CN104342412B - 用于生产(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酮还原酶突变体，其源于开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮还原酶，能将4‑氯乙酰乙酸乙酯转化生成(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯，具有A94S，F147V，L199P，A202V中的一个或多个突变。本发明的酮还原酶突变体具有明显的高比酶活，比野生型酮还原酶提高了2‑20倍，利用该酶可生物催化将4‑氯乙酰乙酸乙酯转化生成(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯；反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产他汀类药物关键中间体(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯无副产物产生，纯化方便；此外反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保。

Description

用于生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体

技术领域

本发明涉及酮还原酶突变体及其在他汀类药物中间体生产中的应用，特别涉及一种源于开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的酮还原酶突变体及其在手性(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯生产中的应用。

背景技术

阿托伐他汀钙（商品名LIPITOR由辉瑞公司销售）、罗苏伐他汀钙（商品名CRESTOR由阿斯利康公司销售）以及匹伐他汀（商标名Lipalo由Nissan Chemical及Kowa公司在日本销售），是重要的降胆固醇他汀类药物。而手性(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯是这些重要的他汀类药物的关键的手性中间体。国内2009年该中间体的产量为400吨，预计未来几年内，国内产量将达到1000吨以上，直接经济效益在数亿元。在已知的制备这些手性中间体的诸多途径中，包括化学法和酶法，都具有很多缺点。由于化学法合成过程条件苛刻，副反应多，产品分离纯化难度大，得率低，成本高，使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。采用酶法制备及手性(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯需要使用具有立体选择性的酮还原酶，但现有的野生型酮还原酶催化活性很较低，使用10g/L粗酶粉 20小时仅可转化 1g/L的酮底物，也使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶催化活性高的酮还原酶及其制备方法。

实现本发明目的的技术方案是：开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)中天然存在的野生型酮还原酶，能将4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)转化为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)。本公开内容的发明人已发现包括在一定位置突变的酮还原酶与开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)产生的野生型酮还原酶 (SEQ ID NO：2)相比表现出增加的催化活性。“野生型酮还原酶”、“野生型KRED酶”及“野生型 KRED酮还原酶”指由源自开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮还原酶基因SEQ ID NO：1编码的，并具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酮还原酶。该酶可将4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。“野生型”指与自然中所发现的一样的材料或物质的形式。例如野生型的蛋白质或核酸序列是可以从自然界中的分离并且未经过人为修饰的，在生物体中存在的原始序列形式。“增加的催化活性”指在体外或体内试验中所测量的与野生型酮还原酶相比，表现出使底物 (例如4-氯乙酰乙酸乙酯)向产物 (例如S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯)转化率增加的酮还原酶。

本发明提供的用于生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体，其特征在于，其是源于开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮还原酶，其中，突变是在亲本酮还原酶的氨基酸序列中***、取代、或缺失1个或多个氨基酸，或者在亲本酮还原酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加或删除1个或多个氨基酸，且与使用亲本酮还原酶相比，其酮还原酶活性增强2-20倍。

进一步地，所述突变体具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：A94S， F147V，L199P，A202V。

本发明提供的酮还原酶突变体，其源于开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮还原酶，表现出使底物 (例如4-氯乙酰乙酸乙酯)向产物 (例如S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯)转化率增加的酮还原酶。所述酮还原酶突变体，与SEQ ID NO.2的野生型酮还原酶相比表现出更强的催化活性。酮还原酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。

进一步地，所述突变体包含SEQ ID NO.4的氨基酸序列。

全长突变的酮还原酶对于保持酶的催化活性并不是必需的。相应地，应考虑酮还原酶突变体的截短的类似物和有催化活性的片段。例如，在一些实施方案中，C端或N端的数个氨基酸可以被删去。任何特定的截短的类似物或片段可以利用相应的试验来评估催化活性。同样的，额外的氨基酸残基可以被添加到一个或两个末端而不影响催化活性。额外序列可以是功能性的或非功能性的。例如，额外氨基酸序列可以被用来帮助纯化，做为标记，或执行一些其它的功能。因此，本公开内容的酮还原酶突变体可以是融合蛋白的形式，其中酮还原酶突变体(或其片段 )诸如通过助溶标签 (如SUMO蛋白 )、纯化标签 (如结合金属的His标签 )和细菌定位信号 (如分泌信号 )的实例而非限制的方式被融合到其它蛋白质。

