28羧基端84个氨基酸的核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:1；
本发明还提供一种提高对虾白斑综合征病毒VP28羧基端84个氨基酸表达量的核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:2；
本发明还提供一种重组表达质粒，是将上述的核苷酸片段***到原核表达载体中构建的；
所述的原核表达载体优选为pBAD/gIIIA；
本发明还提供一种重组表达菌株，为携带有上述原核表达载体的大肠杆菌。
本发明还提供一种表达对虾白斑综合征病毒VP28羧基端84个氨基酸的方法，是用上述的重组表达菌株进行发酵来生产对虾白斑综合征病毒VP28蛋白。
本发明的另一个目的是提供重组蛋白VP28羧基端84个氨基酸在对虾抗WSSV感染中的应用技术。本发明生产的VP28羧基端84个氨基酸可通过注射、浸泡、口服等方式给药，较佳通过对甲壳类口服或浸泡给药。
本发明人工合成对于核苷酸序列为SEQ ID NO:1的对虾白斑综合征病毒VP28蛋白的密码子进行优化的序列SEQ ID No:2,将其分别***原核表达载体pBAD/gIIIA多克隆位点中，构建成高效重组表达质粒pBAD/gIIIA-VP28C，然后转化大肠杆菌Top10，获得阳性重组体。该重组体经培养及L-***糖诱导表达，VP28C的表达量占菌体蛋白总量的40％以上，明显高于相关文献报道的重组VP28蛋白表达的水平，为大规模发酵生产降低生产成本提供可能。将表达的重组Rab7蛋白进行SDS-PAGE电泳并转引印于PVDF膜上，与标记的VP28C作用，可见明显的结合活性，采用重组蛋白VP28C可提高凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒感染。
附图说明
图1：vp28C的琼脂糖凝胶电泳图；
其中：Lane M：DL2,000DNA Marker；Lane 1,2:PCR产物；
图2：重组质粒的双酶切核酸电泳图，
其中：Lane M：λ-Hind III digest；Lane 1:重组质粒双酶切.
图3：SDS-PAGE和Western-bloting分析重组VP28C；
其中：Lane 1,蛋白分子质量标准；Lane 2,重组表达的VP28C；Lane 3,重组表达的VP28C经SDS-PAGE分离后，转印于PVDF膜上与anti-His抗体作用显色带。
图4：SDS-PAGE分析重组VP28；
其中：Lane 1,蛋白分子质量标准；Lane 2,未诱导重组菌VP28；Lane 2,3，L-***糖诱导重组VP28；
图5:Rab7蛋白与VP28C结合；
其中：Lane 1:VP28C与Rab7结合带(箭头示Rab7蛋白)；Lane 2:空载体对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，分子克隆：实验室手册New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1重组体的构建:
对于核苷酸序列为SEQ ID NO:1的对虾白斑综合征病毒VP28蛋白(氨基酸序列为SEQ ID NO:3)的密码子进行如下突变，编码精氨酸的密码子变为CGT，编码苏氨酸的密码子变为ACC，编码苯丙氨酸的密码子变为TTT,编码赖氨酸的密码子变为AAA，编码缬氨酸的密码子变为GTT,编码天冬酰胺的密码子变为AAT，编码丝氨酸的密码子变为AGC，编码赖氨酸的密码子变为AAA，编码异亮氨酸的密码子变为ATT，编码脯氨酸的密码子变为CCG，编码丙氨酸的密码子变为GCA,编码谷氨酸的密码子变为CAA,编码甘氨酸的密码子变为GGT,编码亮氨酸的密码子变为CTG,编码天冬氨酸的密码子变为GAT，编码酪氨酸的密码子变为TAT，编码组氨酸的密码子变为CAT，改造后的核苷酸的序列为SEQ ID No：2。
为了便于与载体进行连接，在序列的两端加上酶切位点NcoI和XbaI。将合成好的基因片段vp28C用NcoI与XbaI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳及胶回收纯化后的酶切片段连接至经NcoI与XbaI酶切处理过的pBAD/gIIIA载体上。酶切、连接所用试剂均为Fermentas公司产品。酶切反应体系如表1所示。
表1：双酶切体系组成
双酶切产物经琼脂糖凝胶回收纯化后，用T4DNA快速连接酶连接酶切的载体和片段，连接体系如表2所示。载体与片段经连接成为重组载体pBAD/gIIIA-vp28C，并转化至大肠杆菌Top10感受态细胞中。经菌落PCR验证重组体完整性后，进行诱导表达蛋白。
表2：连接体系的组分组成
实施例2重组VP28C片段的表达
测序正确的工程菌株经LB液体培养基(Amp+,50μg/ml)过夜活化后，按1：100接种于10mL新鲜的LB培养基(含氨苄青霉素50μg/mL)中，37℃振荡培养至对数生长期(OD600＝0.5～0.6)，加L-***糖至终浓度至0.02％，诱导表达4h。将诱导后的产物用离心机离心，收集菌体，加入1mL裂解液对菌体进行反复冻融破碎(冰上孵育30min，-80℃至42℃反复冻融三次，37℃30min)。对破碎后的菌体10000g,离心1min，分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测分析。采用gel-analysis软件分析目的蛋白占总蛋白的表达量的40％，结果见图3。未经密码子优化表达的VP28占总蛋白的表达量低于15％(见图4)(陈文博,谭珍一,刘庆慧,侯林,黄倢.对虾白斑综合症病毒VP28基因的表达及其与血细胞的结合.渔业科学进展.2009(4):44-49)。
