CN104334170A - Neu1唾液酸酶抑制剂在癌症治疗中的用途 - Google Patents
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Abstract
Neu1唾液酸酶抑制剂作为单一药物或与已知化学治疗剂联用用于治疗癌症的用途。优选地,Neu1唾液酸酶抑制剂是磷酸奥司他韦或2-脱氧-2,3-二脱氢-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其类似物。
Description
技术领域
本发明涉及癌症治疗领域,特别涉及奥司他韦(oseltamivir)及其类似物用于治疗癌症、特别是胰脏癌的用途。
背景技术
磷酸奥司他韦(Oseltamivir Phosphate)
磷酸奥司他韦(由Hoffman la Roche以商品名Tamiflu出售)是已知的病毒性神经氨酸酶抑制剂奥司他韦羧酸盐的前药形式,其用于治疗和预防流感和其它相似病毒。磷酸奥司他韦本身不作为抗病毒物质起作用;它是活性抗病毒剂奥司他韦羧酸盐的乙酯前药。用作抗病毒物质口服施用的磷酸奥司他韦通过羧酸酯酶在肝脏中代谢为活性抗病毒形式。奥司他韦是在正常宿主细胞表面蛋白上存在的唾液酸的竞争性抑制剂。该抗病毒剂通过阻断病毒性神经氨酸酶的活性起作用,从而防止受感染细胞释放新的病毒颗粒。
制备奥司他韦及其衍生物或类似物的方法已经在专利文献,例如Hudlicky等人的PCT公布WO 2009/137916(下文中第916号)[1]和Hudlicky等人的WO 2011/047466(下文中第466号)[2]中进行描述,其通过引用并入本文。第916号和第466号专利公布还描述了可用于制备奥司他韦及其衍生物的方法的中间体。
癌症治疗
在全世界,每年有数百万人死于癌症。美国癌症协会报道称美国二分之一的男人和三分之一的女人在他们的生命中会得癌症。目前,数百万人正带瘤生存或已经患有癌症。美国国家癌症研究所的监控流行病学与最终结果(SEER)研究估计2007年美国的癌症发病率为11714000。
肺癌、***癌、乳腺癌、结肠癌、胰脏癌和卵巢癌具有高的癌症死亡发生率,尤其是在癌症发现于疾病进程的晚期时更是如此。这些癌症以及实际上所有其它癌症可能进一步导致在很多情况下致命的转移性疾病。此外,即使对于最初幸免于原发癌的那些癌症患者来说,仍存在复发的风险。
特别地,胰脏癌患者通常表现为具有致死的且难以治疗的晚期疾病。尽管常规使用化学疗法和放射疗法,晚期胰脏癌患者的存活率也没有显著提高。化学疗法和放射疗法几乎不提供或不提供益处。这些结果提出了对新的治疗方法的迫切需要。因此,开发新的癌症治疗策略对改善临床管理和癌症患者、尤其是胰脏癌患者的预后是至关重要的。
癌症治疗领域的研究已经着眼于调节对癌细胞存活和生长至关重要的细胞通路的方法。瘤形成和癌细胞生长与扩散涉及许多受体和分子通路,包括Ras、EGFR、VEGF、胃泌激素和基质金属蛋白酶。
表皮生长因子受体(人的EGFR、ErbB-1、HER1)是细胞外蛋白配体的表皮生长因子(EGF家族)的细胞表面受体成员。EGFR是受体的ErbB家族的成员,是四个密切关联的受体酪氨酸激酶EGFR(ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)和HER4(ErbB-4)的亚家族。影响EGFR表达或活性的突变会导致癌症。
Ras(大鼠肉瘤的缩写)亚家族是涉及细胞信号转导的小GTP酶的蛋白质亚家族。Ras信号的激活使细胞生长、分化和存活。
血管内皮生长因子(VEGF)家族的所有成员通过结合到细胞表面上的受体酪氨酸激酶受体(VEGFR)来刺激细胞应答,使它们二聚化并通过自身磷酸化变成活性的。VEGF是由刺激血管形成和血管新生的细胞产生的信号蛋白质。
人类中,促胃液素是通过胃的壁细胞刺激胃酸(HCl)分泌并帮助胃运动的激素。它由胃、十二指肠、以及胰腺中的G细胞分泌。它的分泌是由胃腔内的肽刺激的。
基质金属蛋白质(MMP)是依赖锌的肽链内切酶以及adamalysin、serralysin和虾红素。MMP属于被称为甲硫氨酸锌蛋白(metzinc)超家族的较大的蛋白酶家族。它们能够降解各种细胞外基质蛋白,还能处理大量生物活性分子。还已知它们涉及细胞表面受体的***、凋亡配体(如FAS配体)的释放、以及趋化因子/细胞因子的失活[3]。
尽管充分表征了包括EGFR、VEGF、胰岛素以及癌症涉及的其它受体的许多糖基化受体的信号通路,但是控制这些受体与其配体间的相互作用的参数仍然未充分地确定。已经鉴定了通过其天然配体的糖基化受体激活的新的信号转导模式[4-7]。
Toll样受体(TLR)
已经公开了配体诱导的TOLL样受体(TLR)活化是由Neu1唾液酸酶活化控制的。研究已经表明,Neu1已经与TOLL样受体形成复合物,并且在天然配体与其各自受体的配体结合时诱导活化。另外,活化的Neu1特异性地水解连接于β-半乳糖苷的α-2,3-唾液酸残基,所述残基远离配体结合位点。这消除了受体二聚化的空间位阻,并引起随后的信号转导通路[4,6]。
已经发现,神经氨酸酶抑制剂磷酸奥司他韦特异性地抑制在巨噬细胞和树突细胞的细胞表面上的TLR配体诱导的Neu1活性,然后阻断TLR配体诱导的NFkB活化、一氧化氮(NO)生成以及促炎性细胞因子[4]。另外,相比于脂多糖(LPS)正调节,在1-2mM的浓度下,其它纯化的神经氨酸酶抑制剂,例如BCX-1827、DANA(2-脱氧-2,3-脱氢-N-乙酰神经氨酸)、扎那米韦(zanamivir,4-胍基-Neu5Ac2en)以及奥司他韦羧酸盐对活的BMC-2巨噬细胞内LPS诱导的唾液酸酶活性的抑制具有有限的作用。
其它利用重组的可溶性人类唾液酸酶的研究已经表明,即使在1mM的浓度下,奥司他韦羧酸盐也几乎不抑制四种人类唾液酸酶的活性[8],而在μM范围的扎那米韦显著抑制人类Neu2和Neu3唾液酸酶。此外,使用来自成熟树突细胞的溶解产物的Nan等人发现2mM的扎那米韦完全抑制了Neu1和Neu3唾液酸酶活性[9]。
令人关注地,已经发现磷酸奥司他韦与其它神经氨酸酶抑制剂相比在抑制与TLR配体处理的活巨噬细胞相关的唾液酸酶活性方面是最有效的,而已知该化合物在体外作为抗病毒物质是无效的,这是因为其抗病毒活性是通过其水解的代谢物奥司他韦羧酸盐来实现的[10]。
为了进一步说明磷酸奥司他韦及其水解代谢物奥司他韦羧酸盐的抑制能力,通过将唾液酸酶活性的下降对试剂浓度的对数作图来确定各化合物的半抑制浓度(IC50)。结果显示,相比于奥司他韦羧酸盐1015μM的IC50,磷酸奥司他韦具有1.175μM的IC50[4]。这些数据清楚地说明,在抑制与TLR配体处理的活BMC-2巨噬细胞相关的唾液酸酶活性方面,磷酸奥司他韦比其水解代谢物有效1000倍。
如Morimoto等人所描述的,磷酸奥司他韦可以通过P-糖蛋白转运通过细胞膜[11],其中水解活化可以由羧酸酯酶催化[10]。先前已经确定抗血小板剂氯吡格雷(clopidogrel)通过羧酸酯酶抑制多达90%的磷酸奥司他韦水解[10]。为了确定磷酸奥司他韦是否在该活细胞分析***的细胞中水解,用280μM和500μM硫酸氢氯吡格雷预处理活BMA巨噬细胞2分钟,然后在存在或不存在400μM纯磷酸奥司他韦的情况下用5μg/mL内毒素脂多糖(LPS)处理。结果表明,抗羧酸酯酶剂氯吡格雷对磷酸奥司他韦抑制LPS诱导的唾液酸酶活性的能力没有影响[4]。总之,这些结果显示,磷酸奥司他韦是与TLR配体处理的活巨噬细胞相关的唾液酸酶的有效抑制剂。
酪氨酸激酶(Trk)受体
已经研究了Neu1唾液酸酶在配体诱导的络氨酸激酶(Trk)受体活化的初始过程和后续细胞功能中作为中间体连接的作用[12]。据报道,Neu1与糖基化Trk受体在胞外域内形成复合物[12],这与先前报道的关于TLR受体的结果一致[13,14]。
已经表明Neu1是在神经营养蛋白结合至受体后调节Trk活性必需的中间体。另外,基于先前的发现,据预计,通过神经营养蛋白结合至受体活化的Neu1会导致在Trk胞外域上连接至β-半乳糖苷的α-2,3-唾液酸残基的快速移除,以生成功能性Trk受体[12]。尽管有根据其亚细胞定位进行分类的四种确定的哺乳动物唾液酸酶[15],但是归类为细胞溶质(Neu2)、质膜结合(Neu3)[16-18]以及Neu4[19-20]的唾液酸酶不涉及与神经营养蛋白处理的活Trk表达细胞和初级皮层神经元相关的唾液酸酶活性。另外,经由Gαi亚单位蛋白的膜靶向的GPCR信号转导和通过配体结合至受体的基质金属蛋白酶-9活化的增强作用涉及细胞表面上的Neu1唾液酸酶的活化过程[12]。
发现磷酸奥司他韦在抑制通过活TrkA-表达细胞的NGF处理诱导的Neu1活性方面是非常有效的(IC503.876μM)。其它神经氨酸酶抑制剂奥司他韦羧酸盐和扎那米韦对与NGF处理的活TrkA表达细胞相关的Neu1唾液酸酶活性具有有限的抑制作用。据推测,磷酸奥司他韦对Neu1唾液酸酶活性的抑制能力可能归因于具有含有β-半乳糖苷酶和组织蛋白酶A[21]以及弹性蛋白结合蛋白(EBP)[22]的分子多酶复合体的Neu1的独特取向,其中所述复合体会在Trk受体的胞外域内结合。另一个可能性可能涉及磷酸奥司他韦对Neu1唾液酸酶的直接影响,所述Neu1唾液酸酶对TLR受体的α-2,3-唾液酸残基连接的β-半乳糖苷键具有特异性。据报道,TLR受体的α-2,3-唾液酸残基的Neu1去唾液酸作用使受体二聚化[14]。数据显示,在TLR缺乏的HEK293细胞中没有观察到TLR配体诱导的NFκB应答,但是TLR配体诱导的NFκB应答在用TLR4/MD2稳定转染的HEK293细胞中重建,并且明显被α-2,3-唾液酸基特异的朝鲜槐(Maackia amurensis)凝集素(MAL-2)、α-2,3-唾液酸基特异的半乳凝素-1和神经氨酸酶抑制剂磷酸奥司他韦抑制,但不被α-2,6-唾液酸基特异的西洋接骨木(sambucusnigra)凝集素(SNA)抑制。
共同地,这些发现显示Neu1唾液酸酶是神经营养蛋白诱导的Trk活化以产生功能性受体的关键调节剂之一。会期望靶向Neu1是通过在细胞表面上的受体水平阻断TrkA信号转导通路的NGF活化的一种关键信号转导抑制剂。
在其它研究中,人类胰细胞系PANC-1、MIA-PaCa-2和APC-1中TrkA表达和激酶活性显示为直接与吉西他滨(gemcitabine)的化疗抗性相关。进一步表明,沉默RNA干扰(SiRNA)抑制TrkA表达和激酶活性,并且还增加吉西他滨诱导的胱天蛋白酶介导的细胞凋亡[23]。
在其它研究中,发现Neu1在造血细胞中负调节溶酶体胞外分泌,在所述造血细胞中其处理在溶酶体膜蛋白LAMP-1上的唾液酸[24]。在细胞表面上,Seyrantepe等人已经证明Neu1实际上能够通过表面受体的去唾液酸作用来激活巨噬细胞和树突细胞的吞噬作用,所述表面受体包括免疫球蛋白G的Fc受体(FcγR)[25]。Stomatos及其同事还已经证明细胞表面上的Neu1与组织蛋白酶A的亚单位紧密关联,且得到的复合物影响在活化细胞中的细胞表面唾液酸和IFNγ的产生[9]。使用Neu1不足的小鼠,在用蛋白抗原免疫接种后,它们产生明显较少的IgE和IgG1抗体,这可能是它们不能产生IL-4细胞因子的结果[26]。
理解配体诱导的EGFR活化在癌症生物学和疗法的领域中有极大相关性。瘤形成通常涉及EGFR过表达,其中EGFR信号转导的下游抗凋亡和促生长效果起作用以进一步加强癌细胞的存活和繁殖策略。因此,通常将EGFR表达和信号转导的分析并入瘤形成的临床管理。例如,EGFR过表达经常在基底细胞样乳腺肿瘤的分析中用作生物指标,其中它起着不良预后以及高复发和转移率的预测因子的作用[27]。
另外,细胞表面上EGFR突变体的存在也可以对癌细胞存活有严重且负面的影响。大量肿瘤涉及的主要EGFR突变体之一是EGFRvIII突变体,其含有在受体的细胞外区域中的267个氨基酸缺失,包括4个N-糖基化位点[5,28,29]。该受体的问题来自以下事实:其始终保留持续的活性,对癌细胞发送促生长和***信号的连续流。
新的癌症疗法已经基于该知识建立,并作用以希望关闭EGFR异常信号转导通路来抑制EGFR。靶标EGFR活化机制的疗法有两种主要形式:第一种涉及施用高亲和力的抗体(即西妥昔单抗(cetuximab))以竞争性结合至配体结合位点,由此防止配体结合;第二种涉及施用小分子抑制剂(即埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefinitib)),其结合至受体的酪氨酸激酶部分并抑制其磷酸化活性[30]。
在实验中使用PANC-1细胞系来确定Neu1唾液酸酶是否还在人类胰脏癌模型内的EGFR活化中起作用,所述PANC-1细胞系是来源于胰腺导管上皮细胞的人类癌细胞系。在该PANC-1细胞系中观察到与先前在3T3-hEGFR小鼠成纤维细胞系中观察到的结果相同的结果,其中EGFR的EGF刺激作用迅速诱导Neu1唾液酸酶活性。因此,提出Neu1唾液酸酶对配体诱导的EGFR活化机制是必要的,并且Neu1唾液酸酶的抑制作用会抑制EGFR。
