CN104353087A - 一种具有乳糖酸靶向功能的基于聚乙烯亚胺的ct/mr双模态成像纳米造影剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有乳糖酸靶向功能的基于聚乙烯亚胺的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，包括：(1)制备LA-PEG-COOH；(2)用DOTA-NHS和LA-PEG-COOH修饰聚乙烯亚胺，得到DOTA和乳糖酸修饰的聚乙二醇化聚乙烯亚胺；(3)在步骤(2)得到的功能化聚乙烯亚胺溶液中加入氯金酸溶液、NaBH4溶液、Gd(NO3)3·6H2O；再加入三乙胺、乙酸酐，反应结束后透析、冷冻干燥即可。本发明的制备方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景；本发明的CT/MR双模态成像纳米造影剂具有较好的水溶性、稳定性。
Description
技术领域
本发明属于CT/MR双模态成像纳米造影剂领域，特别涉及一种具有乳糖酸靶向功能的基于聚乙烯亚胺的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法。
背景技术
癌症，特别是肝癌，已经成为危害全世界人类健康的主要杀手之一。研究表明肝癌的治愈性和检测的早期性密切相关，检测出的越早，则治愈率越高，因此肝癌的早期诊断是攻克癌症治疗的关键。临床上，CT成像和MR成像具有较高的空间分辨率，因此得到了广泛的应用，并成为常用的诊断手段。但是单一CT成像或MR成像获取的信息有限，因而需要CT成像和MR成像获得的检测结果进行相互补充、相互验证，以得到更加准确的诊断信息。因此开发CT/MR双模态成像诊断剂可以有助于CT/MR双模态成像的应用，以切实地提高诊断效率、获取更多信息，并降低造影剂对病人的副作用。
纳米科技的发展使得多功能的造影剂的设计合成得以实现，作为优良的载体材料，纳米材料不仅可以实现多模态成像元素的复合，还可以通过功能化修饰实现造影剂长效循环和靶向运输，更好地应用于疾病诊断。目前用于CT/MR双模态成像的造影剂已有报道，例如Alric等人通过巯基集团将钆离子修饰在金纳米颗粒表面制备的纳米颗粒(J.Am.Chem.Soc.2008130，5908-5915)，所合成的AuDTDTPA-Gd纳米颗粒可以应用于活体CT/MR双模态成像。Chou等人合成FePt合金(J.Am.Chem.Soc.2010，132，13270-13278)也可以用于CT/MR成像。然而这些纳米颗粒合成复杂，且在生物体内的循环周期比较短，很难靶向定位在肿瘤部位。本课题组前期用简单的方法经合成了聚乙二醇修饰的螯合有钆离子的树状大分子包裹的金纳米颗粒(CN102294038A，2011年12月28日公开)，并且将其应用于CT/MR双模态纳米造影剂，但是这种树状大分子价格昂贵，因此限制了它的广泛应用。在此基础上，本课题组制备了基于聚乙烯亚胺的多功能纳米材料用于CT成像(中国发明专利，申请号：201310193203.2，申请日期：2013-05-23)，也取得了很好的造影成像效果。但是在肿瘤检测方面只能通过实体瘤的高通透性和滞留效应被动靶向肿瘤，无法很好的实现对癌症的早期检测。
检索国内外有关CT/MR双模态造影剂方面的文献和专利结果表明：目前还未见使用乳糖酸修饰包裹有金纳米颗粒的聚乙烯亚胺用于靶向的CT/MR双模态成像纳米造影剂的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有乳糖酸靶向功能的基于聚乙烯亚胺的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，具有产业化实施，且制备的金纳米颗粒不仅具有很好的稳定性和细胞相容性，还可以应用于CT/MR双模态成像来靶向诊断肿瘤。
本发明的一种具有乳糖酸靶向功能的基于聚乙烯亚胺的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，包括：
(1)在乳糖酸LA的水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC活化0.5-3h，然后边搅拌边滴加NH2-PEG-COOH的水溶液，反应1～2天后，将反应产物透析，最后冷冻干燥得到乳糖酸修饰的聚乙二醇LA-PEG-COOH，其中，EDC与LA的摩尔比为2∶1，乳糖酸与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1.5∶1；
