CN104338181A - 一种人角膜基质的脱细胞方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是为了解决角膜基质供体紧缺的问题，改进传统脱细胞方法的不足，提供一种人角膜基质的脱细胞方法，属于组织工程学角膜技术领域。该方法具体为：收集含有组织细胞的角膜基质置于洗涤液中，并在洗涤液中清洗2-3次，每次2-5min，再将上述角膜基质密封于氮气中保存5～7d；保存结束后，将角膜基质从氮气中取出，用洗涤液清洗2-3次，每次2-5min，再在洗涤液中，恒温震荡处理，并且每隔1-2h换洗涤液1次，即得到脱基质细胞的角膜基质。该方法脱细胞完全，对角膜基质胶原无损伤，全部流程中应用的药剂均无毒性，可最大程度保护角膜基质的生物学特性并有效地去除基质细胞。

Description

一种人角膜基质的脱细胞方法

技术领域

本发明属于组织工程学角膜技术领域，具体涉及一种人角膜基质的脱细胞方法。

背景技术

中国公民因单眼和双眼角膜病致盲的盲人约300-500万，仅次于白内障，居眼科致盲疾病的第二位。导致角膜盲的主要疾病包括各种感染性角膜病、角膜变性、严重机械外伤、眼表化学伤、重症干眼症、复杂翼状胬肉、眼类天疱疮感染等，几乎涵盖了所有角膜病种。其中大部分患者获得有用视力的唯一方法是手术治疗，而手术的主要方式是角膜全层或板层移植。我国由于受到传统观念和眼库条件的限制，角膜捐献者数量很有限，治疗成本昂贵，并且部分角膜供体由于时间和空间的限制不能得到及时充分的利用，因此远远不能满足临床需求，给患者家庭和社会带来巨大压力。

在角膜供体极为匮乏的情况下，利用细胞学和组织工程学手段获得具有正常生理结构和功能的角膜组织是使这些患者脱盲的关键技术。角膜表层组织包括角膜上皮层和部分基质层，其结构对维持眼表的生理功能和眼球的视觉功能具有十分重要的意义。角膜上皮目前已有多种重建方法并已应用于临床，取得了客观的治疗效果。而角膜基质层的材料来源和脱细胞处理方式虽有多种，但存在不少问题：(1)角膜基质材料来自于人眼或动物眼，人角膜组织相容性最好，但全层角膜来源匮乏，而来源于动物眼的角膜基质难以避免免疫反应等问题；(2)为尽量降低发生免疫反应的风险，用于角膜移植的角膜基质需提前对角膜基质上的基质细胞进行脱细胞处理。脱细胞处理方式由起初的冻融法发展至当今较为普遍应用的表面活性剂洗脱法均存在一些难以规避的问题：例如反复冻融可能导致胶原断裂，损伤角膜基质的张力；而表面活性剂均具有较大的毒性，处理后难以应用于临床，目前多停留于实验室阶段。因此，寻找人角膜基质供体的可靠来源以及安全有效的脱细胞方法是具有重大临床实际意义的问题。

关于人角膜基质供体，激光屈光手术可能是非常理想的来源。现代激光屈光手术过程中取下的角膜基质透镜，厚度在40μm-140μm左右，直径约8mm，光学特性、大小和操作性均符合角膜板层移植手术的要求，以往手术后即被作为医疗垃圾处理。据粗略统计，我国每年激光屈光手术量在50万例以上，且呈逐年增长的趋势，若充分利用角膜基质透镜治疗角膜盲患者，无疑是一盏为他们指路的明灯。

对角膜基质脱细胞方法的研究已有数十年，如前所述，既往多种脱细胞方法都因其局限性而难以在临床推广。近年来国内外角膜病领域的学者逐渐重视到这些局限性，开始探索对角膜基质胶原损伤较小、毒性较低的方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决角膜基质供体紧缺的问题，改进传统脱细胞方法的不足，提供一种人角膜基质的脱细胞方法，该方法脱细胞完全，对角膜基质胶原无损伤，全部流程中应用的药剂均无毒性，可最大程度保护角膜基质的生物学特性并有效地去除基质细胞。

为实现上述目的，本发明包括以下主要内容：

一种人角膜基质的脱细胞方法，包括如下步骤：

1、在无菌条件下，收集含有基质细胞的角膜基质置于洗涤液中，并在洗涤液中清洗2-3次，每次2-5min，再将上述角膜基质密封于氮气中，常温或4℃保存5～7d；

2、保存结束后，在无菌条件下，将角膜基质从氮气中取出，用洗涤液清洗2-3次，每次2-5min，再置于洗涤液中，在转速150～250rpm条件下，15～25℃恒温震荡处理24h-36h，并且每隔1-2h换洗涤液1次，即得到脱基质细胞的角膜基质；

其中，所述的含有基质细胞的角膜基质为眼球摘除术后的人全层角膜基质或人眼经过激光屈光手术切削除去的角膜基质瓣；

所述的洗涤液为含0.3wt％青链霉素的生理盐水或含0.3wt％青链霉素的平衡盐溶液。

本发明与现有技术相比，其优势在于：

1、本发明对角膜基质冲洗采用含0.3wt％青链霉素的生理盐水或平衡盐溶液，对人眼完全无毒性作用，且可预防感染。恒温震荡脱去细胞碎片，环境温度为15～25℃，不会损伤角膜基质胶原，全部流程中应用的药剂均无明显的毒性，可以最大程度保护角膜基质的生物学特性并有效地去除基质细胞。