发明内容
已经发现磷酸奥司他韦是Neu1唾液酸酶的抑制剂,并且还已经发现Neu1唾液酸酶通过细胞表面上的受体水平信号转导通路起作用以调节大量其它受体。EGFR和TrkA属于发现的由Neu1唾液酸酶调节的受体;已知这些受体在癌症中起作用。
在体外和体内研究中,已经发现磷酸奥司他韦是有效的抗癌剂。磷酸奥司他韦已经显示为在体内是对抗多种癌细胞类型的有效抗癌剂。
还已经发现,与化学治疗剂结合的磷酸奥司他韦能够提高化学治疗剂的功效,并能够提高在标准化学治疗疗法难治的细胞中的抗癌活性。
因此,本发明包括一种治疗癌症的方法,其包括对有此需要的对象施用有效量的磷酸奥司他韦。
本发明还涉及磷酸奥司他韦用于治疗癌症的用途。此外,本发明涉及磷酸奥司他韦用于制备治疗癌症的药物的用途。
本发明还包括一种治疗癌症的方法,其包括:对有此需要的对象施用治疗有效量的以下物质:
(a)磷酸奥司他韦;和
(b)一种或更多种化学治疗剂;
其中(a)和(b)是同时施用的或以任意顺序依次施用的。
本发明还涉及奥司他韦与一种或更多种化学治疗剂用于治疗癌症的用途。此外,本发明涉及磷酸奥司他韦用于制备治疗癌症的药物的用途。
本发明还涉及一种防止、抑制或减少癌症转移的方法,其包括对有此需要的对象单独或与化学治疗剂结合地施用磷酸奥司他韦。
本发明还涉及磷酸奥司他韦用于防止、抑制或减少癌症转移的用途。另外,本发明涉及磷酸奥司他韦在制备用于防止、抑制或减少癌症转移的药物中的用途。
已经发现,磷酸奥司他韦类似物可以用作Neu1唾液酸酶抑制剂。还已经发现,该类似物在体外用作对抗癌细胞的抗癌剂。
本发明还涉及一种治疗癌症的方法,其包括对有此需要的对象施用Neu1唾液酸酶抑制剂。本发明还涉及Neu1唾液酸酶抑制剂用于治疗癌症的用途。另外,本发明涉及Neu1唾液酸酶抑制剂在制备治疗癌症的药物中的用途。
在本发明的一个特殊方面,Neu1唾液酸酶抑制剂是磷酸奥司他韦或其类似物。
在本发明的另一方面,Neu1唾液酸酶抑制剂可以以单一疗法或与化学治疗剂的共同疗法施用。
在本发明的一个方面,奥司他韦类似物是磷酸奥司他韦衍生物或可用于磷酸奥司他韦的制备的中间体。
在本发明的一个方面,该类似物选自根据式A至F中任一个的化合物,或其盐、溶剂化物、前药、立体异构体、或其同位素标记的形式、或其混合物:
其中,
R1是卤素或COOR6;
R2是OH或OR7;
R3是OH、OR8或N3;
R4是H或C1-6酰基;
R5是OC1-6烷基、SC1-6烷基、OH、SH、卤素、N3、NH2、NHC1-6烷基或NHPG4,或
R4和R5连接以与它们所连接到的原子一起形成唑啉环;
R6是C1-6烷基;
R7与R8是相同或不同的,并独立地是C1-6烷基、C1-6酰基或PG5,或R7和R8连接以与它们所连接到的氧原子一起形成在氧原子之间的碳上经一个或两个C1-6烷基取代的5元环状缩酮(优选二甲基缩酮或二乙基缩酮);
PG4和PG5独立地是保护基团;
表示单键或双键,和
C1-6烷基和/或C1-6酰基基团中的一个或更多个氢任选地被F取代;
其中
R9是COOR14;
R10是H、OH或OC1-6酰基;
R13是NHC1-6酰基;
或R10中的O与R13中的N通过共价键连接;
R11和R12独立地是C1-6烷基;
R14是C1-6烷基,和
C1-6烷基和/或C1-6酰基基团中的一个或更多个氢任选地被F取代;
其中,
R15是COOEt、COOMe、COOiPr、COOnPr、COOCH2C≡CH、C(O)H、C(O)OH、C(O)O-、CCl3、CN、C≡CH、CH2C≡CH或CH2OH;
R16和R17独立地是H、C1-6烷基、C1-6酰基或合适的保护基团,或R16与R17连接以形成合适的保护基团,例如在氧原子之间的碳上任选地经一个或两个C1-6烷基基团取代的环状缩酮;和
R18和R19独立地是H、C1-6烷基、C1-6酰基或合适的保护基团,或R18和R19连接以形成合适的保护基团;
其中R15、R16、R17、R18和/或R19中的一个或更多个氢任选地被F取代;
其中,
R15是COOEt、COOMe、COOiPr、COOnPr、COOCH2C≡CH、C(O)H、C(O)OH、C(O)O-、CCl3、CN、C≡CH、CH2C≡CH或CH2OH;
R16和R17独立地是H、C1-6烷基、C1-6酰基或合适的保护基团,或R16和R17连接以形成合适的保护基团,例如在氧原子之间的碳上任选地经一个或两个C1-6烷基基团取代的环状缩酮;
R18和R19独立地是H、C1-6烷基、C1-6酰基或合适的保护基团,或R18和R19连接以形成合适的保护基团;和
R20是在还原或氢化反应条件下被移除的基团,或R20是合适的对酸不稳定的保护基团,例如R20是OH、R、O-R、O(C)-R、Si(R)3、NO2、NH2、N(R)2、S(O)2R或S(O)2OR,其中各个R独立地是烷基、芳基或杂芳基及其各种取代衍生物。
其中R15、R16、R17、R18、R19和/或R20中的一个或更多个氢任选地被F取代;
其中,
X+是阳离子;
R21和R22独立地是H、C1-6烷基或C1-6酰基,或R21与R22连接以与它们所连接到的原子一起形成未经取代的或经一个或更多个卤素或C1-6烷基取代的5元至10元环;
R23和R24独立地是H、C1-6烷基和C1-6酰基;
R25是OR26、NR27R28、=O或=NR29;
R26是H、C1-6烷基或C1-6酰基;
R27和R28独立地是H、C1-6烷基或C1-6酰基;
R29是H、OH、C1-6烷基、OC1-6烷基、C1-6酰基、OC1-6酰基、NH2、NHC1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6酰基)或NHC1-6酰基,或
R29与R23和R24之一形成连接基团“-A-C(O)-”以提供下式的化合物:
其中A是O或NH;和
R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28和/或R29中的一个或更多个可用的氢任选地被F取代;
或
其中,
X+是阳离子;
R30是H、C1-6烷基或C1-6酰基;
R31和R32独立地是F、C1-6烷基或C1-6酰基,或
R31和R32连接以与它们所连接到的原子一起形成未经取代的或经一个或更多个卤素或C1-4烷基取代的5元至10元环;
R33和R34独立地是H、C1-6烷基或C1-6酰基;和
R30、R31、R32、R33和/或R34中的一个或更多个可用的氢任选地被F取代。
在本发明的另一方面,磷酸奥司他韦类似物选自下式的化合物:
4-乙酰氨基-2-乙氧基-3,5-二羟基-环己烷甲酸钠(A1);
4-乙酰氨基-5-氨基-3-羟基-环己-1-烯甲酸钠(A2);
7-乙酰氨基-4-羟基-2,2-二甲基-3a,4,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A3);
7-乙酰氨基-6-羟基-2,2-二甲基-3a,4,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A4);
7-乙酰氨基-6-羟基亚氨基-2,2-二甲基-3a,6,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A5);或
7-乙酰氨基-6-(1-乙基-丙氧基)-2,2-二甲基-3a,6,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A6)
在另一方面,本发明包括为适合于注射的剂型的包含磷酸奥司他韦的药物组合物。本发明还包括包含磷酸奥司他韦和一种或更多种化学治疗剂的药物组合物。
在另一方面,本发明包括包含一种或更多种磷酸奥司他韦类似物和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还包括包含一种或更多种磷酸奥司他韦类似物和一种或更多种化学治疗剂的药物组合物。
在本发明的再一方面,提供了一种包含磷酸奥司他韦和治疗癌症的使用说明书的试剂盒。在本发明的再一方面,提供了一种包含磷酸奥司他韦和一种或更多种化学治疗剂以及使用说明书的试剂盒。
在本发明的再一方面,提供了一种包含磷酸奥司他韦类似物和治疗癌症的使用说明书的试剂盒。在本发明的再一方面,所述试剂盒还包含一种或更多种化学治疗剂。
通过以下的详细描述,本发明的其它特征和优点会变得明显。然而,应理解,该详细描述和具体实施例在说明本发明的优选实施方案时仅以举例说明给出,这是因为通过该详细描述,在本发明的精神和范围内的多种变化和修改对本领域技术人来说会变得明显的。
附图说明
图1是表示由Neu1唾液酸酶调节的细胞表面受体信号转导通路的示意图。
图2a显示在用不同剂量可溶性磷酸奥司他韦进行腹腔内治疗后植入MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞的RAG2/Cγ双突变小鼠的存活率。根据对数秩(Mantel-Cox)检验,存活曲线明显不同(p=0.0115)。
图2b显示表示用不同浓度的磷酸奥司他韦治疗的肿瘤重量的图(左图是第48天,右图是第61天)
图3a显示在用不同剂量可溶性磷酸奥司他韦进行腹腔内治疗后植入MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞后第48天,来自RAG2/Cγ双突变小鼠的肿瘤重量。
图3b显示来自在用可溶性磷酸奥司他韦腹进行腹腔内治疗后植入MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞的RAG2/Cγ双突变小鼠的第46天的肿瘤图像。
图3c显示使用Zeiss M2荧光显微镜拍摄的移植前的细胞荧光图像。
图4a显示每天用可溶性磷酸奥司他韦并用一次爱宁达(Alimta)或Abraxane进行腹腔内共同治疗后植入MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞的RAG2/Cγ双突变小鼠的存活率。根据对数秩(Mantel-Cox)检验,存活曲线明显不同(p<0.0001)。
图4b是表示用爱宁达或Abraxane单独治疗与用磷酸奥司他韦共同治疗相比较的肿瘤重量的图。
图5是取自植入MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞的RAG2/Cγ双突变BalBc异种移植小鼠的肿瘤、脾脏、肝脏、肺、心脏的生物光子图像。用黑色表示组织中的荧光MiaPaCa-2-eGFP细胞。
图6显示每天用可溶性磷酸奥司他韦和他莫昔芬(tamoxifen)进行腹腔内共同治疗后植入MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞的RAG2/Cγ双突变小鼠的存活率。根据对数秩(Mantel-Cox)检验,存活曲线明显不同(p<0.0234)。
图7显示每天用可溶性磷酸奥司他韦和指示的化学治疗剂进行腹腔内共同治疗后植入PANC-1人类胰脏癌细胞的RAG2/Cγ双突变非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠的存活率。根据如下对数秩(Mantel-Cox)检验,存活曲线明显不同(p<0.0001):
(a)对照与2mg/kg和5mg/kg磷酸奥司他韦(p<0.0001);
(b)对照与abraxane(p<0.09,不显著);
(c)对照与abraxane,2mg/kg和5mg/kg磷酸奥司他韦(p<0.0009);
(c)对照与吉西他滨,2mg/kg和5mg/kg磷酸奥司他韦(p<0.0001)。
具体实施方式
除非另有说明,如在本文中使用的,以下术语按照以下定义使用:
“抗癌剂”、“化学治疗剂”和“抗肿瘤剂”具有相同的含义,这些术语表示用于治疗癌症的药品(药物)。
“至少一种”是指一种或多于一种,例如,1、2或3,或1或2,或1。
“同时地”表示(1)时间上同时地(例如,同一时间);或(2)在普通疗程的过程中的不同时间。
“相继地”是指一个接着另一个。
“有效量”或“治疗有效量”表示描述对抑制或治疗癌症有效的本发明的化合物或组合物的量。例如,导致以下结果的化合物或组合物的量:(a)由癌症引起的一种或更多种症状的减少、缓和或消失,(2)肿瘤尺寸的减小,(c)肿瘤的消除,(d)肿瘤的长期疾病稳定(生长减少或生长停滞)和/或(e)防止转移或减少转移。
“一个或更多个”是指至少一个,例如,1、2或3,或1或2,或1。
“患者”包括人类和动物(优选人类)