(2)在聚乙烯亚胺的水溶液中搅拌边滴加2，2′，2″-(10-(2-(2，5-二氧代吡咯烷-1-氧基)-2-氧乙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三)三乙酸DOTA-NHS的水溶液，反应12-24h，得到功能化的聚乙烯亚胺溶液；然后将步骤(1)得到的LA-PEG-COOH溶解于水中，并使用EDC活化后，逐滴加入到上述功能化聚乙烯亚胺溶液中，反应1～2天后透析，最后冷冻干燥得PEI.NH2-DOTA-PEG-LA；
(3)将步骤(2)所得PEI.NH2-DOTA-PEG-LA用水溶解，加入氯金酸溶液，在室温下搅拌10-30min后加入NaBH4溶液，再在室温下搅拌反应1-2h，然后加入Gd(NO3)3溶液反应12-24h；接着加入三乙胺，搅拌混合10-40min后，再加入乙酸酐，在室温下搅拌反应12-24h，最后将反应产物透析冷冻干燥即得具有乳糖酸靶向功能的基于聚乙烯亚胺的CT/MR双模态成像纳米造影剂Gd-Au PENPs-LA。
步骤(1)中所述的NH2-PEG-COOH为一端是羧基另一端是氨基的聚乙二醇，其分子量为2000。
步骤(1)中所述的EDC与乳糖酸的摩尔比为2∶1。
步骤(1)中所述的乳糖酸与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1.5∶1。
步骤(2)中所述的聚乙烯亚胺为超支化聚乙烯亚胺，分子量为25000。
步骤(2)中所述的LA-PEG-COOH、DOTA-NHS与聚乙烯亚胺的摩尔比为25∶20∶1。
步骤(3)所述的NaBH4溶液中的溶剂为体积比2∶1的H2O与CH3OH的混合液。
步骤(3)中所述的NaBH4与氯金酸的摩尔量之比为5∶1；氯金酸与聚乙烯亚胺的摩尔比为350∶1；Gd(NO3)3与聚乙烯亚胺的摩尔比为45∶1。
步骤(3)中所述的三乙胺、乙酸酐和聚乙烯亚胺的摩尔比为1320-2640∶1100-2200∶1。
步骤(1)中所述的透析为用透析膜先在PBS缓冲液中透析3-5次，然后再在蒸馏水中透析3-5次，透析膜为纤维素透析膜(MWCO＝1000)。
步骤(2)和(3)中所述的透析为用透析膜先在PBS缓冲液中透析3-5次，然后再在蒸馏水中透析3-5次；透析膜为纤维素透析膜(MWCO＝8000-14000)。
本发明的一种乳糖酸修饰的螯合有钆离子的聚乙烯亚胺包裹的金纳米颗粒用于CT/MR双模态成像。
本发明使用紫外-可见分光光度计(UV-Vis)、透射电子显微镜(TEM)、电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)、CT成像和MR成像等方法表征本发明制备的乳糖酸修饰的螯合有Gd的聚乙烯亚胺包裹的金纳米颗粒及其生物功能，具体测试结果如下：
(1)UV-Vis测试结果
合成的Gd-Au PENPs-LA在508nm左右有一个金纳米颗粒的表面等离子体共振吸收峰(参见图2)，表明稳定的乳糖酸修饰的螯合有钆离子的聚乙烯亚胺包裹的金纳米颗粒的成功合成。
(2)TEM测试结果
Gd-Au PENPs-LA的TEM图片和粒度分布直方图(参见图3)表明本方法合成的金纳米颗粒的粒径分布均匀，平均粒径约为2.4nm。且其高分辨TEM图片(见图3c)和选区电子衍射图(见图3d)表明所合成的金纳米颗粒晶化程度比较高，其中(111)、(200)、(220)和(311)环说明所合成的金纳米颗粒呈面心立方晶体结构。
(1)材料成分检测结果
以ICP-OES测定产物中Au和Gd的含量，结果表明平均每个聚乙烯亚胺的载金量为335个金原子，载钆量为44个Gd(III)离子。
(4)体外CT和MR成像性能
将合成的材料Gd-Au PENPs-LA配制成一系列的浓度，通过CT、MR成像，评估材料的X射线衰减效应和r1弛豫率(见图4)；结果发现该材料具有比对比材料Au PENPs-LA稍高的X射线衰减效应以及相对较好的CT成像效果(见图4a和4b)；同时，Gd-Au PENPs-LA的r1弛豫率为6.5mM-1s-1，也比对比材料PEI-Gd-LA(5.6mM-1s-1)具有较高的弛豫率，因此具有较好的MR成像性能(见图4c和4d)。
(5)MTT细胞活力检测
将不同金浓度的Gd-Au PENPs-LA材料与HepG2细胞共培养24h后，通过MTT毒性检测，可以看到在金纳米颗粒的浓度高达50μM时也未见较为明显的毒性，证明本方法得到的双模态成像造影剂具有很好的细胞相容性，参加图5。
(6)ICP分析HepG2细胞对材料靶向吞噬作用
将去唾液酸糖蛋白受体表达的HepG2细胞分别与Gd-Au PENPs-LA和Gd-Au PENPs(金的浓度分别为0和25μM)共培养3h后，通过ICP检测单个HepG2细胞对不同金纳米颗粒的吞噬量，结果发现HepG2细胞对靶向材料Gd-Au PENPs-LA的吞噬量要大于非靶向材料的吞噬量，从而证明了合成的材料Gd-Au PENPs-LA对HepG2细胞具有特异性靶向作用(见图6)。
(7)体外HepG2细胞的靶向CT/MR双模态成像