实施例3重组VP28C片段的纯化
诱导1L的重组菌液，在4℃条件下,10000r/min离心5min，收集所有沉淀，加入100mL的裂解Buffer吹打重悬，经过高压均质机破碎后10000r/mim离心10min收集包涵体，加入10mL洗涤Buffer吹打重悬后在4℃条件下,10000r/min离心5min，重复上述洗涤过程三次。向剩余的包涵体中加入20mL 6M的盐酸胍溶解，在4℃条件下震荡过夜。次日4℃,10000r/mim离心20min留上清，对其抽滤。蛋白质的纯化是用Co2+蛋白亲和层析方法，将Co2+蛋白亲和层析树脂装入层析柱中，PBS用0.45μm的滤膜过滤后加入层析柱中，约为5～7个柱体积，用以平衡柱子。向柱中加入处理好的蛋白样品，用PBS洗3-5个柱体积，然后分别以含50mM咪唑PBS洗脱结合的蛋白，收集蛋白组分，进行SDS-PAGE分析。
实施例4：Rab7基因的重组与表达及与VP28C的结合
参照GenBank上的Rab7基因序列(FJ811529.1)，表达Rab7全长蛋白。根据已知序列设计引物，添加5’端XhoI酶切位点与3’端HindIII酶切位点。使用引物如下：
上游引物5’-AGA CTCGAG ATGGCATCTCGCAAGA-3’；
下游引物5’-TCT AAGCTT TCGCAAGAGCATGCATC-3’，
以凡纳滨对虾cDNA为模板(凡纳滨对虾cDNA获得同第五章1.2.7所述)，用两步PCR法扩增目的片段。PCR反应如下：25μl体系，94℃5min变性后第一步8个循环，94℃40s，54.7℃40s，72℃1min；第二步30个循环，94℃40s，56.6℃40s，72℃1min。扩增完毕得到目的基因后，连接至pBAD/gIIIA并转入E.coli Top10感受态细胞中。将测序正确的克隆扩大培养并诱导表达。重组体Top10-pBAD/gIIIA-Rab7经0.02％L-***糖，37℃诱导表达4h后，SDS-PAGE电泳检测诱导情况，Western-blot检验其正确性。
将表达的重组Rab7蛋白进行SDS-PAGE电泳并转引印于PVDF膜上，以地高辛标记的DIG-VP28C作为一抗与PVDF膜室温孵育2h，经PBS-T溶液洗涤三次，Anti-DIG-AP作为二抗1:3000稀释，碱性磷酸酶显色液(BCIP/NBT)显色，结果表明Rab7与VP28C有结合作用(见图5)。
实施例5：使用VP28C蛋白片段对WSSV感染的抑制
动物活体实验分析:VP28C在甲壳动物抗WSSV感染抑制的作用：将表达的VP28C多肽片段以2-5％(W/W)的比例均匀加入普通饵料中制成药饵,挑选体重2-5g的健康凡纳缤对虾，随机分为3个处理组，(a.VP28C组，b.阳性对照组，c.阴性对照组)，各实验组分别投喂各种饲料，连续喂7天，然后分别投喂(除阴性对照组外)WSSV感染致死的剪碎螯虾,记录各组死亡率，计算相对保护率。
(1)药饵制作：将表达的VP28C多肽片段以2-5％(W/W)的比例均匀加入普通饵料中制成药饵，晾干后封存，备用。
(2)实验动物分组：a.VP28C组，b.阳性对照组，投喂普通饵料；c.阴性对照组，投喂普通饵料。挑选体重2-5g的健康凡纳滨对虾，随机分为3个处理组，每个实验组3个重复，每组20尾,实验前暂养7天。
(3)动物实验：各实验组分别投喂各种饲料，连续喂7天，然后分别投喂(除阴性对照组外)WSSV感染致死的剪碎螯虾,记录各组死亡率。
表3：WSSV攻毒后对虾各免疫处理组的相对保护率
结果表明，在22-26℃条件下的养殖结果显示，VP28C蛋白组相对保护率为47.5％，阴性对照组对虾无任何死亡现象。

Claims (8)

1.一种配体多肽，其特征在于，所述的配体多肽为对虾白斑综合征病毒VP28蛋白的片段，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。 
2.编码权利要求1所述的配体多肽的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:1。 
3.如权利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:2。 
4.一种重组表达质粒，其特征在于，所述的重组表达质粒是将权利要求3所述的核苷酸片段***到原核表达载体中构建的。 
5.如权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于，所述的原核表达载体为pBAD/gIIIA。 
6.一种重组表达菌株，其特征在于，所述的重组表达菌株为携带有权利要求4所述的重组表达质粒的大肠杆菌。 
7.一种表达权利要求1所述的配体多肽的方法，其特征在于，所述的方法是用权利要求6所述的的重组表达菌株进行发酵生产的。 
8.权利要求1所述的配体多肽在制备对虾抗WSSV感染制品中的应用。 
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