“前药”表示在体内转化成活性化合物的化合物或其盐和/或溶剂化物。前药形式对本领域技术人员会是已知的,如在T.Higuchi和V.Stella,Pro-drugs as Novel Delivery Systems,A.C.S.Symposium Series的第14卷和Edward B.Roche,ed.,Bioreversible Carriers in Drug Design,AmericanPharmaceutical Association and Pergamon Press,1987中所教导的,二者均通过引用并入本文。
“依次地”是指(1)施用本方法中的一种组分((a)本发明的化合物,或(b)化学治疗剂),然后施用另外的组分;施用一种组分后,下一种组分可以基本在第一组分后立即施用,或下一种组分可以在第一组分后的有效时间段后施用;所述有效时间段是为了实现施用第一组分的最大利益而给出的时间的量。
“溶剂化物”表示化合物与一个或更多个溶剂分子的物理缔合;该物理缔合涉及不同程度的离子键合和共价键合,包括氢键;在特定情况下,溶剂化物会能够分离,例如在一个或更多个溶剂分子被并入结晶固体的晶格中时;“溶剂化物”包括溶液相和可分离的溶剂化物;合适的溶剂化物的非限制性实例包括乙醇盐、甲醇盐、等;“水合物”是其中溶剂分子是水的溶剂化物。
“药物组合物”旨在包括批量组合物和单个剂量单位,其由一种或更多种(例如两种)药学活性剂,例如本发明的化合物和另外的试剂如化学治疗剂,以及任何药学上合适的载体构成。批量组合物和每一单个剂量单位可以包含固定量的前述一种或更多种药学活性剂。批量组合物是尚未形成单个剂量单位的物质。说明性的剂量单位是口服剂量单位,如药片、药丸等。相似地,本文中描述的通过施用本发明的药物组合物来治疗患者的方法还旨在包括施用前述批量组合物或单个剂量单位。
“对象”旨在包括动物,其能够遭受或患有本文中公开的疾病(如癌症)。对象的实例包括哺乳动物,例如人类、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠、以及转基因的非人类动物。在具体实施方案中,对象是人,例如患有癌症、有患癌症风险、或潜在能够患有癌症的人。
“载体”指的是例如稀释剂、佐剂、赋形剂、辅助剂或可以与本发明的活性剂联用的载剂。“药学上可接受的载体”、或“药学上合适的载体”指的是适合于对对象施用的载体。
例如,适于注射的药物载体可以包括但不限于无菌液体,如水和油,包括石油、动物、植物或合成来源的油,例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选采用水或盐水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油水溶液作为载体,特别是用于可注射溶液。合适的药物载体在E.W.Martin的“Remington'sPharmaceutical Sciences”中进行描述。
“治疗”是指为了获得包括临床结果的有益的或期望的结果的方法。有益的或期望的临床结果可以包括但不限于:一种或更多种症状或病症的缓和或改善、疾病程度减小、疾病的稳定(即不恶化)状态、防止疾病扩散、延迟或减慢疾病进展、疾病状态的改善或减轻、减少疾病复发、和缓解(部分或全部的),不论可检测到的或检测不到的。“治疗”还可以指与未接受治疗的预期存活相比延长存活。
“奥司他韦类似物”中的“类似物”是指为Neu1抑制剂的奥司他韦类似物,还指作为抗癌剂有效的类似物。这种类似物可以包括奥司他韦的衍生物或可用于奥司他韦的制备的中间体。
治疗方法
根据一个方面,本发明提供一种用于通过对需要这种治疗的患者施用有效量(例如治疗有效量)的磷酸奥司他韦以抑制或治疗增殖性疾病,更具体地说癌症,更具体地说癌症的生长、进展、或转移的方法。在一个实施方案中,本发明提供一种用于通过施用有效量(例如治疗有效量)的磷酸奥司他韦以抑制或***的生长的方法。
可以被抑制或治疗的增殖性疾病(即癌症)的实例包括但不限于:肺癌(如肺腺癌和非小细胞肺癌);胰脏癌(例如胰腺癌,如外分泌胰腺癌);胃癌;食道癌;结肠癌(例如结直肠癌,如结肠腺癌和结肠腺瘤);骨髓性白血病(例如急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)和慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML));甲状腺滤泡癌;骨髓增生异常综合征(MDS);膀胱癌;表皮癌;黑色素瘤;乳腺癌;***癌;头颈部癌(例如头颈部的鳞状细胞癌);卵巢癌;脑癌(例如神经胶质瘤);间充质来源的癌(例如纤维肉瘤和横纹肌肉瘤、畸胎瘤(tetracarcinomas)、成神经细胞瘤);骨癌;肾癌;肝癌;非霍奇金氏淋巴瘤;多发性骨髓瘤;和未分化甲状腺癌。
例如,本发明的实施方案包括治疗癌症的方法,所述方法包括对需要这种治疗的所述对象施用有效量的磷酸奥司他韦,其中所述癌症是:胰脏癌、胃癌、食道癌、肺癌、骨髓性白血病、甲状腺滤泡癌、骨髓增生异常综合征、头颈部癌、黑色素瘤、乳腺癌、***癌、卵巢癌、膀胱癌、神经胶质瘤、表皮癌、结肠癌、非霍奇金氏淋巴瘤、或多发性骨髓瘤。
在具体实施方案中,磷酸奥司他韦可以用于治疗有此需要的对象的胰脏癌、乳腺癌或卵巢癌。
在具体实施方案中,对象是哺乳动物,在另一实施方案中对象是人。
在另一方面,本发明提供抑制或治疗增殖性疾病,特别是癌症,更特别地难治的癌症的方法。
术语“难治的”描述对治疗没有响应的疾病或病症。特别地,难治的癌症可以是已经变得耐药的癌症。
Neu1唾液酸酶,即从糖基化细胞分子裂解α-2,3连接的唾液酸的酶,已经被认为是在活的初级神经细胞和表达TrkA和TrkB的细胞系两者中,在配体结合至受体时,TrkA/B和受体活化的关键介质。研究表明一旦配体结合至Trk受体后,Neu1唾液酸酶就经由GPCR和基质金属蛋白酶(MMP)介导的通路变为活化的。如图1中所描述,在活化后,唾液酸酶起将外部受体去唾液酸化的作用,这导致二聚化,以及由此的受体活化和之后的信号转导。
还已经发现,TrkA受体和EGFR是通过相应的膜信号转导模式活化的。据认为,抑制Neu1唾液酸酶抑制了该通路,从而抑制至少这些受体的活性。
考虑到通过Neu1的受体去唾液酸作用已经显示为TrkA[12]、胰岛素和***[29]和表皮细胞生长因子受体活化与信号转导中的重要步骤,Neu1唾液酸酶可能实际上是所有RTK受体活化中主要的共同酶。
虽然不希望受理论约束,但是认为作为Neu1唾液酸酶抑制剂的磷酸奥司他韦抑制用于活化包括TrkA受体和EGFR的受体的信号转导通路,已知所述TrkA受体和EGFR在癌细胞的生长和增殖中起作用。磷酸奥司他韦抑制Neu1唾液酸酶和由此抑制用于活化受体、如TrkA和EGFR的信号转导通路的用途可以应用于增殖性疾病、如癌症的治疗。
不希望受理论约束,认为磷酸奥司他韦可以通过抑制Neu1唾液酸酶以抑制调节大量受体的通路和癌细胞生长和/或增殖涉及的那些受体的下游通路来起作用。
奥司他韦类似物
在本发明的另一实施方案中,已经发现奥司他韦类似物用作Neu1唾液酸酶抑制剂,由此以与磷酸奥司他韦对应的方式抑制信号转导通路。还已经发现这些奥司他韦类似物在体外研究中作为抗癌剂显示活性。因此,本发明的一个实施方案涉及包括对有此需要的对象施用磷酸奥司他韦类似物的治疗癌症的方法。
在本发明的一个实施方案中,奥司他韦类似物是为Neu1唾液酸酶抑制剂的奥司他韦类似物。在另一实施方案中,类似物选自如在PCT公布的申请WO2009/137916和WO2011/047466中公开的磷酸奥司他韦衍生物和用于磷酸奥司他韦制备的中间体所描述的类似物。
在本发明的一个方面,奥司他韦类似物为根据式A至F中任一个的化合物,或其盐、溶剂化物、前药、立体异构体、或其同位素标记的形式、或其混合物:
其中,
R1是卤素或COOR6;
R2是OH或OR7;
R3是OH、OR8或N3;
R4是H或C1-6酰基;
R5是OC1-6烷基、SC1-6烷基、OH、SH、卤素、N3、NH2、NHC1-6烷基或NHPG4,或
R4和R5键合以与它们所连接到的原子一起形成一个唑啉环;
R6是C1-6烷基;
R7与R8是相同或不同的,并独立地是C1-6烷基、C1-6酰基或PG5,或R7和R8连接以与它们所连接到的氧原子一起形成在氧原子之间的碳上经一个或两个C1-6烷基取代的5元环状缩酮(优选二甲基缩酮或二乙基缩酮);
PG4和PG5独立地是保护基团;
表示单键或双键,和
C1-6烷基和/或C1-6酰基基团中的一个或更多个氢任选地被F取代;
其中
R9是COOR14;
R10是H、OH或OC1-6酰基;
R13是NHC1-6酰基;
或R10中的O与R13中的N通过共价键连接;
R11和R12独立地是C1-6烷基;
R14是C1-6烷基,和
C1-6烷基和/或C1-6酰基基团中的一个或更多个氢任选地被F取代;
其中,
R15是COOEt、COOMe、COOiPr、COOnPr、COOCH2C≡CH、C(O)H、C(O)OH、C(O)O-、CCl3、CN、C≡CH、CH2C≡CH或CH2OH;
R16和R17独立地是H、C1-6烷基、C1-6酰基或合适的保护基团,或R16与R17连接以形成合适的保护基团,例如可以在氧原子之间的碳上任选地经一个或两个C1-6烷基基团取代的环状缩酮;和
R18和R19独立地是H、C1-6烷基、C1-6酰基或合适的保护基团,或R18和R19连接以形成合适的保护基团;
其中R15、R16、R17、R18和/或R19中的一个或更多个氢任选地被F取代;
其中,
R15是COOEt、COOMe、COOiPr、COOnPr、COOCH2C≡CH、C(O)H、C(O)OH、C(O)O-、CCl3、CN、C≡CH、CH2C≡CH或CH2OH;
R16和R17独立地是H、C1-6烷基、C1-6酰基或合适的保护基团,或R16和R17连接以形成合适的保护基团,例如可以在氧原子之间的碳上任选地经一个或两个C1-6烷基基团取代的环状缩酮;
R18和R19独立地是H、C1-6烷基、C1-6酰基或合适的保护基团,或R18和R19连接以形成合适的保护基团;和
R20是在还原或氢化反应条件下被移除的基团,或R20是合适的对酸不稳定的保护基团,例如R20是OH、R、O-R、O(C)-R、Si(R)3、NO2、NH2、N(R)2、S(O)2R或S(O)2OR,其中各个R独立地是烷基、芳基或杂芳基及其各种经取代的衍生物,
其中R15、R16、R17、R18、R19和/或R20中的一个或更多个氢任选地被F取代;
其中,
X+是阳离子;
R21和R22独立地是H、C1-6烷基或C1-6酰基,或R21与R22连接以与它们所连接到的原子一起形成未经取代的或经一个或更多个卤素或C1-6烷基取代的5元至10元环;
R23和R24独立地是H、C1-6烷基和C1-6酰基;
R25是OR26、NR27R28、=O或=NR29;
R26是H、C1-6烷基或C1-6酰基;
R27和R28独立地是H、C1-6烷基或C1-6酰基;
R29是H、OH、C1-6烷基、OC1-6烷基、C1-6酰基、OC1-6酰基、NH2、NHC1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6酰基)或NHC1-6酰基,或
R29与R23和R24之一形成连接基团“-A-C(O)-”以提供下式的化合物:
其中A是O或NH;和
R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28和/或R29中的一个或更多个可用的氢任选地被F取代;
或
其中,
X+是阳离子;
R30是H、C1-6烷基或C1-6酰基;
R31和R32独立地是F、C1-6烷基或C1-6酰基,或
R31和R32连接以与它们所连接到的原子一起形成未经取代的或经一个或更多个卤素或C1-4烷基取代的5元至10元环;
R33和R34独立地是H、C1-6烷基或C1-6酰基;和
在R30、R31、R32、R33和/或R34中的一个或更多个可用的氢任选地被F取代。
在另一实施方案中,化合物是具有式E的化合物,且R25是=NR29。
在本发明的另一方面,类似物是:
在另一方面,上述结构的对应的化学名称为:
4-乙酰氨基-6-乙氧基-3,5-二羟基-环己-1-烯甲酸钠(A1);
4-乙酰氨基-5-氨基-3-羟基-环己-1-烯甲酸钠(A2);
7-乙酰氨基-4-羟基-2,2-二甲基-3a,4,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A3);
7-乙酰氨基-6-羟基-2,2-二甲基-3a,4,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A4);
7-乙酰氨基-6-羟基亚氨基-2,2-二甲基-3a,6,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A5);和
7-乙酰氨基-6-(1-乙基-丙氧基)-2,2-二甲基-3a,6,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A6)。