HepG2细胞分别与Gd-Au PENPs-LA和Gd-Au PENPs(金的浓度分别为5、10、25、50μM)共培养3h后，然后将细胞消化离心并用150μL PBS缓冲液将其悬浮在离心管中，随后分别进行CT和MR成像扫描(见图7)。实验结果发现：在MR成像中，不同金浓度下与Gd-AuPENPs-LA共培养的HepG2细胞具有较高的MR信号；相似的，在CT成像中，不同金浓度下与Gd-Au PENPs-LA共培养的HepG2细胞具有较高的CT信号。这个结果也证明了合成的材料Gd-Au PENPs-LA对HepG2细胞具有特异性靶向作用。
(8)体内HepG2移植瘤的靶向CT/MR双模态成像
将0.15mL Gd-Au PENPs-LA或Gd-Au PENPs([Au]＝0.1M)尾部静脉注射进体重为24g的荷瘤裸鼠体内，分别在注射前和注射后不同时间通过CT和MR扫描检测得到肿瘤部位的图片(图8和9)，从图中能够清楚地看到裸鼠肿瘤部位的信号增强效果，且肿瘤亮度随着时间的延长逐渐增强。而且无论是CT成像还是MR成像，注射靶向材料Gd-Au PENPs-LA的模型鼠的肿瘤亮度比注射对比材料Gd-AuPENPs的要高很多。为了进一步验证双模态靶向成像的效果，我们测量了注射前后不同时间肿瘤部位和附近肌肉组织的CT值和MR信噪比值，然后以肿瘤部位的CT或者MR信噪比值除以肌肉组织的CT或者MR信噪比值得到肿瘤部位造影对比度，即相对CT值和相对MR信噪比值。实验结果发现：在CT成像中，注射材料24小时之后，靶向材料Gd-Au PENPs-LA裸鼠肿瘤部位的CT值是注射前的2.4倍，而对照非靶向材料Gd-Au PENPs裸鼠肿瘤部位CT值仅为注射前的1.4倍(图10a)。相似的，在MR成像中，注射材料24小时之后，靶向材料Gd-Au PENPs-LA裸鼠肿瘤部位的MR信噪比值是注射前的2.1倍，而对照非靶向材料Gd-Au PENPs裸鼠肿瘤部位MR信噪比值仅为注射前的1.3倍(图10b)。这些结果证明本方法合成的Gd-Au PENPs-LA对HepG2移植瘤具有很好的靶向成像效果，可用于肝癌的靶向CT/MR双模态检测。
(9)体内组织分布
将0.15mL Gd-Au PENPs-LA([Au]＝0.1M)尾部静脉注射进体重为22-25g的荷瘤裸鼠体内，分别在注射前和注射后不同时间利用ICP-OES分析心，肝，脾，肺，肾，血液以及肿瘤组织的金含量(图11)。从图中我们可以看出，静脉注射的纳米粒子展示出一个较长的血液循环时间。在注射2h后，血液中金含量仍然高达0.24mg每克，并且注射12h后，这个值降到0.083mg每克。虽然随着时间的增加，金的量一直在降低，但是在注射48h后，血液中金的含量依然可以维持0.017mg每克。这说明PEI的聚乙二醇化作用减小了这些纳米粒子的非特异性蛋白吸附，从而展示出较长的血液循环时间。对于金在各个器官中的分布，从图中我们可以看出，金纳米颗粒主要分布在肝和脾等网状内皮组织的器官中。每克组织中的金的含量在脾、肝、肾、血液、心脏和肺中是依次降低的。同时金在肿瘤中的含量是随着时间增加的，在48小时达到最大值为0.15mg每克。而且注射材料96小时之后，大部分材料都从主要器官中清除出去，只有少数材料残留在肝和脾中，同时肿瘤组织的含量也是相对较高(0.071mg每克)。说明制备的材料不仅可以在肿瘤部位进行有效的靶向富集，还可以随着时间排除体外，有利于其生物医学应用。
本发明方法制备的乳糖酸靶向的螯合钆包裹金纳米粒子的功能化聚乙烯亚胺材料，其金纳米颗粒尺寸分布较窄，具有良好的分散性。体外具有良好的细胞相容性，体内试验也表明其良好的CT/MR双模态靶向成像性能。
以具有大量氨基官能团的超支化PEI为模板和稳定剂，制备了功能化的基于PEI的乳糖酸靶向的CT/MR双模态成像造影剂，本发明涉及了五个基本原理：
(1)充分利用PEI大量的可修饰化氨基，接枝钆螯合剂DOTA和LA-PEG-COOH，既修饰了MR造影剂钆的螯合剂DOTA，又提高了该造影剂的生物相容性和靶向性。
(2)利用PEI包裹稳定纳米金颗粒，采用强还原剂NaBH4对金属离子进行快速还原，在PEI内部产生稳定的金纳米颗粒。
(3)金纳米颗粒对X-射线有良好的衰减能力。荷瘤裸鼠活体CT测试说明乳糖酸靶向的螯合钆包裹金纳米粒子的功能化聚乙烯亚胺材料可以作为一种充满希望的CT成像靶向造影剂。
(4)钆离子可以用于MR成像造影剂。MR测试结果表明，该材料有较好的MR成像对比度。荷瘤裸鼠活体MR成像测试也表明乳糖酸靶向的螯合钆包裹金纳米粒子的功能化聚乙烯亚胺材料可以作为一种充满希望的MR成像靶向造影剂。
(5)利用PEI的大量可修饰化氨基进行不同表面修饰和官能化，实现不同的体内靶向成像特性，以利于临床检测诊断。
有益效果
(1)本发明的制备工艺简单，反应条件温和，具有产业化实施的前景；
