CN104345102A - 一种测定特定聚合度范围壳寡糖含量的方法 - Google Patents

一种测定特定聚合度范围壳寡糖含量的方法 Download PDF

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邢荣娥
刘松
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Abstract

本发明属于海洋化学工程技术，具体涉及一种测定特定聚合度范围壳寡糖含量的方法。对右旋糖酐标准品进行色谱分析，绘制标准曲线，得线性回归方程；将待测的特定聚合度范围的两端值n1和n2对应的壳寡糖的分子量M1和M2带入上述线性回归方程得出待测的特定聚合度范围的两端值壳寡糖的色谱保留时间t1和t2；以测定标准样品的色谱分析条件对待测壳寡糖溶液进行分析，以待测样品色谱图获得待测样品对应的色谱峰总面积A及在待测的特定聚合度范围的两端值壳寡糖的色谱保留时间t1～t2内的色谱面积At1-t2，根据色谱面积公式获得特定聚合度范围n1～n2的壳寡糖含量。本发明采用凝胶排阻色谱以分子量为校准间接测定特定聚合度壳寡糖的含量，分析步骤少，操作简便。

Description

一种测定特定聚合度范围壳寡糖含量的方法
技术领域
本发明属于海洋化学工程技术，具体涉及一种测定特定聚合度范围壳寡糖含量的方法。
背景技术
壳寡糖，又称低聚葡萄糖胺、低聚氨基葡萄糖，是一种由D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成线性寡糖。壳寡糖是一种重要的海洋生物资源，被发现具有多种生理活性，如抗肿瘤，抗菌，抗炎，抗氧化，调节血糖血脂，增强免疫力，活化肠道菌群等。2014年5月，国家卫生委已经批准壳寡糖作为新食品原料，这对于壳寡糖行业发展具有重要意义。目前，壳寡糖主要通过壳聚糖的酸解，氧化降解，或酶解三种技术得到。这些技术制备的壳寡糖产物是一个非常复杂的混合物，其中含有各个聚合度的壳寡糖。壳寡糖的聚合度分布对于其生理活性具有重要影响。壳寡糖新食品原料规定，壳寡糖中2-10个聚合度的寡聚氨基葡萄糖含量不得低于80％。因此，如何准确测定特定聚合度范围的壳寡糖含量具有重要意义。
目前，对于寡糖聚合度分布的检测主要采用薄层层析法(TLC)，高效液相色谱法(HPLC)和质谱法。薄层层析方法不需大型仪器设备，操作简便，是实验室最初常用的检验寡糖聚合度分布的方法，一般聚合度小于6的壳寡糖能够在薄层板上实现很好的分离，但其色带分布不均，长伴有拖尾现象，且重复试验差异较大，很少用于寡糖聚合度分布的定量分析。质谱是一种非常有力的寡糖分析技术，它能直接给出寡糖中各个成分的准确分子量分布，已被广泛运用于寡糖混合物的分析，其中基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)和电喷雾电离质谱(ESI/MS)最为常见。虽然质谱信号丰度与对应组分的含量存在一定的关联，但并没有准确的定量关系，因此质谱法一般只能用于寡糖组分的定性分析，有关质谱法在寡糖各组分的定量分析目前仅有少量的文献报道，正处于研发阶段，技术手段尚未成熟。
对于低分子量壳寡糖，通常采用特定的高相液相色谱(HPLC)***能够测定出壳寡糖中具体的聚合度分布以及每一个壳寡糖单体的含量，包括氨基正相/反相色谱，离子交换色谱，亲水色谱等。然而，由于缺乏单一聚合度壳寡糖标准品进行校准，尤其对于聚合度大于6的壳寡糖单体及具有特定序列排布的N-乙酰化壳寡糖单体目前还很难获得标准品，这给方法实际应用带来困难。因此，研发一种准确测定特定聚合度范围壳寡糖含量的方法是十分必要的，这对于壳寡糖新食品原料的生产、监管及整个行业发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定特定聚合度范围壳寡糖含量的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种测定特定聚合度范围壳寡糖含量的方法，
对右旋糖酐标准品进行色谱分析，以测定的标准品的保留时间(t)与其分子量对数绘制标准曲线，得到分子量与保留时间的线性回归方程；
将待测的特定聚合度范围的两端值n1和n2对应的壳寡糖的分子量M1和M2带入上述线性回归方程得出待测的特定聚合度范围的两端值壳寡糖的色谱保留时间t1和t2；
以测定标准样品的色谱分析条件对待测壳寡糖溶液进行分析，以待测样品色谱图获得待测样品对应的色谱峰总面积A及在待测的特定聚合度范围的两端值壳寡糖的色谱保留时间t1～t2内的色谱面积At1-t2，根据色谱面积公式获得特定聚合度范围n1～n2的壳寡糖含量；
其中，色谱面积公式＝At1-t2×100％/A。
所述色谱分析采用凝胶排阻色谱。所述凝胶排阻色谱为TSKG3000-PWXL或相同性质的色谱填充柱。