虽然以上描述的类似物是以钠盐形式示出的,但是本领域技术人员会理解其它盐的形式是可能的,并且包括在本发明的范围内。此外,低级烷基(C1-6烷基)形式的羧酸酯也包含在本发明的范围内。
本文中所用的“烷基”,不论其是单独使用或作为其它基团的一部分使用,指的是直链或带支链的饱和烷基基团。“C1-6烷基”指具有1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基基团。
本文中所用的“酰基”,不论其是单独使用或作为其它基团的一部分使用,指的是直链或带支链的饱和酰基基团。“C1-6酰基”指具有1、2、3、4、5或6个碳原子的酰基基团。
本文中所用的“卤素”指卤素原子,并包括F、Cl、Br和I。
波浪键,例如“~~~”表示键的立体化学是可变的。例如,当连接到双键时,该符号表示键合至双键的基团是顺式或反式构型,或者化合物包括两种构型的混合物。
本文中所用的“任选地取代的”是指所述基团是未经取代的或经一个或更多个基团取代的,例如,任选的取代基可以包括C1-6烷氧基、硝基、氰基、羟基和氨基、以及其受保护的形式。
术语“药学上可接受的盐”是指中性化合物的酸加成盐或碱加成盐,所述中性化合物适合对象的治疗或与对象的治疗相容。
本文所用的术语“药学上可接受的酸加成盐”是指本发明的任何碱化合物或任何其中间体的任何无毒的有机或无机盐。形成合适的盐的说明性的无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸,以及金属盐,如磷酸氢钠和硫酸氢钾。形成合适的盐的说明性的有机酸包括单羧酸、二羧酸、和三羧酸,例如乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸和水杨酸,以及磺酸,如对甲苯磺酸和甲磺酸。可以形成单酸盐或二酸盐,这类盐可以以水合的、溶剂化的或基本无水的形式存在。总体来说,式I的化合物的酸加成盐在水中和多种亲水性有机溶剂中更加可溶,并且通常与它们的游离碱形式相比显示更高的熔点。适当的盐的选择会是本领域技术人员已知的。其它非药学上可接受的盐,如草酸盐可以例如在式I的化合物的分离中使用,或用于实验室使用,或用于后续的向药学上可接受的酸加成盐的转化。在本发明的实施方案中,药学上可接受的酸加成盐是盐酸盐。
本文所用的术语“药学上可接受的碱加成盐”是指本发明的任何酸化合物或任何其中间体的任何无毒的有机或无机盐。若化合物含有酸性基团,例如羧酸,则通过添加合适的碱形成碱加成盐。形成合适的盐的说明性的无机碱包括锂、钠、钾、钙、镁或钡的氢氧化物。形成合适的盐的说明性的有机碱包括脂肪族的、脂环族的或芳香族的有机胺,如甲胺、三甲胺、甲基吡啶、烷基氨或氨。这类盐可以以水合的、溶剂化的或基本无水的形式存在。适当的盐的选择会是本领域技术人员已知的。在本发明的一个实施方案中,药学上可接受的碱加成盐是碱金属盐,如钠盐。
期望的化合物盐的形成是利用标准技术获得的。例如,在合适的溶剂中用酸或碱处理中性化合物,并通过过滤、萃取或任何其它合适的方法将形成的盐分离。
本发明的类似物还可以配制为溶剂化物。术语“溶剂化物”指的是在化合物的晶格中并入合适的溶剂分子。合适的溶剂是在所施用的剂量生理学上可容许的。合适溶剂的实例是乙醇、水等。当水是溶剂时,该分子被称为“水合物”。本发明的类似物的溶剂化物的形成会根据化合物和溶剂化物而变化。通常,溶剂化物是通过在适当的溶剂中溶解化合物并通过冷却或使用抗溶剂来分离而形成的。溶剂化物通常是在环境条件下干燥或共沸的。
如上描述的奥司他韦类似物还可以包括前药形式。通常,这类前药会是式I的化合物的功能性衍生物,所述衍生物是在体内可容易地转化成其理论上衍生自的化合物的。类似物的前药可以是用可用的羟基或氨基基团形成的常规酯。例如,可以在碱的存在下,和任选地在惰性溶剂(例如在吡啶中的酰氯)中用活性酸使化合物中可用的OH和氮酰化。已经用作前药的一些常用酯是苯基酯、脂肪族(C8-C24)酯、酰氧甲基酯、氨基甲酸酯和氨基酸酯。在特定情况下,类似物的前药是其中化合物中羟基中的一个或更多个被遮蔽成在体内可以转化为羟基的基团的那些。用于合适的前药的选择和制备的常规程序例如在“Design of Prodrugs”ed.H.Bundgaard,Elsevier,1985中进行描述。
术语“同位素标记”指的是与自然界中原子的最丰富形式不同的原子的同位素形式。例如,2H、3H、13C、14C或放射性卤素,如125I。本发明的标记的化合物可以使用本领域中已知的标准方法制备。例如,可以使用标准技术将氚并入化合物,例如通过使用氚气和催化剂将合适的前体氢化为本发明的化合物。或者,可以使用标准碘化条件如[125I]碘化钠,在合适的溶剂、如二甲基甲酰胺中,在氯胺-T存在下,由相应的三烷基锡(适当地三甲基锡)衍生物来制备含有放射性碘的化合物。可以使用标准钯催化的锡化条件例如六甲基二锡,在惰性溶剂、如二氧六环中,在四(三苯基膦)钯(0)存在下,并在高温下,适当地在50至100℃的温度下,由相应的非放射性卤代化合物、合适的碘代化合物来制备三烷基锡化合物。
本发明的类似物可以在多个化学部分上包括保护基团,本领域技术人员会知道保护基团的取代和/或这些化学部分的去保护,并且含有这类改性的类似物也会包括在本发明的范围内。
术语“保护基团”或“保护性基团”或“PG”等指的是通常为了在操作分子中不同的部分或使其反应时防止分子的那些反应性部分中的副反应而保护或遮蔽分子的反应性部分的化学部分。在操作或反应完成后,在不降解或分解分子的其余部分的条件下,可以移除保护基团。合适的保护基团的选择可以由本领域技术人员进行。本领域已知很多常规保护基团,例如在“Protective Groups in Organic Chemistry”McOmie,J.F.W.Ed.PlenumPress,1973,In Greene,T.W.and Wuts,P.G.M.,“Protective Groups inOrganic Synthesis”JohnWiley&Sons,第3版,1999和Kocienski,P.“Proteciting Groups”,第3版,2003,Georg Thieme Verlag(The Americas)中所描述的。
本发明的类似物可以包含不对称中心。在本发明的类似物具有多于一个不对称中心的情况下,它们可以作为非对映异构体存在。应理解所有这类同分异构体和其以任何比例的混合物包含在本发明的范围内。应理解,虽然本发明的化合物的立体化学可以是如在本文中列出的任何给出的化合物中提供的,但是这类本发明的化合物还可以含有一定量(例如少于20%,优选少于10%,更优选少于15%)的具有交替的立体化学的本发明的化合物。
本领域技术人员会理解,虽然以上实施方案用作作为Neu1抑制剂和抗癌剂有活性的奥司他韦类似物的具体实例,但是包括已经在WO2009/137916和WO 2011/047466中公开那些的其它奥司他韦类似物也可以是合适的Neu1抑制剂和抗癌剂。这类类似物会被认为是在要求保护的本发明的范围内的。
施用形式
在本发明的另一方面,提供了含有磷酸奥司他韦和/或磷酸奥司他韦类似物,并任选地含有药学上可接受的载体的药物组合物。在与期望剂量的适当的药学上可接受的载体一起配制后,根据正在治疗的癌症,本发明的药物组合物可以通过口服、直肠、肠胃外、脑池内、***内、腹膜内、局部地(如通过散剂、软膏剂、或滴剂)、口腔如口喷雾或鼻腔喷雾、肌内、静脉内或肿瘤内等途径施用至对象。
根据本发明的方法,如本领域技术人员所理解的,磷酸奥司他韦或磷酸奥司他韦类似物或其盐或溶剂化物可以根据选择的施用途径以多种形式施用至患者。本发明的组合物可以例如通过口服、肠胃外的、口腔的、舌下的、鼻腔的、直肠的、贴剂、泵入或经皮的(局部的)施用,并且会相应地配制该药物组合物。肠胃外施用包括静脉内的、腹膜内的、皮下的、肌内的、经上皮的、鼻腔的、肺内的、鞘内的、直肠的和局部的模式的施用。肠胃外施用可以通过在选定时间段的持续输注来进行。
本发明的化合物可以口服施用,例如,用惰性稀释剂或用被吸收的可食用载体,或者可以将其包封在硬壳或软壳的明胶胶囊中,或者可以将其压成片剂,或者可以将其直接与饮食的食物合并。对于口服治疗施用,本发明的化合物可以与赋形剂合并,并以可摄取片剂、***片剂、糖锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、圆片剂等形式使用。
本发明的化合物也可以肠胃外施用。本发明的化合物的溶液可以在水中适当地与表面活性剂、如羟丙基纤维素混合来制备。还可以在含有或不含乙醇的在甘油、液态聚乙二醇、DMSO及其混合物中以及在油中制备分散剂。在储存和使用的常规条件下,这些制备物含有防腐剂以防止微生物的生长。本领域技术人员会知道如何制备合适的剂型。用于选择和制备合适的剂型的常规程序在例如在Remington's Pharmaceutical Sciences(2000-第20版)和1999年出版的The United States Pharmacopeia:TheNational Formulary(USP24NF19)中进行描述。
适合可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体,和用于临时制备无菌可注射的溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下,形式必须是无菌的并且必须是达到存在容易的可注射性的程度的流体。安瓿是方便的单位剂量。
用于鼻腔施用的组合物可以便利地配制为气溶胶、滴剂、凝胶和散剂。气溶胶剂型一般包括活性物质在生理学上可接受的水或非水溶剂中的溶液或细粒混悬剂,并通常在密封容器内以无菌形式的单或多剂量的量存在,所述密封容器可以采取与雾化装置一起使用的药盒或替换物的形式。或者,密闭容器可以是单一的分配装置,如单剂量鼻吸入器或装有计量阀的气溶胶分配器,所述计量阀在使用后会被清理。在剂型包括气溶胶分配器的情况下,其会包含推进剂,所述推进剂可以是压缩的气体,如压缩空气或有机推进剂如氟氯烃。气溶胶剂型还可以采取泵雾化器的形式。
适合口腔或舌下施用的组合物包括片剂、锭剂和糖果锭剂,其中活性成分与载体,如糖、***胶、黄芪胶或明胶和甘油一起配制。用于直肠施用的组合物是适宜地含有常规栓剂赋形剂、如可可脂的栓剂的形式。
用于局部施用的组合物可以包括例如丙二醇、异丙醇、矿物油和甘油。适合局部施用的制备物包括液态或半液态的制备物,如搽剂,洗剂,敷剂,水包油或油包水的乳剂,如乳膏、软膏剂或糊剂;或溶液或混悬剂,如滴剂。除上述的成分外,局部用制备物可以包含一种或更多种其它成分,例如稀释剂、缓冲剂、调味剂、黏合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂如羟基苯甲酸甲酯(包括抗氧化剂)、乳化剂等。
可以配制持续或直接释放的组合物,例如脂质体或其中活性化合物用可不同降解的包衣保护的那些,例如通过微型胶囊、多层包衣等。还可以冷冻干燥式I的化合物并使用获得的冻干品,例如,用于注射产品的制备。
片剂或胶囊中的多种非活性佐剂物质有助于化合物的溶解或调节它们的释放时间(例如在缓释剂型中)。这类成分可以包括但不限于高分子量的聚乙二醇或聚乙烯基吡咯烷酮(例如聚维酮),其可以与本发明的化合物一起配制在固体分散体中以增加胃肠溶解性和/或溶解速率。本发明的化合物还可以以含有GRAS(通常视为安全的)有助于溶解的载剂组分的溶液的形式口服施用,所述载剂包括但不限于低分子量的聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮、山梨醇、甘露醇和相似的多羟基化合物、羧甲基纤维素、葡聚糖等。这类溶解助剂还可以用在用于静脉内输注的液体剂型中。
用于口服施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物外,液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂,例如水或其它溶剂,增溶剂和乳化剂,如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、cremaphor、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯、及其混合物。除了惰性稀释剂外,口服组合物还可以包含佐剂,如润湿剂、乳化和助悬剂、甜味剂、调味剂和增香剂。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这类固体剂型中,活性化合物与以下物质混合:至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体,如柠檬酸钠或磷酸氢钙;和/或a)填充剂或增量剂,如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸;b)黏合剂,如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和***胶;c)湿润剂,如甘油;d)崩解剂,如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、特定的硅酸盐和碳酸钠;e)溶液阻滞剂,如石蜡;f)吸收促进剂,如季铵化合物;g)润湿剂,如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯;h)吸收剂,如高岭土和膨润土;i)润滑剂,如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂醇硫酸酯钠及其混合物;和(j)溶解速率增大剂,如物理混合物或固体分散体形式的高分子量聚乙二醇或聚乙烯基吡咯烷酮。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下,剂型还可以包含缓冲剂。