(2)本发明设计合成的乳糖酸修饰的螯合有钆离子的聚乙烯亚胺包裹的金纳米颗粒具有较好的水溶性、稳定性、细胞相容性、较高的X-射线衰减系数和合适的弛豫率；
(3)本发明的乳糖酸修饰的螯合有钆离子的聚乙烯亚胺包裹的金纳米颗粒对去唾液酸糖蛋白受体表达的肝癌细胞具有较好的靶向性，同时可以用于CT/MR双模态成像，具有靶向诊断肿瘤部位的潜力，因此有望应用于肿瘤的靶向检测。
附图说明
图1为本发明制备Gd-Au PENPs-LA的简易合成示意图。
图2为本发明制备的Gd-Au PENPs-LA的紫外吸收光谱图。
图3为本发明制备的Gd-Au PENPs-LA的TEM图片(a)，粒径分布图(b)，高分辨TEM图片(c)和选区电子衍射(d)。
图4为本发明制备的Gd-Au PENPs-LA(2)以及对照材料Au PENPs-LA(1)，PEI-Gd-LA(3)在体外的CT(a)、MR(c)成像及X射线衰减性能(b)和r1弛豫率(d)。
图5为本发明制备的Gd-Au PENPs-LA与HepG2细胞共培养24h后的细胞活力MTT测试图。
图6为本发明制备的Gd-Au PENPs-LA和对照材料Gd-Au PENPs在金的浓度0和25μM下分别与HepG2细胞共培养3h后，通过ICP-OES分析得到的细胞对两种金纳米颗粒的吞噬量。
图7为本发明制备的Gd-Au PENPs-LA和对照材料Gd-Au PENPs在金的浓度为5、10、25、50μM时分别与HepG2细胞共培养3h后，细胞样品的CT成像(a)、CT信号值(b)、MR成像(c)和MR信噪比值(d)。
图8为尾静脉注射0.15mL本发明制备的Gd-Au PENPs-LA(a)和对照材料Gd-Au PENPs(b)([Au]＝0.1M)不同时间后，荷瘤裸鼠肿瘤部位CT成像效果图，从左至右依次为注射前，注射后1，2，4，24h；白色圈指示肿瘤的位置。
图9为尾静脉注射0.15mL本发明制备的Gd-Au PENPs-LA(a)和对照材料Gd-Au PENPs(b)([Au]＝0.1M)不同时间后，荷瘤裸鼠肿瘤部位MR成像效果图，从左至右依次为注射前，注射后1，2，4，24h；白色圈指示肿瘤的位置。
图10为尾静脉注射0.15mL本发明制备的Gd-Au PENPs-LA和对照材料Gd-Au PENPs([Au]＝0.1M)不同时间后，荷瘤裸鼠肿瘤部位的相对CT值(a)和相对MR信噪比值(b)。
图11为尾静脉注射0.15mL本发明制备的Gd-Au PENPs-LA([Au]＝0.1M)不同时间后，材料在荷瘤裸鼠体内主要器官中的分布。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)用20mL的水溶解53.7mg的乳糖酸，加入57.2mg的EDC活化2h，然后边搅拌边逐滴滴加溶于40mL水中的200.0mg聚乙二醇(NH2-PEG-COOH)，反应24h后，将反应产物用透析膜(MWCO＝1000)在磷酸盐缓冲液中透析2天，然后在用蒸馏水透析2天，最后将纯化的产物冷冻干燥得到乳糖酸修饰的聚乙二醇固体产物(LA-PEG-COOH)；
(2)用15mL的水溶解50.0mg的聚乙烯亚胺，然后边搅拌边滴加溶于5mL水的20.0mg的DOTA-NHS，反应24h，然后取(1)中所得的LA-PEG-COOH 117.7mg，溶解在5mL水中并使用EDC(112.8mg)活化过后逐滴加入聚乙烯亚胺溶液中，反应48h后反应产物用透析膜(MWCO＝8000-14000)在磷酸盐缓冲液中透析2天，然后在用蒸馏水透析2天，最后将纯化的产物冷冻干燥得固体(PEI.NH2-DOTA-PEG-LA)；
(3)将步骤(2)得到的PEI.NH2-DOTA-PEG-LA固体用水将其溶解后，再加入5.5mL氯金酸溶液(24.8mg/mL)，然后在室温下搅拌30min。随后加入3mL NaBH4溶液(75.7mg)，在室温下搅拌反应1h后，逐滴加入30.9mg Gd(NO3)3溶液，反应24h。然后再加入240.0μL三乙胺，搅拌混合30min后，向反应液中加入171.2μL乙酸酐，在室温下搅拌反应24h。随后将反应产物用透析膜(MWCO＝8000-14000)在缓冲溶液和蒸馏水中透析，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到乳糖酸、聚乙二醇修饰的螯合了钆离子的聚乙烯亚胺/金纳米粒子(Gd-AuPENPs-LA)。
合成过程中对得到的产品Gd-Au PENPs-LA进行紫外吸收表征如附图2，纳米金颗粒的表面等离子体共振(SPR)峰约在508nm，证明了金纳米颗粒的形成。同时通过TEM图片(图3)表明金纳米颗粒尺寸分布较窄，具有良好的水分散性，粒径尺寸约2.4nm。进一步以电感耦合等离子体发射光谱仪测定产物中Au和Gd的含量，结果表明平均每个聚乙烯亚胺的载金量为335个金原子，载钆量为44个Gd(III)离子，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的功能化的聚乙烯亚胺Gd-Au PENPs-LA。
