CN104330454B - 一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法及其应用，属于生物传感检测技术领域。基于SrTiO3/CoO-WO3复合物作为信标物质，可实现对实体组织目标DNA及其管家基因的定性、定量检测，具有设备简单、成本低、易于微型化的优点。

Description

一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法及其应用，该传感器用于的生物组织DNA的检测，属于生物传感检测技术领域。
背景技术
基因科技与DNA检测是近几年来人们非常热门的话题，随着对基因科技的深入研究，人类基因组计划的完成，人类已经破解了生命的秘码，人类社会发展到今天，基因科技已经逐渐被人们所掌握，并利用来造福于人类自身。基因科技产业就是在这种大背景下应运而生的前沿性的高科技产业。
　美国是全世界最早利用基因检测预测疾病的国家，2005年已有近500万人次接受了检测，通过预知和医学干预，使大肠癌的发病率下降了90%，乳腺癌的发病率下降了70%。中国在基因检测方面相对滞后，截至2006年底才有约10万人次接受了检测。而中国近五年癌症患者高达750万人，不到20年癌症发病率增长了29%以上，每年约有160万人死于癌症。据统计表明，我国因疾病导致的经济损失高达14000亿元。中国基因领域著名科学家毛裕民指出，基因检测是人们为了解基因的个体特征而进行的基因特征的检测，这种检测为人类的一系列生理病理找到了依据和途径。中国有超过10万人进行过基因检测，有超过10万多人的从业队伍，从事着基因检测的工作。这一现状远远不能满足社会的需要，将会有一个大的跨越式的发展。公安及医学上的DNA检测就是基因检测的一种。
生物基因领域众多基因和疾病、基因和健康间的科学发现和成果亟待转化为现实生产力，服务于社会大众。企业参与科技创新，与科技界联手，实现科技成果的转化，共同为国民经济的发展做贡献，已经成为全社会的共识。验证和完善实验室科研成果，并为我国生命科学的深化研究，积聚巨量数据库和大群体样本库，搭建新的技术平台和支撑***。
鉴于此，本专利将利用SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料的信号放大作用，利用体系中光致电信号的强度变化来对真实生物细胞经培养后抽提的DNA目标片段进行检测，并将所研制的光电生物传感器进一步推广到实际应用中，该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，大大克服了目前DNA检测方法局限于纯生物领域的弊端，有效拓展了DNA检测方法的范围。
发明内容
本发明的目的之一是基于组氨酸对DNA的生物特异亲和性及SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料，制备了一种具备特异性，超灵敏的光电生物传感器；
本发明的目的之二是将该传感器用于实体组织抽提的DNA的检测。
本发明的技术方案如下：
1. 一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将1.0 cm×2.5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，纯氮吹干，将其作为工作电极，铂丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.1 V/s扫速，扫描10~15圈，电位范围为-0.8~2.0 V，在含有0.01~0.05 mol/L的L-组氨酸、pH为7.0~9.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-组氨酸，形成一层聚L-组氨酸，真空干燥器中保存；
（2）滴涂20~50 μL的SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料到（1）修饰的工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（3）继续滴涂10~20 μL、5~50 μg/mL的目标DNA的上游引物或10~20 μL、10~20 μg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（4）继续滴涂10~20 μL、5~50 μg/mL的目标DNA的下游引物或10~20 μL、10~20 μg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器。
2. 上述SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料的制备步骤如下：
(1) SrTiO3固体的制备
将3~5 g Ti(OH)4固体粉末，加入到含有0.047~0.189 mol/L的Sr(NO3)2溶液中，真空干燥得固体粉末，将所得固体粉末置于马弗炉中，以5 ℃/min的升温速率升至400~600 ℃，焙烧6~10 h，去离子水冲洗4~8次，过滤，真空干燥，制得SrTiO3固体；
所述的Ti(OH)4固体粉末，是将8~12 g钛酸正丁酯溶于100 mL的无水乙醇中，充分搅拌溶解，逐滴滴加超纯水8~12 mL，5000 r/min离心5~15 min，取沉淀，真空干燥，制得白色的Ti(OH)4固体粉末；
所述的Sr(NO3)2溶液，是将0.1~0.4 g的Sr(NO3)2固体粉末和0.1~0.4 g KOH固体粉末，溶于10 mL的超纯水，制得的0.047~0.189 mol/L的Sr(NO3)2溶液；
(2) SrTiO3/CoO固体的制备
将（1）制得的SrTiO3固体0.3~0.7 g溶于4~8 mL、0.1~0.3 mol/L的Co(NO3)2溶液中，浸渍18~36 h，真空干燥，将所得溶液置于马弗炉，以2~5 ℃/min的速率升温至500 ℃，500 ℃下氧化0.5~2 h，制得SrTiO3/CoO黑色固体粉末；
（3）SrTiO3/CoO凝胶的制备
将（2）制得的0.4~1 g SrTiO3/CoO黑色固体粉末溶于1~3 ml 超纯水中，室温下震荡1~3 h，制得SrTiO3/CoO凝胶；
(4) WO3固体的制备
将4~8 g钨粉，置于坩埚中，在马弗炉内以2 ℃/min的速率升至500 ℃，在500 ℃下煅烧2~4 h，冷却，真空干燥，制得WO3固体；
（5）SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料的制备
将0.3~0.6 g SrTiO3/CoO凝胶和0.1~0.3 g WO3固体溶于1~4 mL的超纯水，室温下震荡18~24 h，制得SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料。
3. 目标DNA及其管家基因的检测步骤
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器为工作电极，在10~50 mL、 pH 7~9的PBS，0.1~0.3 mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1 V，取样间隔 20 s，取样时间20 s，运行时间400 s，光源选择365 nm、385 nm、405 nm、430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm，记录电流变化，绘制工作曲线；
（3）将待测样品代替目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测定。
本发明的有益成果：
（1）L-组氨酸有良好的热稳定性、生物亲和性，本发明中将L-组氨酸进行电聚合，修饰于ITO电极表面，提供了可保持生物活性的固载DNA等生物大分子的方法，同时该方法不需经过预处理，电极选择性、灵敏度和重现性较好，电极响应快，测得线性范围10 pmol/L~ 30 nmol/L，检测限为5.4 pmol/L。
（2）本发明使用SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料，做为光电信标物质，，利用能带匹配的特性使得SrTiO3、CoO 、WO3三者的光电特性均有大幅度增强，大大提高了本发明所述传感器的光电性能。
（3）本发明所检测DNA均从实际生物肿瘤组织中提取，具有一定的实用价值。
具体实施方式：
为进一步说明，结合一下实施例具体说明：
实施例1 一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法
（1）将1.0 cm×2.5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，纯氮吹干，将其作为工作电极，铂丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.1 V/s扫速，扫描10圈，电位范围为-0.8~2.0 V，在含有0.01 mol/L的L-组氨酸、pH为7.4的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-组氨酸，形成一层聚L-组氨酸，真空干燥器中保存；
（2）滴涂20 μL的SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料到（1）修饰的工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干
（3）继续滴涂10 μL、5 μg/mL的目标DNA的上游引物或10 μL、10 μg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（4）继续滴涂10 μL、5 μg/mL的目标DNA的下游引物或10 μL、10 μg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器。
实施例2 一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法
（1）将1.0 cm×2.5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，纯氮吹干，将其作为工作电极，铂丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.1 V/s扫速，扫描12圈，电位范围为-0.8~2.0 V，在含有0.03 mol/L的L-组氨酸、pH为8.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-组氨酸，形成一层聚L-组氨酸，真空干燥器中保存；
（2）滴涂30 μL的SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料到（1）修饰的工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（3）继续滴涂15 μL、25 μg/mL的目标DNA的上游引物或15 μL、15 μg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（4）继续滴涂15μL、25μg/mL的目标DNA的下游引物或15 μL、15μg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面， 4 ℃冰箱中晾干，制得一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器。
实施例3 一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法
（1）将1.0 cm×2.5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，纯氮吹干，将其作为工作电极，铂丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.1 V/s扫速，扫描15圈，电位范围为-0.8~2.0 V，在含有0.05 mol/L的L-组氨酸、pH为9.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-组氨酸，形成一层聚L-组氨酸，真空干燥器中保存；
（2）滴涂50 μL的SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料到（1）修饰的工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（3）继续滴涂20 μL、50 μg/mL的目标DNA的上游引物或20 μL、20 μg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（4）继续滴涂20 μL、50 μg/mL的目标DNA的下游引物或20 μL、20 μg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器。
实施例4 SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料的制备
 (1) SrTiO3固体的制备
将3 g Ti(OH)4固体粉末，加入到含有0.047mol/L的Sr(NO3)2溶液中，真空干燥得固体粉末，将所得固体粉末置于马弗炉中，以5 ℃/min的升温速率升至400 ℃，焙烧6 h，去离子水冲洗4次，过滤，真空干燥，制得SrTiO3固体；
所述的Ti(OH)4固体粉末，是将8 g钛酸正丁酯溶于100 mL的无水乙醇中，充分搅拌溶解，逐滴滴加超纯水8 mL，5000 r/min离心5 min，取沉淀，真空干燥，制得白色的Ti(OH)4固体粉末；
所述的Sr(NO3)2溶液，是将0.1 g的Sr(NO3)2固体粉末和0.1 KOH固体粉末，溶于10 mL的超纯水，制得的0.047 mol/L的Sr(NO3)2溶液；
(2) SrTiO3/CoO固体的制备
将（1）制得的SrTiO3固体0.3 g溶于4 mL、0.1 mol/L的Co(NO3)2溶液中，浸渍18 h，真空干燥，将所得溶液置于马弗炉，以2 ℃/min的速率升温至500 ℃，500 ℃下氧化0.5 h，制得SrTiO3/CoO黑色固体粉末；
（3）SrTiO3/CoO凝胶的制备
将（2）制得的0.4 g SrTiO3/CoO黑色固体粉末溶于1 ml 超纯水中，室温下震荡1 h，制得SrTiO3/CoO凝胶；
(4) WO3固体的制备
将4 g钨粉，置于坩埚中，在马弗炉内以2 ℃/min的速率升至500 ℃，在500 ℃下煅烧2 h，冷却，真空干燥，制得WO3固体；
（5）SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料的制备
将0.3 g SrTiO3/CoO凝胶和0.1 g WO3固体溶于1mL的超纯水，室温下震荡18 h，制得SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料。
实施例5 SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料的制备
(1) SrTiO3固体的制备
将4 g Ti(OH)4固体粉末，加入到含有0.1 mol/L的Sr(NO3)2溶液中，真空干燥得固体粉末，将所得固体粉末置于马弗炉中，以5 ℃/min的升温速率升至500 ℃，焙烧8 h，去离子水冲洗6次，过滤，真空干燥，制得SrTiO3固体；
所述的Ti(OH)4固体粉末，是将10 g钛酸正丁酯溶于100 mL的无水乙醇中，充分搅拌溶解，逐滴滴加超纯水10 mL，5000 r/min离心10 min，取沉淀，真空干燥，制得白色的Ti(OH)4固体粉末；
所述的Sr(NO3)2溶液，是将0.21 g的Sr(NO3)2固体粉末和0.2 g KOH固体粉末，溶于10 mL的超纯水，制得的0.1 mol/L的Sr(NO3)2溶液；
(2) SrTiO3/CoO固体的制备
将（1）制得的SrTiO 固体0.5 g溶于7 mL、0.2 mol/L的Co(NO3)2溶液中，浸渍24 h，真空干燥，将所得溶液置于马弗炉，以3 ℃/min的速率升温至500 ℃，500 ℃下氧化1 h，制得SrTiO3/CoO黑色固体粉末；
（3）SrTiO3/CoO凝胶的制备
将（2）制得的0.8 g SrTiO3/CoO黑色固体粉末溶于2 ml 超纯水中，室温下震荡2 h，制得SrTiO3/CoO凝胶；
(4) WO3固体的制备
将6 g钨粉，置于坩埚中，在马弗炉内以2 ℃/min的速率升至500 ℃，在500 ℃下煅烧3 h，冷却，真空干燥，制得WO3固体；
（5）SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料的制备
将0.4 g SrTiO3/CoO凝胶和0.2 g WO3固体溶于2 mL的超纯水，室温下震荡20 h，制得SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料。
实施例6 SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料的制备
(1) SrTiO3固体的制备
将5 g Ti(OH)4固体粉末，加入到含有0.189 mol/L的Sr(NO3)2溶液中，真空干燥得固体粉末，将所得固体粉末置于马弗炉中，以5 ℃/min的升温速率升至600 ℃，焙烧10 h，去离子水冲洗8次，过滤，真空干燥，制得SrTiO3固体；
所述的Ti(OH)4固体粉末，是将12 g钛酸正丁酯溶于100 mL的无水乙醇中，充分搅拌溶解，逐滴滴加超纯水12 mL，5000 r/min离心15 min，取沉淀，真空干燥，制得白色的Ti(OH)4固体粉末；
所述的Sr(NO3)2溶液，是将0.4 g的Sr(NO3)2固体粉末和0.4 g KOH固体粉末，溶于10 mL的超纯水，制得的0.189 mol/L的Sr(NO3)2溶液；
(2) SrTiO3/CoO固体的制备
将（1）制得的SrTiO3固体0.7 g溶于8 mL、0.3 mol/L的Co(NO3)2溶液中，浸渍36 h，真空干燥，将所得溶液置于马弗炉，以5 ℃/min的速率升温至500 ℃，500 ℃下氧化2 h，制得SrTiO3/CoO黑色固体粉末；
（3）SrTiO3/CoO凝胶的制备
将（2）制得的1g SrTiO3/CoO黑色固体粉末溶于3 ml 超纯水中，室温下震荡3 h，制得SrTiO3/CoO凝胶；
(4) WO3固体的制备
将8 g钨粉，置于坩埚中，在马弗炉内以2 ℃/min的速率升至500 ℃，在500 ℃下煅烧4 h，冷却，真空干燥，制得WO3固体；
（5）SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料的制备
将0.6 g SrTiO3/CoO凝胶和0.3 g WO固体溶于4 mL的超纯水，室温下震荡24 h，制得SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料。
实施例7目标DNA的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器为工作电极，在10 mL、 pH 7的PBS，0.1mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对目标DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1 V，取样间隔 20 s，取样时间20 s，运行时间400 s，光源选择365 nm、385 nm、405 nm、430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm，记录电流变化，绘制工作曲线；
（3）将待测样品代替目标DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测定；
（4）线性范围10 pmol/L~ 30 nmol/L，检测限为5.4 pmol/L。
实施例8管家基因的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器为工作电极，在50 mL、 pH 9的PBS，0.3 mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1 V，取样间隔 20 s，取样时间20 s，运行时间400 s，光源选择365 nm、385 nm、405 nm、430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm，记录电流变化，绘制工作曲线。

Claims (3)

1.一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将1.0 cm×2.5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，纯氮吹干，将其作为工作电极，铂丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.1 V/s扫速，扫描10~15圈，电位范围为-0.8~2.0 V，在含有0.01~0.05 mol/L的L-组氨酸、pH为7.0~9.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-组氨酸，形成一层聚L-组氨酸，真空干燥器中保存；
（2）滴涂20~50μL的SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料到（1）修饰的工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（3） 继续滴涂10~20 μL、5~50 μg/mL的目标DNA的上游引物或10~20 μL、10~20 μg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（4） 继续滴涂10~20 μL、5~50 μg/mL的目标DNA的下游引物或10~20 μL、10~20 μg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器。
2.如权利要求1所述的一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法，其中，所述SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料的制备步骤如下：
(1) SrTiO3固体的制备
将3~5 g Ti(OH)4固体粉末，加入到含有0.047~0.189 mol/L的Sr(NO3)2溶液中，真空干燥得固体粉末，将所得固体粉末置于马弗炉中，以5℃/min的升温速率升至400~600℃，焙烧6~10 h，去离子水冲洗4~8次，过滤，真空干燥，制得SrTiO3固体；
所述的Ti(OH)4固体粉末，是将8~12 g钛酸正丁酯溶于100 mL的无水乙醇中，充分搅拌溶解，逐滴滴加超纯水8~12 mL，5000 r/min离心5~15min，取沉淀，真空干燥，制得白色的Ti(OH)4固体粉末；
所述的Sr(NO3)2溶液，是将0.1~0.4 g的Sr(NO3)2固体粉末和0.1~0.4 g KOH固体粉末，溶于10 mL的超纯水，制得的0.047~0.189 mol/L的Sr(NO3)2溶液；
(2) SrTiO3/CoO3固体的制备
将（1）制得的SrTiO3固体0.3~0.7 g溶于4~8 mL、0.1~0.3 mol/L的Co(NO3)2溶液中，浸渍18~36 h，真空干燥，将所得溶液置于马弗炉，以2~5 ℃/min的速率升温至500 ℃，500 ℃下氧化0.5~2 h，制得SrTiO3/CoO黑色固体粉末；
（3）SrTiO3/CoO凝胶的制备
将（2）制得的0.4~1 g SrTiO3/CoO黑色固体粉末溶于1~3 ml 超纯水中，室温下震荡1~3 h，制得SrTiO3/CoO凝胶；
(4) WO3固体的制备
将4~8 g钨粉，置于坩埚中，在马弗炉内以2 ℃/min的速率升至500 ℃，在500 ℃下煅烧2~4 h，冷却，真空干燥，制得WO3固体；
（5）SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料的制备
将0.3~0.6 g SrTiO3/CoO凝胶和0.1~0.3 g WO3固体溶于1~4 mL的超纯水，室温下震荡18~24 h，制得SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料。
3.如权利要求1的制备方法制备的一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器用于目标DNA及其管家基因的检测，其特征在于：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器为工作电极，在10~50 mL、 pH 7~9的PBS，0.1~0.3 mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1 V，取样间隔 20 s，取样时间20 s，运行时间400 s，光源选择365 nm、385 nm、405 nm、430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm，记录电流变化，绘制工作曲线；
（3）将待测样品代替目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测定。
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