2、由于氮气环境可使细胞乏氧凋亡，本发明采用气态氮在常温或4℃环境中使角膜基质上的基质细胞凋亡的方式脱细胞，易于操作，避免了反复冻融造成胶原断裂而损伤组织张力，并避免了使用表面活性剂等化学试剂脱细胞时对组织造成的毒性作用。

3、本发明中脱去细胞碎片时是在无菌生理盐水或平衡盐溶液中进行恒温震荡的方式，能保持人角膜基质内的电解质水平。

具体实施方式

恒温震荡培养箱：Labnet公司，型号211DS；

生理盐水，平衡盐溶液(林格氏液，即含乳酸钠的复方氯化钠溶液)，青链霉素均为市场购买产品；

本方法中所使用的溶液、容器和工具均为无菌或已消毒的产品。

实施例1

用消毒的显微无齿镊将激光屈光手术中除去的表面光滑、厚度40-140μm、直径8±2mm的角膜基质瓣，自手术台上放入盛有含0.3wt％青链霉素的生理盐水的1ml规格eppendorf管中，转移至二级B2型生物安全柜，在培养皿中注入含0.3wt％青链霉素的生理盐水，取出角膜基质瓣，在培养皿中清洗3次，每次3分钟；再将角膜基质瓣放入5ml离心管中，使用便携式氮气瓶将离心管中充满氮气，旋紧离心管管盖并用封管膜封管，常温保存5d；5d后取出角膜基质瓣，转移至二级B2型生物安全柜中，在培养皿中用含0.3wt％青链霉素的生理盐水清洗3次，每次3分钟；将清洗后的角膜基质瓣放入盛有含0.3wt％青链霉素的生理盐水的试剂瓶中，在25℃恒温震荡培养箱中以150rpm的转速震荡24h，每小时换液1次，即得到脱基质细胞的角膜基质瓣。

对脱细胞的角膜基质瓣进行HE及Hoechst 33342染色后显示，本方法脱基质细胞完全。

实施例2

用消毒的显微无齿镊将去除掉其他组织的全层角膜基质放入盛有含0.3wt％青链霉素的生理盐水的试管中，转移至二级B2型生物安全柜，在培养皿中注入含0.3wt％青链霉素的生理盐水，将角膜基质在培养皿中清洗3次，每次2分钟；取出角膜基质，放入5ml离心管中，使用便携式氮气瓶将离心管中充满氮气，旋紧管盖并用封管膜封管，常温保存7d；7d后取出角膜基质瓣，在培养皿中用含0.3wt％青链霉素的生理盐水清洗3次，每次2分钟；将清洗后的角膜基质放入盛有含0.3wt％青链霉素的生理盐水的试剂瓶，在20℃恒温震荡培养箱中以250rpm的转速震荡36h，每2小时换液1次，即得到脱基质细胞的角膜基质瓣。

对脱细胞的角膜基质进行HE及Hoechst 33342染色后显示，本方法脱基质细胞完全。

实施例3

用消毒的显微无齿镊将激光屈光手术中除去的表面光滑、厚度40-140μm、直径8±2mm的角膜基质瓣，自手术台上放入盛有含0.3wt％青链霉素的平衡盐溶液的1ml规格eppendorf管中，转移至二级B2型生物安全柜，在培养皿中注入含0.3wt％青链霉素的平衡盐溶液，取出角膜基质瓣，在培养皿中清洗2次，每次5分钟；再将角膜基质瓣放入5ml离心管中，使用便携式氮气瓶向离心管中充满氮气，旋紧离心管管盖并用封管膜封管，4℃保存6d；6d后取出角膜基质瓣，在培养皿中用含0.3wt％青链霉素的平衡盐溶液清洗2次，每次5分钟；将清洗后的角膜基质瓣放入盛有含0.3wt％青链霉素的平衡盐溶液的试剂瓶中，在15℃恒温震荡培养箱中以200rpm的转速震荡30h，每小时换液1次，即得到脱基质细胞的角膜基质瓣。

对脱细胞的角膜基质瓣进行HE及Hoechst 33342染色后显示，本方法脱基质细胞完全。

Claims (5)

1.一种人角膜基质的脱细胞方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在无菌条件下，收集含有基质细胞的角膜基质置于洗涤液中，并在洗涤液中清洗2-3次，每次2-5min，再将上述角膜基质密封于氮气中保存；

(2)保存结束，在无菌条件下，将角膜基质从氮气中取出，用洗涤液清洗2-3次，每次2-5min；再置于洗涤液中恒温震荡处理，即得到脱基质细胞的角膜基质。

2.根据权利要求1所述的一种人角膜基质的脱细胞方法，其特征在于，所述的含有基质细胞的角膜基质为眼球摘除术后的人全层角膜基质或人眼经过激光屈光手术切削除去的角膜基质瓣。

3.根据权利要求1所述的一种人角膜基质的脱细胞方法，其特征在于，所述的洗涤液为含0.3wt％青链霉素的生理盐水或含0.3wt％青链霉素的平衡盐溶液。

4.根据权利要求1所述的一种人角膜基质的脱细胞方法，其特征在于，步骤(1)所述的角膜基质密封于氮气中保存的条件为：在常温或4℃下保存5～7d。

5.根据权利要求1所述的一种人角膜基质的脱细胞方法，其特征在于，步骤(2)所述的恒温震荡处理方法为：在转速150～250rpm条件下，15～25℃恒温震荡24h-36h，并且每隔1-2h换洗涤液1次。