实施例2
为了研究实例1材料Gd-Au PENPs-LA与对比例1材料Au PENPs-LA的X射线衰减性和CT成像效果，使用体外CT成像并通过测量计算HU值进行证明。取实例1中Gd-AuPENPs-LA溶解在PBS溶液中，配制成金纳米的浓度为0.12M，再通过一系列的稀释形成金浓度分别为0.015、0.03、0.06、0.09M的PBS溶液各200μL；同样的取对比例1中Au PENPs-LA溶解在PBS溶液中，配制成金纳米的浓度为0.12M，再通过一系列的稀释形成金浓度分别为0.015、0.03、0.06、0.09M的PBS溶液各200μL。通过CT扫描测试(附图4)，可以观察到在一系列浓度下，样品Gd-Au PENPs-LA(2)的CT成像比样品Au PENPs-LA(1)相对要亮(附图4a)，同时通过测量HU值，可以看到样品Gd-Au PENPs-LA(2)的HU值要比样品Au PENPs-LA(1)的要略高(附图4b)，这些结果证明了实例1中的样品Gd-Au PENPs-LA对X射线的衰减性能较好，具有相对比较好的CT成像效果，同时也说明了钆离子的存在增强了金纳米颗粒的CT成像效果。
实施例3
为了研究实例1Gd-Au PENPs-LA材料与对比例2材料PEI-Gd-LA的r1值和MR成像效果，使用体外MR成像并通过测量计算r1值进行证明。取实例1中Gd-Au PENPs-LA溶解在PBS溶液中，配制成钆离子的浓度为2.0mM，再通过一系列的稀释形成钆离子浓度分别为1.5、1.0、0.5、0.25mM的PBS溶液各200μL；同样取对比例2材料PEI-Gd-LA溶解在PBS溶液中，配制成钆离子的浓度为2.0mM，再通过一系列的稀释形成钆离子浓度分别为1.5、1.0、0.5、0.25mM的PBS溶液各200μL。通过MR扫描测试(附图4c)，可以观察到在一系列浓度下，样品Gd-Au PENPs-LA(2)的MR成像效果比样品PEI-Gd-LA(3)的成像效果更好(附图4d)，同时通过计算r1值，可以看到样品Gd-Au PENPs-LA的r1值为6.5mM-1s-1，高于样品PEI-Gd-LA的r1值(5.6mM-1s-1)。
实施例4
用MTT实验来研究所制备的材料的细胞毒性。收集对数期HepG2细胞，加入到96孔细胞培养板中，每孔加入200μL含细胞的DMEM培养基使细胞密度至10000/孔；然后在细胞培养箱(5％CO2，37℃)中孵育24h，至细胞单层铺满孔底，倒掉培养基并加入180μL新鲜培养基，再加入含有不同浓度的Gd-Au PENPs-LA的20μL PBS缓冲液，以验证材料本身对细胞生长的影响。在培养箱中孵育24h后，每孔加入20μL的MTT溶液，继续培养4h，使细胞与MTT充分反应。最后终止培养，小心吸去孔内培养液，在每孔加入200μL DMSO，置摇床上避光低速振荡15min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的MTT甲臜溶液吸光值。统计学分析借助于ANOVA方法实施。在所有的评估中，认为P＜0.05时，样品之间的差异具有统计学显著性。分析结果以细胞存活率来显示Gd-Au PENPs-LA对HepG2细胞的毒性作用。
MTT法检测处理后细胞的活力，参见图5。从图中可以看出，相对于PBS处理的HepG2细胞，Gd-Au PENPs-LA在金浓度高达50μM时对HepG2细胞都不产生毒性，表现出良好的细胞相容性。
实施例5
研究了LA靶向材料对HepG2细胞特异性靶向作用。将HepG2细胞种在24孔板细胞培养板中，培养24h之后分别将实施例1中制备的Gd-Au PENPs-LA和对比例3中制备的材料Gd-Au PENPs加入到孔板中与细胞共培养(每组三个平行样)。培养3h之后，倒掉培养基，用PBS洗3遍，然后胰酶消化离心后收集细胞，并通过细胞计数器计算出每组细胞的个数，最后将细胞用王水处理后，加入适量的PBS溶液至1.8mL。通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测出每个样品中金元素的浓度，最后计算出每个细胞对金的摄取量(见图6)。统计学分析借助于ANOVA方法实施，在所有的评估中，认为P＜0.05时，样品之间的差异具有统计学显著性。通过图6可以清楚的看到在金的浓度为25μM时，细胞对Gd-Au PENPs-LA的摄取量要显著高于对非靶向材料Gd-Au PENPs的摄取量，表明实例1材料Gd-Au PENPs-LA对去唾液酸糖蛋白受体表达的HepG2细胞具有特异性靶向作用。
实施例6