所述凝胶排阻色谱分析***分析条件为：上样量为2-50μL，流动相为：0.02-0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，流速为：0.5-1.0mL/min，检测器为：示差折光检测器。
所述已知分子量的右旋糖酐标准品分子量为180,1000,2700,5250,9750,13050,36800Da或具有相同性质的右旋糖酐分子量标准系列。
本发明所具有的优点：
1.本发明从宏观角度入手，以分子量对壳寡糖样品进行表征，通过对特定聚合度壳寡糖的分子量范围进行界定，采用色谱峰面积进行定量测定，避免了单一聚合度、特定N-乙酰化壳寡糖标准品的使用，可操作性强。
2.本发明采用凝胶排阻色谱以分子量为校准间接测定特定聚合度壳寡糖的含量，分析步骤少，操作简便，是一种简便有效的测定壳寡糖聚合度分布方法。
附图说明
图1为本发明实施例提供的右旋糖酐标准品分子量与色谱保留时间的校准曲线。
图2为本发明实施例提供的待测样品中聚合度2-10壳寡糖的色谱积分范围示意图。
图3为本发明实施例提供的待测样品中聚合度3-8壳寡糖的色谱积分范围示意图。
具体实施例
下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
实施例1
测定壳寡糖样品中聚合度为2-10的寡糖含量：
称取分子量分别为180，1000,2500,5000,7100,12000的右旋糖酐标准品各4mg，溶于1ml醋酸-醋酸钠缓冲溶液(缓冲溶液中醋酸浓度为0.2mol/L，醋酸钠浓度为0.1mol/L)中，采用高效凝胶排阻色谱分别测定各右旋糖酐标准品色谱保留时间，色谱条件为：
色谱柱：TSK G3000-PWXL(250×4.6mm)
流动相：0.2M醋酸/0.1M醋酸钠缓冲液
流速：0.8mL/min。
检测器：示差检测器。
各右旋糖酐标准品的经色谱分析获得对应分子量为180，1000,2500,5000,7100,12000的右旋糖酐标准品的色谱保留时间分别为11.938，10.872，10477，10.015，9.676，9.433min。以保留时间(t)和对应右旋糖酐标准品的分子量对数(log Mp)绘制标准曲线(参见图1)，获得线性回归方程，log Mp＝-0.7254t+10.926；(R2＝0.9949)。
将全脱乙酰化壳二糖的分子量M2(340Da)和全脱乙酰化壳十糖的分子量M1(1628Da)分别带入上述回归方程，计算出壳二糖和壳十糖在凝胶排阻色谱中的理论保留值t2和t1分别为t2＝11.572min和t1＝10.635min。
以上述测定标准样品的色谱分析条件下，将待测样品注入色谱***进行分析，获得待测壳寡糖样品的凝胶排阻色谱分析谱图，采用凝胶色谱分析软件(色谱仪自带软件)分别对待测样品的色谱峰及待测样品特定聚合度理论保留时间t2(11.572min)到t1(10.635min)范围内的峰面积进行积分(参见图2)，计算出待测样品对应的色谱峰总面积A(830641)及在t1～t2时间内的色谱面积At1-t2(709456)，那么待测壳寡糖样品中聚合度2～10的壳寡糖含量为：709456×100％/830641＝85.41％。
实施例2
测定壳寡糖样品中聚合度3-8的寡糖含量
称取分子量分别为180，1000,2500,5000,7100,12000的右旋糖酐标准品各4mg溶于1ml醋酸-醋酸钠缓冲溶液(缓冲溶液中醋酸浓度为0.2mol/L，醋酸钠浓度为0.1mol/L)中，采用高效凝胶排阻色谱分别测定各右旋糖酐标准品色谱保留时间，色谱条件为：
色谱柱：TSK G3000-PWXL(250×4.6mm)
流动相：0.2M醋酸/0.1M醋酸钠缓冲液
流速：0.8mL/min。
检测器：示差检测器。
各右旋糖酐标准品的经色谱分析获得对应分子量为180，1000,2500,5000,7100,12000的右旋糖酐标准品的色谱保留时间分别为11.938，10.872，10477，10.015，9.676，9.433min。以保留时间(t)和对应右旋糖酐标准品的分子量对数(log Mp)绘制标准曲线(参见图1)，获得线性回归方程，log Mp＝-0.7254t+10.926；(R2＝0.9949)。
将全脱乙酰化壳三糖的分子量M2(501Da)和全脱乙酰化壳八糖的分子量M1(1306Da)分别带入上述回归方程，计算出壳三糖和壳八糖在凝胶排阻色谱中的理论保留值t2和t1分别为t2＝11.340min和t1＝10.767min。
以上述测定标准样品的色谱分析条件下，将待测样品注入色谱***进行分析，获得待测壳寡糖样品的凝胶排阻色谱分析谱图，采用凝胶色谱分析软件分别对待测样品的色谱峰及待测样品特定聚合度理论保留时间t2(11.340min)到t1(10.767min)范围内的峰面积进行积分(参见图3)，计算出待测样品对应的色谱峰总面积A(830641)及在t1～t2时间内的色谱面积At1-t2(563545)，那么待测壳寡糖样品中聚合度3～8的壳寡糖含量为：563545×100％/830641＝67.84％。