使用诸如乳糖的赋形剂以及高分子量聚乙二醇等,相似类型的固体组合物还可以作为填充剂用在软填充和硬填充的明胶胶囊中。固体剂型的片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可以利用包衣和壳,例如肠溶包衣和药物配制领域众所周知的其它包衣来制备。它们可以任选地含有乳浊剂,并且还可以具有在肠道的特定部位任选地以延迟的方式仅释放或优先释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。使用诸如乳糖的赋形剂以及高分子量聚乙二醇等,相似类型的固体组合物还可以作为填充剂用在软填充和硬填充的明胶胶囊中。
活性化合物还可以是具有一种或更多种如上所述赋形剂的微囊密封的形式。固体剂型的片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可以利用包衣和壳,例如肠溶包衣、释控包衣和药物配制领域众所周知的其它包衣来制备。在这类固体剂型中,活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂,如蔗糖、乳糖和淀粉混合。如在常规实践中一样,这类剂型还可以包含与惰性稀释剂不同的其它物质,例如片剂润滑剂和其它片剂助剂,如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下,剂型还可以包含缓冲剂。它们可以任选地含有乳浊剂,并且还可以具有在肠道的特定部位任选地以延迟的方式仅释放或优先释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括高分子物质和蜡。
用于本发明化合物的局部施用和经皮施用的剂型包括软膏剂、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。在无菌条件下使活性成分与药学上可接受的载体和任何需要的防腐剂或可能需要的缓冲剂混合。眼用剂型、滴耳剂和滴眼剂也被认为在本发明的范围内。另外,本发明预期皮肤贴剂的用途,其具有提供化合物向身体的受控递送的额外优点。这类剂型是通过将化合物溶解或分散在适当的介质中而制成的。吸收增强剂也可以用来增加化合物穿过皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散在聚合物基体或凝胶中来控制速率。
在特定实施方案中,本发明的磷酸奥司他韦可以以每天约0.1mg/kg至约50mg/kg对象体重、每天约1mg/kg至约25mg/kg对象体重、或每天约0.1mg/kg至约10mg/kg对象体重的剂量水平一天一次或多次地施用,以获得期望的治疗效果。还应了解,小于0.1mg/kg或大于50mg/kg的剂量可以被施用至对象。
通过注射施用磷酸奥司他韦可以防止或减少化合物的活性磷酸盐形式在肝脏中被代谢成羧酸盐形式。因此,在本发明的一个实施方案中,磷酸奥司他韦是通过注射施用的。在另一实施方案中,磷酸奥司他韦是肌内、静脉内或肿瘤内施用的。
可注射制备物,例如无菌可注射的水或油悬浮液可以根据已知技术用合适的分散剂或润湿剂及助悬剂来配制。无菌可注射制备物还可以是在无毒性的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射的溶液、悬浮液或乳液,例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的载剂和溶剂中有水、林格氏溶液(Ringer's solution)、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外,无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此,可以使用任何温和的不挥发性油,包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外,在注射剂的制备中使用脂肪酸,如油酸。优选地,聚乙二醇或聚乙烯基吡咯烷酮用作增溶剂。
可注射制剂可以例如通过靠细菌截留过滤器过滤或通过加入灭菌剂来灭菌,成为所述无菌固体组合物,其可以在使用前被溶解或分散到无菌水或其它无菌可注射介质中。
为了延长药品的作用,通常希望减慢来自皮下注射或肌内注射的药品的吸收。这可以通过使用水溶性差的液体悬浮液或者晶体或非晶材料来实现。药品的吸收速率于是取决于其溶解速率,又可以取决于晶体大小和结晶形式。或者,肠胃外施用的药品形式的延迟吸收是通过将药物溶解或悬浮到油性载剂中来实现的。可注射储库剂型是通过在生物可降解聚合物,如聚乳酸-聚乙醇酸交酯中形成药品的微胶囊基体来制成的。根据药品与聚合物的比率和使用的具体聚合物的性质,可以控制药品释放的速率。其它生物可降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库可注射剂型还是通过将药品包埋进与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备的。
治疗方法,联合疗法
在另一方面,本发明提供一种治疗癌症的方法,其包括对需要这种治疗的对象施用有效量(例如,治疗有效量)的磷酸奥司他韦和/或一种或更多种磷酸奥司他韦类似物以及有效量的一种或更多种抗癌剂(化学治疗剂)。
会理解与以上方法有关的增殖性疾病和所述癌症的实例也可以通过本发明的该方法来治疗。
在本发明的另一方面,抗癌剂是化学治疗剂。
抗癌剂(即化学治疗剂)的实例包括选自以下的抗癌剂:紫杉烷、铂配位化合物、为抗体的表皮细胞生长因子(EGF)抑制剂、为小分子的EGF抑制剂、为抗体的血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、为小分子的VEGF激酶抑制剂、MET抑制剂、ABL激酶抑制剂、ALK抑制剂、FLT-激酶抑制剂、MAPK/ERK激酶(MEK)抑制剂、RAF激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、***受体拮抗剂或选择性***受体调节剂(SERM)、抗肿瘤核苷衍生物、埃博霉素(epothilone)、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、为整合素抑制剂的抗体、为整合素抑制剂的小分子、叶酸拮抗剂、核苷酸还原酶抑制剂、蒽环类药物、生物制剂、萨力多胺(或相关的酰亚胺(imid))、热休克蛋白90抑制剂。
在一个实施方案中,本发明提供一种治疗癌症的方法,其包括有效量的磷酸奥司他韦和/或一种或更多种磷酸奥司他韦类似物以及有效量的基于顺式铂的化学治疗剂,如顺铂、顺氯氨铂或顺-二氨二氯合铂(II)(CDDP),氟尿嘧啶,吉西他滨,他莫昔芬,培美曲塞,或蛋白结合型紫杉醇,如Abraxane。
在本发明的另一方面,本领域技术人员会理解,磷酸奥司他韦和/或一种或更多种磷酸奥司他韦类似物可以与对特定类型的癌症有效的最著名标准疗法联合施用以改善或维持该治疗的结果。
在本发明的另一方面,提供了一种治疗标准疗法难治的癌症的方法,其包括施用磷酸奥司他韦和/或一种或更多种磷酸奥司他韦类似物以及该癌症的标准疗法。
在本发明的另一方面,提供了一种防止癌症变成治疗方案难治的方法,其包括与所述治疗方案一起施用磷酸奥司他韦和/或一种或更多种磷酸奥司他韦类似物。
在一个实施方案中,本发明提供一种治疗胰脏癌的方法,其包括对有此需要的对象施用治疗有效量的奥司他韦和/或一种或更多种磷酸奥司他韦类似物以及治疗有效量的吉西他滨。
在本发明的另一方面,提供了一种治疗有此需要的对象的癌症的方法,其包括同时地或依次地施用磷酸奥司他韦和/或一种或更多种磷酸奥司他韦类似物以及如上所述的化学治疗剂。
本发明的治疗方法的实施方案涉及药品(活性剂)的组合用于治疗癌症,即本发明涉及一种用于治疗癌症的联合疗法。本领域技术人员会理解药品通常是作为药物组合物单独施用的。包含多于一种药品的药物组合物的使用在本发明的范围内。
化学治疗剂可以以有经验的临床医生容易获得的剂型施用,并且通常是以它们通常规定的量施用(例如在Physician's Desk Reference,第57版,2003(由Thompson PDR发表,Montvale,N.J.07645-1742,其公开通过引用并入本文)中描述的量,或在制药商的药剂使用说明书中描述的量)。
例如,磷酸奥司他韦可以通过注射施用,化学治疗剂可以静脉内,通常作为静脉注射溶液施用。包含多于一种药品的药物组合物的用途也在本发明的范围内。
以治疗有效的剂量施用磷酸奥司他韦和/或一种或更多种磷酸奥司他韦类似物以及化学治疗剂以获得临床可接受的结果,例如减少或消除症状,或者减小或消除肿瘤,或者减慢或防止肿瘤的进一步生长。因此,在治疗方案中,磷酸奥司他韦和/或一种或更多种磷酸奥司他韦类似物以及化学治疗剂可以同时施用或相继施用。化学治疗剂的施用可以根据本领域已知的治疗方案来进行。
治疗方案
以通常持续一至七周并且一般重复6至12次的治疗方案施用磷酸奥司他韦和化学治疗剂。一般地,治疗方案持续一至四周。还可以采用一至三周的治疗方案。还可以采用一至两周的治疗方案。在该治疗方案或治疗周期期间,磷酸奥司他韦可以按日剂量或周剂量施用。剂量的量可以基于施用频率来调整。用药频率可以基于获得治疗的难易程度来调整。例如,住院患者可以接受每日用药,而院外患者可以接受与其它化学治疗剂的施用一致的每周或每两至三周一次的用药。化学治疗剂每周施用一次或更多次。一般地,化学治疗剂每周施用一次或每两或三周施用一次。
然而,本领域技术人员会理解治疗方案可以根据患者的需要变化。因此,本发明的方法中使用的活性剂(药品)的组合可以以上述方案的变化方案施用。例如,在治疗周期期间,磷酸奥司他韦可以间断地施用而非连续施用。因此,例如,在治疗周期期间,磷酸奥司他韦可以每日施用持续一周,然后停用一周,在治疗周期期间重复这种施用。或者,磷酸奥司他韦可以每日施用持续两周,停用一周,在治疗周期期间重复这种施用。因此,磷酸奥司他韦可以在周期期间每日施用持续一周或更多周,并在周期期间停用一周或更多周,在治疗周期期间重复这种模式的施用。该间断治疗还可以基于天数而非一整周。例如,每日用药持续1至6天,不用药持续1至6天,在治疗方案期间重复这种模式。不施用磷酸奥司他韦的天数(周数)不必等于施用磷酸奥司他韦的天数(周数)。通常,当使用间断用药方案时,施用磷酸奥司他韦的天数或周数至少等于或大于不施用磷酸奥司他韦的天数或周数。
化学治疗剂可以通过大药丸或持续输注来提供。化学治疗剂可以在治疗周期期间每天至每周一次、或每两周一次、或每三周一次、或每四周一次地提供。当在治疗周期期间每天施用时,该每天用药可以是在治疗周期的周数内间断的。例如,用药一周或数天,不用药一周或数天,在治疗周期期间重复这种模式。
在治疗周期期间,与磷酸奥司他韦一起使用的化学治疗剂以它们的通常规定的剂量施用(即化学治疗剂是根据这些药品的施用的实践标准来施用的)
本领域技术人员会认可本发明的方法中使用的施用的实际剂量和方案可以根据有经验的临床医生的判断而变化。在有经验的临床医生考虑如患者年龄、健康状况和体型、以及正在治疗的癌症的严重程度和患者对治疗的反应的因素后,可以做出改变施用剂量和方案的决定。
任何上述治疗方案中的磷酸奥司他韦可以用一种或更多种磷酸奥司他韦类似物替代,或可以将一种或更多种磷酸奥司他韦类似物添加至治疗方案。
其它Neu1唾液酸酶抑制剂
在本发明的另一方面,已经发现抗病毒化合物2-脱氧-2,3-二脱氢-N-乙酰神经氨酸(DANA)是Neu1唾液酸酶的温和抑制剂。还已经发现DANA类似物是Neu1唾液酸酶抑制剂。基于Neu1抑制剂DANA及其类似物作为Neu1唾液酸酶抑制剂的活性和已经显示为通过上述受体信号转导模式将Neu1唾液酸酶的抑制与Trk受体、EGFR及其它受体的调节关联的机制,认为它们可用于癌症的治疗。
在本发明的一个实施方案中,DANA的类似物具有式G:
其中,R50是C1-6烷基,其中所述烷基可以是直链的或带支链的脂肪族基团,或所述烷基可以是环烷基基团。