研究了HepG2细胞特异性靶向吞噬材料后的CT和MR成像性能。将HepG2细胞种在25cm2塑料细胞培养瓶中，每瓶种的细胞数为4×106个，培养24h之后分别将实施例1中制备的Gd-Au PENPs-LA和对比例3中制备的材料Gd-Au PENPs加入与细胞共培养。然后再培养3h之后，倒掉培养基，并用PBS洗3遍，胰酶消化离心后收集细胞，并将细胞均匀的分散在1.5mL PBS缓冲液中。进行CT扫描测试(图7a)，可以观察到在一系列浓度下，与LA靶向材料共培养后的细胞CT成像比非靶向材料处理的细胞信号要亮，通过测量CT值也可以发现(图7b)，与靶向材料共培养后的细胞的CT值要高于与非靶向材料处理的细胞CT值。类似的，MR扫描测试(图7c)结果也表明与LA靶向材料共培养后的细胞MR成像比非靶向材料处理的细胞信号要亮，通过测量MR信噪比值也可以发现(图7d)，与靶向材料共培养后的细胞的MR信噪比值要高于与非靶向材料处理的MR信噪比值。这些结果不仅说明了材料Gd-Au PENPs-LA对HepG2细胞具有特异性的靶向作用，而且可以用于该细胞的靶向CT和MR成像。
实施例7
研究了靶向材料对HepG2细胞移植瘤模型的体内靶向CT和MR成像性能。将0.15mL实施例1制备的Gd-Au PENPs-LA和对比例3制备的材料Gd-Au PENPs([Au]＝0.1M)通过尾静脉注射入荷瘤裸鼠体内，注射前和注射后1，2，4，24h对其通过CT和MR扫描检测得到裸鼠肿瘤部位的图像(附图8和9)，从图8中可以看出，与注射前的CT图片相比，注射后裸鼠的肿瘤部位的CT信号有明显的增强，而且注射靶向材料Gd-Au PENPs-LA的模型鼠的肿瘤亮度比注射对比材料Gd-AuPENPs的要高很多。为了进一步验证CT靶向成像的效果，我们测量了注射前后不同时间肿瘤部位和附近肌肉组织的CT值，然后以肿瘤部位的CT除以肌肉组织的CT值得到肿瘤部位造影对比度，即相对CT值。实验结果发现，注射材料24小时之后，靶向材料Gd-Au PENPs-LA裸鼠肿瘤部位的CT值是注射前的2.4倍，而对照非靶向材料Gd-Au PENPs裸鼠肿瘤部位CT值仅为注射前的1.4倍(图10a)，证明本方法合成的Gd-Au PENPs-LA对HepG2移植瘤具有很好的靶向CT成像效果。从图9中可以看出，与注射前的MR图片相比，注射后裸鼠的肿瘤部位的MR信号有明显的增强，而且注射靶向材料Gd-Au PENPs-LA的模型鼠的肿瘤亮度比注射对比材料Gd-Au PENPs的要高很多。为了进一步验证MR靶向成像的效果，我们测量了注射前后不同时间肿瘤部位和附近肌肉组织的MR信噪比值，然后以肿瘤部位的MR信噪比值除以肌肉组织的MR信噪比值得到肿瘤部位造影对比度，即相对MR信噪比值。实验结果发现，注射材料24小时之后，靶向材料Gd-AuPENPs-LA裸鼠肿瘤部位的MR信噪比值是注射前的2.1倍，而对照非靶向材料Gd-Au PENPs裸鼠肿瘤部位MR信噪比值仅为注射前的1.3倍(图10b)，证明本方法合成的Gd-AuPENPs-LA对HepG2移植瘤具有很好的靶向MR成像效果。因此本方法合成的Gd-AuPENPs-LA对HepG2细胞移植瘤具有特异性的靶向作用，有望用于临床CT/MR成像进行肿瘤的靶向检测。
实施例8
将0.15mL Gd-Au PENPs-LA([Au]＝0.1M)尾部静脉注射进体重为22-25g的荷瘤裸鼠体内，分别于注射后2、12、24、48、96h将小鼠处死，取出心、肝、脾、肺、肾、血液和肿瘤称重，并用王水消化过夜，然后加水定容，用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定各个器官中Au含量，计算每克组织中金的含量。另外取空白小鼠作为对照，定义为0h。为了保证数据的可靠性，每个时间点平行做3只小鼠。从图11中可以看出，静脉注射的纳米粒子展示出一个较长的血液循环时间。在注射2h后，血液中金含量仍然高达0.24mg每克，并且注射12h后，这个值降到0.083mg每克。虽然随着时间的增加，金的量一直在降低，但是在注射48h后，血液中金的含量依然可以维持0.017mg每克。这说明PEI的聚乙二醇化作用减小了这些纳米粒子的非特异性蛋白吸附，从而展示出较长的血液循环时间。对于金在各个器官中的分布，从图中可以看出，金纳米颗粒主要分布在肝和脾等网状内皮组织的器官中。每克组织中的金的含量在脾、肝、肾、血液、心脏和肺中是依次降低的。同时金在肿瘤中的含量是随着时间增加的，在48小时达到最大值为0.15mg每克。而且注射材料96小时之后，大部分材料都从主要器官中清除出去，只有少数材料残留在肝和脾中，同时肿瘤组织的含量也是相对较高(0.071mg每克)。说明制备的材料不仅可以在肿瘤部位进行有效的靶向富集，还可以随着时间排除体外，更加有利于其生物医学应用。
对比例1