Claims (3)

1.一种测定特定聚合度范围壳寡糖含量的方法，其特征在于：
对右旋糖酐标准品进行色谱分析，以测定的标准品的保留时间(t)与其分子量对数绘制标准曲线，得到分子量与保留时间的线性回归方程；
将待测的特定聚合度范围的两端值n1和n2对应的壳寡糖的分子量M1和M2带入上述线性回归方程得出待测的特定聚合度范围的两端值壳寡糖的色谱保留时间t1和t2；
以测定标准样品的色谱分析条件对待测壳寡糖溶液进行分析，以待测样品色谱图获得待测样品对应的色谱峰总面积A及在待测的特定聚合度范围的两端值壳寡糖的色谱保留时间t1～t2内的色谱面积At1-t2，根据色谱面积公式获得特定聚合度范围n1～n2的壳寡糖含量；
其中，色谱面积公式＝At1-t2×100％/A。
2.按权利要求1所述的测定特定聚合度范围壳寡糖含量的方法，其特征在于：所述色谱分析采用凝胶排阻色谱。
3.按权利要求1所述的测定特定聚合度范围壳寡糖含量的方法，其特征在于：所述凝胶排阻色谱分析***分析条件为：上样量为2-50μL，流动相为：0.02-0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，流速为：0.5-1.0mL/min，检测器为：示差折光检测器。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105461761A (zh) * 2015-12-16 2016-04-06 中国科学院理化技术研究所 一种可在线检测的全脱乙酰化壳寡糖不同聚合度单体的制备方法
CN106153764A (zh) * 2016-06-17 2016-11-23 青岛科海生物有限公司 2～6个聚合度壳寡糖总含量的检测方法
CN108548875A (zh) * 2018-04-02 2018-09-18 中国药科大学 一种测定壳寡糖中壳二糖、壳三糖含量的方法
WO2020048269A1 (zh) * 2018-09-06 2020-03-12 广东药科大学 一种测定壳寡糖含量的方法
CN116297996A (zh) * 2023-05-23 2023-06-23 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种准确测定水溶液中壳聚糖含量的uplc-ms/ms方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101235404A (zh) * 2007-01-29 2008-08-06 浙江海洋学院 一种制备聚合度为4-7的壳寡糖的方法
CN101619082A (zh) * 2008-07-01 2010-01-06 中国科学院大连化学物理研究所 一种壳寡糖单体的分离纯化方法
CN103424500A (zh) * 2013-08-16 2013-12-04 浙江树人大学 离子色谱定性检测壳寡糖的方法及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101235404A (zh) * 2007-01-29 2008-08-06 浙江海洋学院 一种制备聚合度为4-7的壳寡糖的方法
CN101619082A (zh) * 2008-07-01 2010-01-06 中国科学院大连化学物理研究所 一种壳寡糖单体的分离纯化方法
CN103424500A (zh) * 2013-08-16 2013-12-04 浙江树人大学 离子色谱定性检测壳寡糖的方法及应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUE WU ET AL.: "Preparation of chitosan oligomers COS and their effect on the retrogradation of intermediate amylose rice starch", 《J FOOD SCI TECHNOL》 *
杨小雨 等: "高效液相体积排阻色谱法测定稻米支链淀粉链长的相对分子质量分布", 《中国农业科学》 *
王世欣 等: "不同来源的壳寡糖产品的质量分析", 《中国海洋药物》 *
郑必胜 等: "壳聚糖氧化降解制备壳寡糖的研究", 《现代食品科技》 *
高丽霞 等: "不同聚合度的壳寡糖单体的制备及其分析", 《中国海洋药物》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105461761A (zh) * 2015-12-16 2016-04-06 中国科学院理化技术研究所 一种可在线检测的全脱乙酰化壳寡糖不同聚合度单体的制备方法
CN105461761B (zh) * 2015-12-16 2018-09-14 中国科学院理化技术研究所 一种可在线检测的全脱乙酰化壳寡糖不同聚合度单体的制备方法
CN106153764A (zh) * 2016-06-17 2016-11-23 青岛科海生物有限公司 2～6个聚合度壳寡糖总含量的检测方法
CN108548875A (zh) * 2018-04-02 2018-09-18 中国药科大学 一种测定壳寡糖中壳二糖、壳三糖含量的方法
WO2020048269A1 (zh) * 2018-09-06 2020-03-12 广东药科大学 一种测定壳寡糖含量的方法
CN116297996A (zh) * 2023-05-23 2023-06-23 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种准确测定水溶液中壳聚糖含量的uplc-ms/ms方法
CN116297996B (zh) * 2023-05-23 2023-08-15 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种准确测定水溶液中壳聚糖含量的uplc-ms/ms方法

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