特别地,R50是甲基、丙基丁基、环丙基、环戊基、环己基、2-丁基、异丁基、叔丁基、3-戊基、异丙基。
在本发明的一个特定方面,R是甲基、丙基、丁基、2-丁基、环戊基、环己基。
在本发明的一个实施方案中,DANA类似物是:
试剂盒
本发明的另一方面提供一种试剂盒,其中所述试剂盒包含a)磷酸奥司他韦和药学上可接受的载体的药物组合物,和b)描述使用药物组合物治疗癌症的方法的说明书。
本发明的另一方面提供一种试剂盒,其中所述试剂盒包含a)一种或更多种磷酸奥司他韦类似物,和b)治疗癌症的使用说明书。在本发明的另一方面,所述试剂盒还包含一种或更多种化学治疗剂。
现在会通过实施例来描述本发明的实施方案。
材料和方法
小鼠
具有结合重组酶激活基因-1或重组酶激活基因-2(RAG1或RAG2)和共同细胞因子受体γ链(cγ)的双突变的免疫缺陷小鼠模型用作异种移植小鼠。在Balbc基因背景下的RAG2-/-x cγ-/-双突变小鼠是完全无淋巴细胞的(缺少T-细胞、B-细胞和NK细胞),不显示自发的肿瘤形成,并且显示正常造血参数。缺少RAG2和cγ(RAG2-/-/cγ-/-)两者的小鼠是通过杂交产生的,并保存于加拿大安大略K7L3N6K ingston的女王大学的动物健康机构(Animal Care Facility)中的SPF隔离器中。在该动物机构中建立一个种群。在非肥胖型糖尿病(NOD)的基因背景下缺少RAG1和cγ(RAG1-/-x cγ-/-)的小鼠是从Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)获得的,并在在动物机构中建立一个种群。所有小鼠都在无菌条件下保持在微型隔离器或空气过滤笼中,并为其提供高压灭菌过的食物和水。本研究中使用的所有小鼠均经女王大学动物健康委员会批准。使用6至8周大的小鼠。
癌细胞系
BxPC-3细胞(号:CRL-1687TM)是表达17β-***(E2)-结合***受体的具有上皮细胞形态的人类致瘤性胰脏癌细胞系,并来源于患有腺癌(起源于腺组织的上皮细胞癌)的女性患者。Mia-PaCa-2细胞(号:CRL-1420TM)是表达17β-***(E2)-结合***受体的具有附着上皮细胞和漂浮圆形细胞的人类胰脏癌细胞系,并来源于患癌(始于组织的癌症)的男性患者。PANC-1细胞(号:CRL-1469TM)是不表达***受体的具有附着上皮细胞形态的人类胰脏癌细胞系,并来源于具有上皮癌的胰腺导管。CAPAN-1细胞(号:HTB-79TM)是表达17β-***(E2)-结合***受体的具有上皮细胞形态的人类胰脏癌细胞系,并来源于具有腺癌的癌细胞转移的肝脏。
MDA MB-231细胞(号:HTB-26TM)是来源于具有上皮细胞形态的癌细胞转移的胸腔积液的人类乳腺癌。MCF-7(号:HTB-22TM)是来源于具有上皮细胞形态的癌细胞转移的胸腔积液的人类乳腺癌。A-2780细胞是由未经治疗的患有腺癌的患者的肿瘤组织建立的人类卵巢癌细胞系。细胞作为单层并在旋转培养物的悬浮液中生长。A-2780cis细胞是耐顺式铂的A-2780对应细胞。
所有细胞均在37℃在5%CO2中在含有补充10%胎牛血清(FCS)(HyClone,Logan,犹他,美国)的杜氏培养基(Dulbecco's ModifiedEagle Medium,DMEM)(Gibco,Rockville,MD)的培养基中生长。
eGFP Lentifect纯化慢病毒颗粒
GeneCopoeia LentifectTM慢病毒颗粒(Cat#LP-EGFP-LV105-0205)是即用型颗粒。它们是由使用纯化的质粒DNA和专用试剂EndoFectinTMLenti(用于转染)和TiterBoostTM溶液的标准化方案制备的。该方案使用符合生物安全级别2要求的第三代自失活封装***。Lentifect颗粒包括用于有效表达靶细胞中未标记的eGFP的CMV启动子,并使用耐嘌呤霉素标记物以选择稳定转导的细胞。即用型慢病毒颗粒用于MiaPaCa-2和PANC-1细胞的转导。
简单地说,细胞在包含10%胎牛血清(FCS)和5μg/mL plasmocin的DMEM培养基的6孔组织培养板中培养。24小时后,弃去培养基并将2ml的5μg/mL聚凝胺培养基添加至细胞,然后以MOI=6添加eGFP慢病毒颗粒。混合培养板,以2500rpm离心90分钟,并在37℃在5%CO2的控湿孵化器中孵育24小时。冲洗细胞并在培养基中再培养2天。在第5天,用含有如在细胞存活试验中预先确定的最佳的2μg/mL的嘌呤霉素的选择培养基替换所述培养基。每40个小时添加选择培养基以扩大转导耐嘌呤霉素eGFP的MiaPaCa-2和PANC-1细胞克隆。在植入到小鼠前利用荧光显微镜(Zeiss Imager M2)和生物光子成像确定了90%的转染率。
癌细胞植入到RAG-1-/-或RAG-2-/-x cγ-/-双突变异种移植小鼠中
转导耐嘌呤霉素eGFP的MiaPaCa-2或PANC-1细胞克隆在75cm2细胞培养瓶中以80%融合生长。用TrypLE Express(Gibco)将细胞重悬浮到溶液中,并用无菌盐水冲洗。以900rpm离心细胞悬浮液3分钟,细胞团块以5-10×106细胞/mL的浓度重悬浮在无菌盐水中用于将1-2×106细胞植入到小鼠右背侧面。肿瘤测量每周进行两次。肿瘤体积通过(宽度平方/2)×长度来确定。
MTT分析
MTT是用于测量酶活性的比色分析,所述酶将MTT或密切相关的染料(XTT、MTS、WST)还原为甲臜染料从而产生紫色。主要应用使得能够评价细胞活性(细胞计数)和增殖(细胞培养分析)。它还可以用来确定潜在药剂和有毒物质的细胞毒性,这是因为这些试剂会刺激或抑制细胞活力和细胞生长。MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物,一种黄色四唑)在活细胞内被还原为紫色的甲臜。添加增溶溶液(通常或是二甲亚砜,一种酸化乙醇溶液,或是在稀盐酸中的清洁剂十二烷基硫酸钠)以使不溶性紫色甲臜产物溶解为有色溶液。该有色溶液的吸光度可以通过用分光光度计在特定波长(通常为500至600nm)测量来定量。吸收最大值取决于使用的溶剂。
细胞增殖试剂WST-1
WST-1(Roche Applied Sciences,蒙特利尔)是测量活细胞代谢活性的即用型物质。WST-1分析是非放射性的并且可以完全在微型板中进行。它适合于测量细胞增殖、细胞活力或细胞毒性。该分析基于由活细胞引起的WST-1还原。反应产生可溶性甲臜盐。程序包括:在96孔微型板中培养细胞,然后利用WST-1孵育细胞大约0.5至4小时。在该孵育期间,活细胞将WST-1转化成水溶性甲臜染料。用ELISA读板仪进行微型板中的甲臜染料的定量。吸光度直接与细胞数相关联。
化学治疗剂
顺铂、顺氯氨铂、或顺-二氨二氯合铂(II)(CDDP)是基于铂的化疗药品,其用于治疗多种类型的癌症,包括肉瘤、一些癌(例如小细胞肺癌和卵巢癌)、淋巴瘤和生殖细胞瘤。它是现在还包括卡铂和奥沙利铂的一类抗癌药品中的首位成员。这些铂复合物在体内反应,结合至DNA并导致最终引发细胞凋亡(程序性细胞死亡)的DNA交联。
氟尿嘧啶(5-FU或f5U)(以商品名Adrucil、Carac、Efudex和Fluoroplex出售)是用于癌症治疗的嘧啶类似物的药品。它通过非竞争性抑制胸苷酸合成酶起作用。由于其非竞争性性质和对胸苷酸合成酶的作用,5-FU经常被称为是“***性失活剂”。它属于被称为抗代谢物的药品的家族。它一般与亚叶酸一起施用。
吉西他滨用于多种癌:非小细胞肺癌、胰脏癌、膀胱癌和乳腺癌。它正被研究用于食管癌,并实验性地用于淋巴瘤和多种其它肿瘤类型。吉西他滨代表胰脏癌护理的进步。它也不像一些其它化疗形式一样使人虚弱。与氟尿嘧啶和其它嘧啶类似物一样,在DNA复制期间,吉西他滨的三磷酸类似物取代核酸的构筑单元之一,在该情况下为胞嘧啶核苷。该方法阻止肿瘤生长,这是因为新的核苷不能附着至“有错的”核苷,导致细胞凋亡。
他莫昔芬竞争性地结合至肿瘤上的***受体和其它组织靶点,产生减少DNA合成并抑制***作用的核复合物。它是具有有效的抗***属性的非类固醇试剂,其与***竞争乳腺和其它组织中的结合位点。他莫昔芬导致细胞保持在细胞周期的G0和G1阶段。因为它防止癌(前)细胞***,但不导致细胞死亡,他莫昔芬是抑制细胞生长的而不是杀细胞的。他莫昔芬是前药,对其靶蛋白***受体具有相对小的亲和力。它在肝脏中通过细胞色素P450亚型CYP2D6和CYP3A4代谢成活性代谢物,例如4-羟基他莫昔芬和N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(endoxifen),它们与***受体的亲和力是他莫昔芬本身的30至100倍。GPR30是***应答的GPCR(7-跨膜G蛋白偶联受体)。GPR30是已经显示是***应答受体的7-跨膜G蛋白偶联受体(GPCR),主要在内质网中表达。信号转导经由异源三聚体G蛋白活化发生,导致基质-金属蛋白酶活化,释放结合肝素的EGF和用之后的MAPK与Akt活化来反式激活EGFR。他莫昔芬对GPR30-和ER-介导的核信号转导其不同的作用,他莫昔芬以空间上不同于***的方式活化GPR30。
培美曲塞(商品名Alimta)是由Eli Lilly and Company制造并销售的化疗药品。其适应症是胸膜间皮瘤以及非小细胞肺癌的治疗。培美曲塞与叶酸化学上相似,并且属于被称为叶酸抗代谢物的化疗药品类。其通过抑制嘌呤和嘧啶合成中使用的三种酶起作用:胸苷酸合成酶(TS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)和甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶(GARFT)。通过抑制前体嘌呤和嘧啶核苷酸的形成,培美曲塞防止正常细胞和癌细胞二者的生长和存活所需的DNA和RNA的形成。
用于可注射混悬剂的ABRAXANE(用于可注射混悬剂的紫杉醇蛋白结合颗粒)(结合白蛋白)适用于转移性疾病联合化疗失败或辅助化疗6个月内复发后的乳腺癌的治疗。
磷酸奥司他韦是由可商购的以商品名Tamiflu出售的磷酸奥司他韦片剂制备的。将Tamiflu75mg胶囊溶解到无菌盐水中并弃去不溶解的填充剂。
统计
两组之间的比较是通过95%置信度的单向方差分析使用未配对的t检验进行的,多于两个的组间的比较使用Bonferroni多重比较检验或Dunnett多重比较检验来进行。
实施例1
磷酸奥司他韦对培养中的胰脏癌细胞、乳腺癌细胞和卵巢癌细胞的细胞活力的影响的LD50值
表1中的数据显示治疗培养中的胰脏癌细胞系、乳腺癌细胞系和卵巢癌细胞系的磷酸奥司他韦杀死百分之五十的活细胞所需要的单个剂量(LD50)。LD50值是以孵育72小时后通过MTT或WST-1分析确定的药品浓度μM给出的。结果表明,与化疗敏感的Capan-1胰转移癌细胞系的磷酸奥司他韦治疗的2μM的低LD50值相比,耐化学治疗剂的三种胰脏癌细胞(MiaPaCa-2、PANC-1和BxPC-3)具有在850至1462μM范围内的磷酸奥司他韦治疗的高LD50值。此外,磷酸奥司他韦治疗后,两种乳腺癌细胞系(耐化疗的MDA MB-231和化疗敏感的MCF-7)和两种卵巢癌细胞系(耐化疗的A2780cis和化疗敏感的A2780)显示在0.6至3μM范围内的低LD50值。该体外数据表明磷酸奥司他韦可以逆转胰脏癌细胞系、乳腺癌细胞系和卵巢癌细胞系中的化疗耐药性。
表1 磷酸奥司他韦对培养中的癌细胞的细胞活力的影响的LD50值
LD50值是以孵育72小时后通过MTT或WST-1分析确定的药品浓度μM给出的。LD50表示杀死百分之五十的活细胞所需要的单个剂量。
磷酸奥司他韦与吉西他滨、顺铂、5-氟尿嘧啶和他莫昔芬联合使用显示出是有效的,尤其是在癌细胞对常规化疗已经变得难治的情况下(表2至4)。值得注意的是,与所述标准化疗药联用,BxPC-3细胞的730μM磷酸奥司他韦治疗使顺铂的敏感性(LD50)增加5倍,使5-氟尿嘧啶的敏感性(LD50)增加16倍,使他莫昔芬的敏感性(LD50)增加3倍,并使吉西他滨的的敏感性(LD50)增加1倍(表2)。与所述标准化疗药联用,BxPC-3细胞的1460μM磷酸奥司他韦治疗进一步使5-氟尿嘧啶的敏感性增加160倍,使他莫昔芬的敏感性增加115倍,并使吉西他滨的敏感性增加0.78倍(表2)。对于PANC-1(表3)和MiaPaCa-2细胞(表4)显示与使用磷酸奥司他韦治疗相似的化疗药敏感性的趋势。
表2 磷酸奥司他韦(Tamiflu)与标准化疗药共同治疗对培养中的癌细胞的细胞活力的影响的LD50值
LD50值是以孵育72小时后通过MTT分析确定的用或不用磷酸奥司他韦的μM化疗药浓度给出的。LD50表示杀死百分之五十的活细胞所需要的单个剂量。
表3 磷酸奥司他韦(Tamiflu)与标准化疗药共同治疗对培养中的癌细胞的细胞活力的影响的LD50值
LD50值是以孵育72小时后通过MTT分析确定的用或不用磷酸奥司他韦的化疗药浓度μM给出的。LD50表示杀死百分之五十的活细胞所需要的单个剂量。
表4 磷酸奥司他韦(Tamiflu)与标准化疗药共同治疗对培养中的人类癌细胞的细胞活力的影响的LD50值
LD50值是以孵育72小时后通过MTT分析确定的用或不用磷酸奥司他韦的化疗药浓度μM给出的。LD50表示杀死百分之五十的活细胞所需要的单个剂量。
表5中显示的数据表明对于胰转移Capan-1细胞、两种乳腺癌细胞系(耐化疗的MDA MB-231和化疗敏感的MCF-7)和两种卵巢癌细胞系(耐化疗的A2780cis和化疗敏感的A2780),与730μM磷酸奥司他韦联合使用的吉西他滨和abraxane化疗药的LD50(μM)敏感性增加两倍。
表5 磷酸奥司他韦(Tamiflu)与标准化疗药共同治疗对培养中的人类癌细胞的细胞活力的影响的LD50值
LD50值是以孵育72小时后通过WST-1分析确定的药品浓度μM给出的。LD50表示杀死百分之五十的活细胞所需要的单个剂量。
实施例2
磷酸奥司他韦对培养中的MiaPaCa-2和PANC-1胰脏癌细胞的细胞活力的影响的LD50值
奥司他韦类似物及其制造方法公开于WO2009/137916和WO2011/047466。表6中显示了类似物对培养中的MiaPaCa-2和Panc-1胰脏癌细胞的细胞活力的影响的以μM计的LD50。相比于对MiaPaCa-2细胞的850μM磷酸奥司他韦和对PANC-1细胞的1462μM的LD50,奥司他韦类似物A2显示对MiaPaCa-2细胞具有1.97μM和对PANC-1细胞具有0.01μM的LD50的最高效力。具有第二高效力的奥司他韦类似物是A5(对MiaPaCa-2细胞24μM和对PANC-1细胞3μM),其次是LD50效力递减的A3、A1、A3和A6。该体外数据建立了磷酸奥司他韦类似物也能逆转胰肿瘤细胞系中(例如MiaPaCa和PANC-1)的化疗耐药性的概念验证。
表6 磷酸奥司他韦类似物(TD)对培养中的MiaPaCa-2和Panc-1胰脏癌细胞的细胞活力的影响的LD50值
LD50值是以孵育72小时后通过WST-1分析确定的药品浓度μM给出的。LD50表示杀死百分之五十的活细胞所需要的单个剂量。
实施例3
不同剂量的磷酸奥司他韦对植入RAG2/Cγ双突变的Balbc异种移植小鼠的MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞的肿瘤体积(mm3)的影响
还在人类胰脏癌的RAG2/Cγ双突变异种移植雄性小鼠模型中研究了磷酸奥司他韦的体内抗肿瘤活性。将0.2mL的1.5×106的MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞皮下植入这些小鼠的右背侧面。研究中的每个小鼠都通过耳穿孔号辨认。监测植入癌细胞后的各小鼠在移植部位的肿瘤体积生长(长度和宽度)、体重、和身体状态评分每周两次。对啮齿动物的身体状态评分是用于评价健康和建立体重不是可用监测工具的成年终点的非侵入性方法,例如用肿瘤模型。身体状态评分(BC)在1(消瘦)至5(肥胖)的范围内。预期的2的BCS—健康状况不良的—或更低的BCS需要在方案中说明理由。分数是通过频繁目测和动手检查每个动物确定的。动手评价是通过轻轻握住小鼠的尾巴根部并用手指穿过骶骨关节骨头来进行的。将结果与BC范围的描述和图表配对以确定分数。记录每个动物的分数。
表7中的数据显示移植后第40天,当肿瘤体积是50至100mm3时,2mg/kg、10mg/kg、50mg/kg和100mg/kg的磷酸奥司他韦单一疗法腹腔内治疗与未治疗的对照组相比有效并显著地使疾病进展时间内的肿瘤生长减少超过50%,并显著地扩大了存活率(图1)。此外,与未治疗的对照组相比,肿瘤重量有明显但不显著的降低(图1)。植入MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞的RAG2/Cγ双突变Balbc异种移植小鼠的磷酸奥司他韦治疗的单一疗法是使用50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg剂量可重复的(表8和图2)。这些结果支持磷酸奥司他韦单一疗法在体内具有有效的抗肿瘤增殖性能的假设,并支持体内结果中发现的支持性证据。
表7 磷酸奥司他韦剂量对植入RAG2/Cγ双突变的Balbc异种移植小鼠的MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞的肿瘤体积(mm3)的影响
表8 磷酸奥司他韦剂量对植入RAG2/Cγ双突变的Balbc异种移植小鼠的MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞的肿瘤体积(mm3)的影响
磷酸奥司他韦(每天10mg/kg)与爱宁达(100mg/kg18次注射)或Abraxane(200mg/kg单次注射)共同治疗对植入RAG2/Cγ双突变Balbc异种移植小鼠的MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞的肿瘤体积(mm3)的影响
为了评价,研究了与对抗胰肿瘤的生长和扩散的标准爱宁达和Abraxane化疗药结合的10mg/kg剂量的磷酸奥司他韦在体内的广泛功效。RAG2/Cγ双突变异种移植小鼠模型是在右背侧面移植0.2mL的1.5×106MiaPaCa-2-eGFP细胞移植。当移植部位的肿瘤体积达到50至100mm3时,用总共18次腹腔内(I.P.)注射的100mg/kg的爱宁达、以单次腹腔内注射的200mg/kg的Abraxane、或联合每天腹腔内注射的10mg/kg的磷酸奥司他韦治疗小鼠。表9中的数据显示与爱宁达或Abraxane联用的10mg/kg的磷酸奥司他韦在移植后第48天有效地减少了疾病进展时间内的肿瘤生长:与对照组相比,与爱宁达联用减少了77%,与Abraxane联用减少了94%。移植后第63天,用联合疗法的肿瘤体积有40至75%的减小。移植后第84天和第101天,Abraxane和磷酸奥司他韦的组合相比于对照组在肿瘤生长方面分别维持了70%和40%的减少。此外,与未治疗的对照组存活至第51天相比,Abraxane与磷酸奥司他韦的组合显著地扩大患肿瘤小鼠的存活率到101天,其次是Abraxane单一疗法到第87天,爱宁达单一疗法和爱宁达与磷酸奥司他韦的组合到第70天(图3)。此外,与未治疗的对照组相比,除了Abraxane单一疗法外,肿瘤重量存在明显但不显著的减小(图3)。
表9 磷酸奥司他韦(每天10mg/kg)与爱宁达(100mg/kg)或Abraxane(200mg/kg)共同治疗对植入RAG2/Cγ双突变Balbc异种移植小鼠的MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞的肿瘤体积(mm3)的影响
表10中的数据表明各个上述治疗组中以平均结节数量和以mm计的结节尺寸作为量度的肝转移。当与未治疗的对照组相比时,在治疗组中肝转移有大于80%的显著减少。此外,爱宁达或Abraxane与磷酸奥司他韦的组合进一步使肝转移减少超过化学治疗药单一疗法的6%。图4中的结果显示从尸体解剖获得的不同组织的生物光子图像。组织中的黑色是存在荧光MiaPaCa-2-eGFP细胞的指示。
表10 磷酸奥司他韦(每天10mg/kg)与爱宁达(100mg/kg)或Abraxane(200mg/kg)共同治疗对植入RAG2/Cγ双突变Balbc异种移植小鼠的MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞的肝转移的影响
磷酸奥司他韦(每天100mg/kg)与他莫昔芬(0.1mg/kg)共同治疗对植入RAG2/Cγ双突变Balbc异种移植小鼠的MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞的肿瘤体积(mm3)的影响
为了进一步评价,研究了与对抗胰肿瘤的生长和扩散的标准他莫昔芬化学治疗剂结合的100mg/kg剂量的磷酸奥司他韦在体内的广泛功效。RAG2/Cγ双突变异种移植小鼠模型是在右背侧面移植0.2mL的1.5×106MiaPaCa-2-eGFP细胞移植。当移植部位的肿瘤体积达到50至100mm3时,用总共15次腹腔内(I.P.)注射的0.1mg/kg他莫昔芬或结合每天腹腔内注射的10mg/kg的磷酸奥司他韦治疗小鼠。表11中的数据显示与他莫昔芬联用的100mg/kg的磷酸奥司他韦使疾病进展时间内的肿瘤生长在移植后第59天有效地减少了43%,在移植后第62天有效地减少了56%,在移植后第66天有效地减少了47%,在移植后第73天有效地减少了17%。
表11 100mg/kg磷酸奥司他韦(Tamiflu)与0.1mg/kg他莫昔芬共同治疗对植入RAG2/Cγ双突变Balbc异种移植小鼠的MiaPaCa-2-eGFP胰脏癌细胞的肿瘤体积(mm3)的影响
此外,与未治疗的对照组存活至第60天相比,磷酸奥司他韦与他莫昔芬的组合显著地扩大患瘤小鼠的存活率到第76天,其次是他莫昔芬单一疗法到第66天(图5)。
磷酸奥司他韦与Abraxane和吉西他滨化学治疗剂共同治疗对植入RAG2/Cγ双突变NOD异种移植小鼠的PANC-1人类胰脏癌细胞的肿瘤体积(mm3)的影响
使用PANC-1胰脏癌细胞,研究了与对抗其它胰肿瘤的生长和扩散的标准的Abraxane和吉西他滨化学治疗剂联用的2mg/kg或5mg/kg剂量的磷酸奥司他韦在体内的功效。RAG2/Cγ双突变异种移植小鼠模型是在右背侧面移植0.2mL的2×106PANC-1细胞。当移植部位的肿瘤体积达到50至100mm3时,用每天腹腔内(I.P.)注射的2mg/kg和5mg/kg的磷酸奥司他韦单一疗法、每周一次腹腔内注射的0.5mg/kg的Abraxane、每周一次腹腔内注射的30mg/kg的吉西他滨或联用两种剂量的磷酸奥司他韦与Abraxane或吉西他滨治疗小鼠。表12中的数据显示,2mg/kg或5mg/kg的磷酸奥司他韦单一疗法在移植后第79天使疾病进展时间内的肿瘤生长有效地减少了31%至35%,但到第93天时失去了其效果。值得注意的是,当与未治疗组相比时,Abraxane的0.5mg/kg的低剂量对肿瘤体积几乎没有影响,但联用2mg/kg或5mg/kg的磷酸奥司他韦则使肿瘤生长在移植后第79天有效地减少了19%至25%,在移植后第84天有效地减少了17%。
表12 磷酸奥司他韦(Tamiflu)与化学治疗剂共同治疗对植入RAG2/Cγ双突变NOD异种移植小鼠的PANC-1人类胰脏癌细胞的肿瘤体积(mm3)的影响
表12中的数据还显示,300mg/kg的吉西他滨单一疗法使疾病进展时间内的肿瘤生长在移植后第79天显著地减少了86%,在移植后第84天显著地减少了89%,在移植后第93天显著地减少了69%,在移植后第112天显著地减少了63%。值得注意的是,由于肿瘤变得对吉西他滨的化学治疗作用有耐药性,吉西他滨单一疗法开始失去其对肿瘤生长的影响,并到第93天失去其作用。通过维持移植后第93天89%的减少和第112天78%至91%的减少,吉西他滨和两种不同剂量的磷酸奥司他韦的组合显著地逆转了肿瘤的化学治疗剂耐药性。
图6中显示的结果清楚地表明患肿瘤小鼠的存活率非常显著的延长:与未治疗组存活至第80天相比,吉西他滨与磷酸奥司他韦的组合延长到112天,其次磷酸奥司他韦单一疗法延长到第91天和第94天,与磷酸奥司他韦联用的Abraxane延长到第87天和第91天。与未治疗的对照组相比,0.5mg/kg的低剂量的Abraxane单一疗法对小鼠存活率没有影响。
表13中的数据表明各个上述治疗组中以平均结节数量和以mm计的结节尺寸作为量度的肝转移。当与未治疗的对照组相比时,在移植后不同天数的治疗组中肝转移有大于38%的显著减少。此外,吉西他滨与5mg/kg的磷酸奥司他韦的组合与未治疗的对照组相比肝转移减少81%,并在移植后第109天进一步使肝转移减少超过化学治疗药单一疗法的10%。
表13 磷酸奥司他韦(Tamiflu)(每天10mg/kg)与爱宁达(100mg/kg)或Abraxane(200mg/kg)共同治疗对植入RAG1/Cγ双突变NOD异种移植小鼠的PANC-1胰脏癌细胞的肝转移的影响
表14包括抗病毒剂2-脱氧-2,3-二脱氢-N-乙酰神经氨酸(DANA)类似物对Neu1唾液酸酶的抑制的IC50数据。DANA类似物已经由Magesh等人在之前公开[33]。
表达TLR的BMA巨噬细胞在12mm圆形载玻片上在含有添加10%胎牛血清的DMEM的培养基中生长。移除培养基后,将pH7.4的Tris缓冲盐水中的2.04mM4-MUNANA底物[2’-(4-甲基伞形酮)-α-D-N-乙酰神经氨酸](Sigma-Aldrich)与预定剂量的特定配体一起、或与配体和不同剂量的抑制剂结合单独地添加至各个载玻片(对照)。底物被唾液酸酶水解以产生在365nm激发后在450nm有荧光发射(蓝色)的游离的4-甲基伞形酮。在2至3分钟后,用荧光显微镜(Zeiss Imager M2,40倍物镜)拍摄荧光图像。
该最近开发的分析是用来检测活细胞表面的唾液酸酶活性的。利用荧光唾液酸酶特定底物,4-MUNANA[2’-(4-甲基伞形酮)-α-D-N-乙酰神经氨酸],其分解产物4-甲基伞形酮在450nm发荧光,在细胞周围的边缘显现唾液酸酶活性。在活的BMA巨噬细胞中评价一系列酰胺键合的C9改性的DANA(2-脱氧-2,3-二脱氢-D-N-乙酰神经氨酸)类似物对脂多糖(LPS)诱导的Neu1唾液酸酶活性的抑制能力。为了进一步说明这些DANA类似物的抑制能力,通过将唾液酸酶活性的下降对试剂浓度的对数作图来确定各个化合物的半抑制浓度(IC50)。表14中显示的结果表明,具有直链烷基侧链或5元或6元环烷基侧链的DANA类似物与具有支链侧链和与母体DANA化合物相比具有增大的对LPS诱导的唾液酸酶活性的抑制能力。认为由于分子的该部分中减少的空间位阻,具有直链或未分支的侧链的类似物可以与Neu1活性位点更有效地反应。
表14:DANA类似物对Neu1唾液酸酶的抑制活性
基于目前体内研究的结果,这些发现表明,利用免疫缺陷异种移植小鼠,磷酸奥司他韦单一疗法或与标准化学治疗药共同治疗防止两种不同人类胰脏癌的体内生长。这些发现提供了用于防止(a)人类胰肿瘤生长和(b)肝转移的有效的磷酸奥司他韦单一疗法或与标准化疗药联用的原理论证。此外,磷酸奥司他韦单一疗法或与标准临床化学治疗药联用在治疗胰脏癌、特别是该癌变得常规化学治疗剂难治的情况中具有有前景的潜力。
这些体内数据加上体外数据表明磷酸奥司他韦和与常规化学治疗剂联用的磷酸奥司他韦的有效性提供了对磷酸奥司他韦用于一般癌症治疗的用途的支持和进一步对与已知化学治疗剂联用的磷酸奥司他韦用于癌症治疗的用途的支持。
另外,表明作为对抗所测试癌细胞系有效的药剂的磷酸奥司他韦类似物的有效性的体外数据表明,磷酸奥司他韦类似物还可以用作癌症治疗中的活性剂。还应注意,之前发现相同的磷酸奥司他韦类似物是Neu1唾液酸酶抑制剂。该与癌细胞分析中的体外结果的结合表明这些化合物很可能通过与磷酸奥司他韦相同的信号转导通路起作用。在这个基础上,本领域技术人员会理解预期其它具有Neu1唾液酸酶活性的磷酸奥司他韦类似物也可用于癌症治疗。
另外应理解,为Neu1唾液酸酶抑制剂的其它化合物也会经由受体信号转导模式作用以影响Trk受体和EGFR以及可能地其它受体,并可以由此用于治疗癌症。这类Neu1唾液酸酶抑制剂的实例是DANA和如以上B1-B11描述的DANA类似物。
虽然本发明已参考具体实施方案和实施例进行描述,但是应理解本发明不限于所公开的实施例。相反地,本发明旨在涵盖各种修改和等效布置。本发明还旨在涵盖在合适的情况下将关于一个实施方案描述的各种替代方案应用到其它实施方案。这种修改和布置是包括在所附的权利要求的精神和范围内的。
所有出版物、专利和专利申请通过引用完整地并入本文,达到与每一单个出版物、专利或专利申请是具体地并单独地说明为通过引用完整地并入相同的程度。在发现本申请中的术语与通过引用并入本文的文件中的定义不同的情况下,本文中所提供的定义作为该术语的定义。
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提供以下参考文献以作为关于本发明的现有技术。以下列表并不打算包含所有相关技术的全部清单。本发明说明书中列出的所有参考文献,包括以下文献的全部内容通过引用并入本文。
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Claims (29)
1.一种用于治疗癌症的方法,其包括对有此需要的对象施用药用有效量的磷酸奥司他韦和/或其类似物。
2.权利要求1所述的方法,其中治疗癌症包括对有此需要的对象施用药用有效量的磷酸奥司他韦。
3.权利要求1或2所述的方法,其中所述癌症是胰脏癌、乳腺癌、卵巢癌或***癌。
4.权利要求3所述的方法,其中所述癌症是胰脏癌。
5.权利要求1或2所述的方法,其中所述癌症是标准治疗难治的。
6.权利要求1或2所述的方法,其中所述癌症是转移癌。
7.一种用于治疗癌症的方法,其包括:
对有此需要的对象施用治疗有效量的以下物质:
(a)磷酸奥司他韦;和
(b)一种或更多种化学治疗剂;
其中(a)和(b)是同时施用的或以任意顺序依次施用的。
8.权利要求7所述的方法,其中所述化学治疗剂是顺铂、顺氯氨铂、顺-二氨二氯合铂(II)、氟尿嘧啶、吉西他滨、他莫昔芬、培美曲塞或蛋白结合型紫杉醇(ABRAXANE)。
9.权利要求7所述的方法,其中所述癌症是标准治疗难治的。
10.权利要求7所述的方法,其中所述癌症是转移癌。
11.一种用于治疗或预防癌症转移的方法,包括对有此需要的患者施用药用有效量的磷酸奥司他韦和/或其类似物。
12.一种用于治疗癌症的方法,其包括对有此需要的对象施用Neu1唾液酸酶抑制剂。
13.权利要求12所述的方法,其中所述Neu1唾液酸酶抑制剂通过受体信号通路起作用,以抑制癌症所牵涉的一种或更多种生长受体。
14.权利要求13所述的方法,其中所述一种或更多种生长受体是EGFR、胰岛素样受体、VEGF、Tol样受体、Trk A受体或Trk B受体。
15.权利要求12所述的方法,其中所述Neu1唾液酸酶抑制剂是磷酸奥司他韦或其类似物。
16.权利要求15所述的方法,其中所述类似物是根据式A至式F中任一个的化合物,或其盐、溶剂化物、前药、立体异构体、或其同位素标记的形式、或其混合物:
其中,
R1是卤素或COOR6;
R2是OH或OR7;
R3是OH、OR8或N3;
R4是H或C1-6酰基;
R5是OC1-6烷基、SC1-6烷基、OH、SH、卤素、N3、NH2、NHC1-6烷基或NHPG4,或
R4和R5键合以与它们所连接到的原子一起形成唑啉环;
R6是C1-6烷基;
R7与R8是相同或不同的,并独立地是C1-6烷基、C1-6酰基或PG5,或
R7和R8连接以与它们所连接到的氧原子一起形成在氧原子之间的碳上经一个或两个C1-6烷基取代的5元环状缩酮(优选二甲基缩酮或二乙基缩酮);
PG4和PG5独立地是保护基团;
表示单键或双键,和
C1-6烷基和/或C1-6酰基基团中的一个或更多个氢任选地被F取代;
其中
R9是COOR14;
R10是H、OH或OC1-6酰基;
R13是NHC1-6酰基;
或R10中的O与R13中的N通过共价键连接;
R11和R12独立地是C1-6烷基;
R14是C1-6烷基,和
C1-6烷基和/或C1-6酰基基团中的一个或更多个氢任选地被F取代;
其中,
R15是COOEt、COOMe、COOiPr、COOnPr、COOCH2C≡CH、C(O)H、C(O)OH、C(O)O-、CCl3、CN、C≡CH、CH2C≡CH或CH2OH;
R16和R17独立地是H、C1-6烷基、C1-6酰基或合适的保护基团,或R16与R17连接以形成合适的保护基团;和
R18和R19独立地是H、C1-6烷基、C1-6酰基或合适的保护基团,或R18和R19连接以形成合适的保护基团;
其中R15、R16、R17、R18和/或R19中的一个或更多个氢任选地被F取代;
其中,
R15是COOEt、COOMe、COOiPr、COOnPr、COOCH2C≡CH、C(O)H、C(O)OH、C(O)O-、CCl3、CN、C≡CH、CH2C≡CH或CH2OH;
R16和R17独立地是H、C1-6烷基、C1-6酰基或合适的保护基团,或R16和R17连接以形成合适的保护基团;
R18和R19独立地是H、C1-6烷基、C1-6酰基或合适的保护基团,或R18和R19连接以形成合适的保护基团;和
R20是在还原或氢化反应条件下被移除的基团,或R20是合适的对酸不稳定的保护基团,例如R20是OH、R、O-R、O(C)-R、Si(R)3、NO2、NH2、N(R)2、S(O)2R或S(O)2OR,其中各个R独立地是烷基、芳基或杂芳基及其各种经取代的衍生物,
其中R15、R16、R17、R18、R19和/或R20中的一个或更多个氢任选地被F取代;
其中,
X+是阳离子;
R21和R22独立地是H、C1-6烷基或C1-6酰基,或R21与R22连接以与它们所连接到的原子一起形成未经取代的或经一个或更多个卤素或C1-6烷基取代的5元至10元环;
R23和R24独立地是H、C1-6烷基和C1-6酰基;
R25是OR26、NR27R28、=O或=NR29;
R26是H、C1-6烷基或C1-6酰基;
R27和R28独立地是H、C1-6烷基或C1-6酰基;
R29是H、OH、C1-6烷基、OC1-6烷基、C1-6酰基、OC1-6酰基、NH2、NHC1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6酰基)或NHC1-6酰基,或
R29与R23和R24之一形成连接基团“-A-C(O)-”以提供下式的化合物:
其中A是O或NH;和
R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28和/或R29中的一个或更多个可用的氢任选地被F取代;
或
其中,
X+是阳离子;
R30是H、C1-6烷基或C1-6酰基;
R31和R32独立地是F、C1-6烷基或C1-6酰基,或
R31和R32连接以与它们所连接到的原子一起形成未经取代的或经一个或更多个卤素或C1-4烷基取代的5元至10元环;
R33和R34独立地是H、C1-6烷基或C1-6酰基;和
R30、R31、R32、R33和/或R34中的一个或更多个可用的氢任选地被F取代。
17.权利要求16所述的方法,其中所述类似物是式E的化合物,且R25是=NR29。
18.权利要求16所述的方法,其中所述类似物是下式的化合物:
4-乙酰氨基-2-乙氧基-3,5-二羟基-环己烷甲酸钠(A1);
4-乙酰氨基-5-氨基-3-羟基-环己-1-烯甲酸钠(A2);
7-乙酰氨基-4-羟基-2,2-二甲基-3a,4,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A3);
7-乙酰氨基-6-羟基-2,2-二甲基-3a,4,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A4);
7-乙酰氨基-6-羟基亚氨基-2,2-二甲基-3a,6,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A5);或
7-乙酰氨基-6-(1-乙基-丙氧基)-2,2-二甲基-3a,6,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A6)。
19.权利要求12所述的方法,其中所述Neu1唾液酸酶抑制剂是2-脱氧-2,3-二脱氢-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其类似物。
20.权利要求19所述的方法,其中DANA类似物是具有式G的式的化合物:
其中,R50是C1-6烷基,其中所述烷基可以是直链的或带支链的脂肪族基团,或所述烷基可以是环烷基基团。
21.权利要求20所述的方法,其中所述DANA类似物是:
22.权利要求1所述的方法,其中治疗癌症包括对有此需要的对象施用药用有效量的一种或更多种磷酸奥司他韦类似物。
23.权利要求22所述的方法,其中所述方法还包括施用化学治疗剂。
24.权利要求22或23所述的方法,其中所述磷酸奥司他韦类似物是:
4-乙酰氨基-2-乙氧基-3,5-二羟基-环己烷甲酸钠(A1);
4-乙酰氨基-5-氨基-3-羟基-环己-1-烯甲酸钠(A2);
7-乙酰氨基-4-羟基-2,2-二甲基-3a,4,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A3);
7-乙酰氨基-6-羟基-2,2-二甲基-3a,4,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A4);
7-乙酰氨基-6-羟基亚氨基-2,2-二甲基-3a,6,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A5);或
7-乙酰氨基-6-(1-乙基-丙氧基)-2,2-二甲基-3a,6,7,7a-四氢-苯并[1,3]二氧戊环-4-甲酸钠(A6)。
25.一种包含磷酸奥司他韦的药物组合物,其为适合于注射的剂型。
26.权利要求25所述的药物组合物,其还包含化学治疗剂。
27.一种包含磷酸奥司他韦类似物和一种或更多种化学治疗化合物的药物组合物。
28.一种包含磷酸奥司他韦和/或磷酸奥司他韦类似物和治疗癌症的使用说明书的试剂盒。
29.权利要求28所述的试剂盒,其还包含一种或更多种化学治疗剂。
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