进一步地，本发明提供上述突变体的编码基因。

进一步地，本发明所提供的编码基因，其序列包含SEQ ID NO.3所述的DNA分子。其已经过序列优化以适于在大肠杆菌中表达。在一些实施方案中，多核苷酸包括被优化用于在特定类型的宿主细胞中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物的密码子的使用和偏好性是已知的，因为其是用于在这些微生物的表达特定的氨基酸的优化的密码子。

本发明提供一种重组质粒，其序列优选自SEQ ID NO.5，比pET系列及pQE系列表达载体相比其具有更严谨的表达控制。在一些实施方案中，控制序列包括启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子等。对于细菌宿主细胞，指导编码序列的转录的适合的启动子包括但不限于从噬菌体T5、噬菌体T7、噬菌体lambda、大肠杆菌lacUV5操纵子、大肠杆菌 trp操纵子、大肠杆菌 tac操纵子等。

本发明提供一种宿主细胞，优选自大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种。表达酮还原酶突变体的表达载体可以包含允许载体整合到宿主细胞基因组中或者载体在细菌中独立于基因组自主复制的元件。为整合到宿主细胞基因组中，载体可以通过重组工程使载体整合到基因组中。

本发明提供一种制备酮还原酶突变体的方法，其特征在于包括以下步骤：(a)构建表达酮还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，表达载体以及酮还原酶突变体基因；(b)培养并诱导所述基因工程菌；(c) 破碎所述基因工程菌、收集粗酶液并进行酶活检测。

所述步骤（a）为将来自开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的编码野生型酮还原酶的多核苷酸(SEQ ID NO：1) 根据菌株DH1密码子偏好性进行序列优化后，通过全基因合成的方式获得。将优化后的编码酮还原酶的多核苷酸克隆到表达载体（SEQ ID NO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达野生型酮还原酶的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌 DH1中。所用克隆方法为同源重组的方式，所用到的扩增引物为：

F：5' ATTAAAGAGGAGAAATTAACATATGACTGATCGTTTAAAAGGCAAAG 3'；

R：5' AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTATTGAGCAGTGTATCCACCATCG 3'。

用同样的方法将编码酮还原酶突变体的多核苷酸(SEQ ID NO：3)克隆到表达载体（SEQ ID NO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达酮还原酶突变体的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌 DH1中。

所述步骤（b）为挑取含有目的表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml 高压灭菌后的第一培养基中， 30℃，250rpm过夜培养；次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的第二培养基中，于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1h，加入IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养15h。

所述第一培养基为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，灭菌后添加氨苄青霉素至100mg/L。

所述第二培养基为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。

本发明具有积极的效果：（1）本发明的酮还原酶突变体具有明显的高比酶活，比野生型酮还原酶提高了2-20倍，利用该酶可将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；（2）本发明反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产他汀类药物关键中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯无副产物产生，纯化方便；（3）反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保。

具体实施方式

实施例1构建野生型及酮还原酶突变体工程菌

将来自开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的编码野生型酮还原酶的多核苷酸(SEQ ID NO：1) 根据菌株DH1密码子偏好性进行序列优化后(见Puigbò P, Guzmán E,Romeu A, Garcia-Vallvé S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codonusage of DNA sequences. Nucleic Acids Res. 2007），通过基于PCR的全基因合成方式(PCR-based gene synthesis method)进行基因合成。将优化后的编码酮还原酶的多核苷酸克隆到表达载体（SEQ ID NO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达野生型酮还原酶的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌 DH1中。所用克隆方法为同源重组的方式，所用到的扩增引物为：

F：5' ATTAAAGAGGAGAAATTAACATATGACTGATCGTTTAAAAGGCAAAG 3'；

R：5' AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTATTGAGCAGTGTATCCACCATCG 3'。