(1)用20mL的水溶解53.7mg的乳糖酸，加入57.2mg的EDC活化2h，然后边搅拌边逐滴滴加溶于40mL水中的200.0mg聚乙二醇(NH2-PEG-COOH)，反应24h后，将反应产物用透析膜(MWCO＝1000)在磷酸盐缓冲液中透析2天，然后再用蒸馏水透析2天，最后将纯化的产物冷冻干燥得到乳糖酸修饰的聚乙二醇固体产物(LA-PEG-COOH)；
(2)用15mL的水溶解50.0mg的聚乙烯亚胺，然后边搅拌边滴加溶于5mL水的20.0mg的DOTA-NHS，反应24h。然后取(1)中所得的LA-PEG-COOH 117.7mg，溶解在5mL水中并使用EDC(112.8mg)活化过后，逐滴加入DOTA修饰的聚乙烯亚胺溶液，反应48h后，反应混合物用透析膜(MWCO＝8000-14000)在磷酸盐缓冲液中透析2天，然后再用蒸馏水透析2天，最后将纯化的产物冷冻干燥得PEI.NH2-DOTA-PEG-LA固体；
(3)将步骤(2)得到的PEI.NH2-DOTA-PEG-LA固体用水将其溶解后，再加入5.5mL氯金酸溶液(24.8mg/mL)，然后在室温下搅拌30min，随后加入3mL NaBH4溶液(75.7mg)，在室温下搅拌反应1h后加入240.0μL三乙胺，搅拌混合30min后，向反应液中加入171.2μL乙酸酐，在室温下搅拌反应24h。随后将反应产物用透析膜(MWCO＝8000-14000)在缓冲溶液和蒸馏水中透析，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到乳糖酸、聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺/金纳米粒子(Au PENPs-LA)。
合成过程中对得到的产品Au PENPs-LA进行电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测定产物中Au和Gd的含量，结果表明平均每个聚乙烯亚胺的载金量为330个金原子，载钆量为0个Gd(III)离子，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的不含钆的成像造影剂对比产物Au PENPs-LA。
对比例2
(1)用20mL的水溶解53.7mg的乳糖酸，加入57.2mg的EDC活化2h，然后边搅拌边逐滴滴加溶于40mL水中的200.0mg聚乙二醇(NH2-PEG-COOH)，反应24h后，将反应产物用透析膜(MWCO＝1000)在磷酸盐缓冲液中透析2天，然后在用蒸馏水透析2天，最后将纯化的产物冷冻干燥得到乳糖酸修饰的聚乙二醇固体产物(LA-PEG-COOH)；
(2)用15mL的水溶解50mg的聚乙烯亚胺，然后边搅拌边滴加溶于5mL水的20.0mg的DOTA-NHS，反应24h，然后取(1)中所得的LA-PEG-COOH 117.7mg，溶解在5mL水中并使用EDC(112.8mg)活化过后逐滴加入DOTA修饰的聚乙烯亚胺溶液，反应48h后反应产物用透析膜(MWCO＝8000-14000)在磷酸盐缓冲液中透析2天，然后再用蒸馏水透析2天，最后将纯化的产物冷冻干燥得PEI.NH2-DOTA-PEG-LA固体；
(3)将步骤(2)得到的固体用水将其溶解后，再加入30.9mg Gd(NO3)3溶液反应24h。然后再加入240.0μL三乙胺，搅拌混合30min后，向反应液中加入171.2μL乙酸酐，在室温下搅拌反应24h，随后将反应产物用透析膜在缓冲溶液和蒸馏水中透析，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到乳糖酸、聚乙二醇修饰的螯合了钆离子的聚乙烯亚胺(PEI-Gd-LA)。
合成过程中对得到的产品PEI-Gd-LA进行电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测定产物中Au和Gd的含量，结果表明平均每个聚乙烯亚胺的载金量为0个金原子，载钆量为43.4个Gd(III)离子，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的不含金的成像造影剂对照产物PEI-Gd-LA。
对比例3
(1)用15mL的水溶解50mg的聚乙烯亚胺，然后边搅拌边滴加溶于5mL水的20.0mg的DOTA-NHS，反应24h，然后取mPEG-COOH 100.0mg，溶解在5mL水中并使用EDC(95.8mg)活化过后逐滴加入聚乙烯亚胺溶液，反应48h后反应产物用透析膜(MWCO＝1000)在磷酸盐缓冲液中透析2天，然后再用蒸馏水透析2天，最后将纯化的产物冷冻干燥得固体PEI.NH2-mPEG；
(2)将步骤(1)得到的PEI.NH2-mPEG固体用水将其溶解后，再加入5.5mL氯金酸溶液(24.8mg/mL)，在室温下搅拌30min，随后加入1mL NaBH4溶液(75.66mg)，在室温下搅拌反应2h后逐滴加入30.9mg Gd(NO3)3溶液反应24h；然后再加入240.0μL三乙胺，搅拌混合30min后，向反应液中加入171.2μL乙酸酐，在室温下搅拌反应24h，随后将反应产物用透析膜(MWCO＝8000-14000)在缓冲溶液和蒸馏水中透析，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到乳糖酸、聚乙二醇修饰的螯合了钆离子的聚乙烯亚胺/金纳米粒子(Gd-Au PENPs)。
合成过程中对得到的产品Gd-Au PENPs进行紫外吸收表征，纳米金颗粒的表面等离子体共振(SPR)峰约在507nm，证明了金纳米颗粒的形成。进一步以电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测定产物中Au和Gd的含量，结果表明平均每个聚乙烯亚胺的载金量为338个金原子，载钆量为41个Gd(III)离子，这些测试结果表明已成功制备了设计合成了非靶向的螯合了钆的聚乙烯亚胺包裹的金纳米颗粒(Gd-Au PENPs)。
Claims (6)
1.一种具有乳糖酸靶向功能的基于聚乙烯亚胺的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，包括：
(1)在乳糖酸LA的水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC活化0.5-3h，然后边搅拌边滴加NH2-PEG-COOH的水溶液，反应1～2天后，将反应产物透析，最后冷冻干燥得到乳糖酸修饰的聚乙二醇LA-PEG-COOH，其中，EDC与LA的摩尔比为2∶1，乳糖酸与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1.5∶1；
(2)在聚乙烯亚胺的水溶液中搅拌边滴加2，2′，2″-(10-(2-(2，5-二氧代吡咯烷-1-氧基)-2-氧乙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三)三乙酸DOTA-NHS的水溶液，反应12-24h，得到功能化的聚乙烯亚胺溶液；然后将步骤(1)得到的LA-PEG-COOH溶解于水中，并使用EDC活化后，逐滴加入到上述功能化聚乙烯亚胺溶液中，反应1～2天后透析，最后冷冻干燥得PEI.NH2-DOTA-PEG-LA；
(3)将步骤(2)所得PEI.NH2-DOTA-PEG-LA用水溶解，加入氯金酸溶液，在室温下搅拌10-30min后加入NaBH4溶液，再在室温下搅拌反应1-2h，然后加入Gd(NO3)3溶液反应12-24h；接着加入三乙胺，搅拌混合10-40min后，再加入乙酸酐，在室温下搅拌反应12-24h，最后将反应产物透析冷冻干燥即得具有乳糖酸靶向功能的基于聚乙烯亚胺的CT/MR双模态成像纳米造影剂Gd-Au PENPs-LA。
2.根据权利要求1所述的一种具有乳糖酸靶向功能的基于聚乙烯亚胺的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的NH2-PEG-COOH为一端是羧基另一端是氨基的聚乙二醇，其分子量为2000。
3.根据权利要求1所述的一种具有乳糖酸靶向功能的基于聚乙烯亚胺的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的聚乙烯亚胺为超支化聚乙烯亚胺，分子量为25000。
4.根据权利要求1所述的一种具有乳糖酸靶向功能的基于聚乙烯亚胺的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的LA-PEG-COOH、DOTA-NHS与聚乙烯亚胺的摩尔比为25∶20∶1。
5.根据权利要求1所述的一种具有乳糖酸靶向功能的基于聚乙烯亚胺的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的NaBH4与氯金酸的摩尔比为5∶1；氯金酸与聚乙烯亚胺的摩尔比为350∶1；Gd(NO3)3与聚乙烯亚胺的摩尔比为45∶1；所述的三乙胺、乙酸酐和聚乙烯亚胺的摩尔比为1320-2640∶1100-2200∶1。
6.根据权利要求1所述的一种具有乳糖酸靶向功能的基于聚乙烯亚胺的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)、(2)和(3)中所述的透析均为用透析膜先在PBS缓冲液中透析3-5次，然后再在蒸馏水中透析3-5次；其中步骤(1)所述的透析膜为纤维素透析膜，MWCO＝1000，步骤(2)和(3)中所述的透析膜为纤维素透析膜，MWCO＝8000-14000。
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