类似的，将编码酮还原酶突变体的多核苷酸(SEQ ID NO：3)克隆到表达载体（SEQID NO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达酮还原酶突变体的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌 DH1中。

实施例2 酮还原酶的制备

挑取含有目的表达载体的大肠杆菌DH1单菌落接种于10ml 高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，灭菌后添加氨苄青霉素至100mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。灭菌后添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1h。加入IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养15h。

培养结束后，将培养液于4℃，6000g下离心20min最终得到湿菌体3.6g。然后将沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体。再次用蒸馏水重悬，在超声破碎仪下破碎至澄清。破碎后于4℃，12000g下离心30min，收集上清，预冷至-70℃后用冷冻干燥机制备冻干粉。最终得到粗酶冻干粉0. 39g。

实施例3 酮还原酶活性的测定

由于NADPH在340nm处有吸收峰，而NADP在340nm处无吸收峰，故可通过检测反应过程中NADPH吸光值的变化，而计算酮还原酶的活性。酮还原酶活力测定体系为：取100ul适量浓度的酶液加入到终浓度为100mM pH7.0 三乙醇胺缓冲液，1g/L NADP，50% 异丙醇，1mM硫酸镁反应体系中进行反应。在加入酶液前，需先将反应体系充分混匀后置于25℃水浴中。将实施2中制备的酮还原酶干粉按适当的比例稀释后，取100ul 加入反应体系中，混匀后于340nm处检测每分钟的吸光度变化值。参照NADPH标准曲线计算酮还原酶的酶活。单位酶活(U)定义为每分钟生成1μmol NADP所需要的酶量。用同样方法检测野生型酮还原酶的酶活。对于相同质量的蛋白，改进后的酮还原酶突变体比野生型酮还原酶酶活提升了18倍。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京朗恩生物科技有限公司

<120> 用于生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体

<130> 2013

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 759

<212> DNA

<213> 开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)

<400> 1

atgactgatc gtttaaaagg caaagtagca attgtaactg gcggtacctt gggaattggc 60

ttggcaatcg ctgataagtt tgttgaagaa ggcgcaaagg ttgttattac cggccgtcac 120

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tttggcccag ttaccacggt tgtcaacaat gccggaattg cggtcagcaa gagtgttgaa 300

gataccacaa ctgaagaatg gcgcaagctg ctctcagtta acttggatgg tgtcttcttc 360

ggtacccgtc ttggaatcca acgtatgaag aataaaggac tcggagcatc aatcatcaat 420

atgtcatcta tcgaaggttt tgttggtgat ccaactctgg gtgcatacaa cgcttcaaaa 480

ggtgctgtca gaattatgtc taaatcagct gccttggatt gcgctttgaa ggactacgat 540

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ggggcagaag aaatgatgtc acagcggacc aagacaccaa tgggtcatat cggtgaacct 660

aacgatatcg cttggatctg tgtttacctg gcatctgacg aatctaaatt tgccactggt 720

gcagaattcg ttgtcgatgg tggatacact gctcaataa 759

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213> 开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)

<400> 2

Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala

35 40 45

Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala

50 55 60

Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala

65 70 75 80

Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Ser

85 90 95

Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser

100 105 110

Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg

115 120 125

Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile

130 135 140

Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys

145 150 155 160

Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu

165 170 175

Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys

180 185 190

Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln

195 200 205

Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala

210 215 220

Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

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<210> 3

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列

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tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 2940

atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 3000

tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 3060

actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 3120

aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 3180

ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 3240

ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 3300

cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat 3360

aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcac 3390

Claims (7)

1. 用于生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。

2.权利要求1所述的用于生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体的编码基因。

3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述基因的序列为SEQ ID NO.3。

4.含有权利要求2所述的编码基因的重组质粒。

5.含有权利要求4所述重组质粒的宿主细胞。

6.权利要求1所述的用于生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体在生产(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯中的应用。

7.一种生产(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的方法以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，在权利要求1所述突变体的催化作用下，得到(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯。