CN104327194A - 在具自由羟基多糖类化合物引入醛基的温和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了在具自由羟基的多糖类化合物引入醛基的方法，包括将具自由羟基的多糖类化合物溶解于水性溶剂中，加入酰胺化反应催化剂和1-氨基-3，3二乙氧基丙烷，反应；将反应产物沉淀，纯化、干燥，得到中间产物；将中间产物溶解，醛化，得到带有醛基的多糖类化合物。本发明方法，反应条件温和，不会破坏多糖的原始结构，可以高效地在具自由羟基多糖类化合物上引入醛基，得到改性多糖类化合物，改性多糖类化合物可以通过希夫碱与其他高分子材料在温和条件下反应，共价交联形成水凝胶，具有非常广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种多糖的修饰方法，特别涉及一种在具有自由羟基的多糖类化合物上引入醛基的温和方法。
背景技术
老年性关节病、关节内疾病及关节损伤常致关节软骨退变或缺损，常导致关节疼痛及关节功能的丧失。由于没有血管及神经支配，软骨组织自我修复功能差。由于软骨细胞的缺乏，软骨基质形成的能力有限，所以软骨组织再生困难。在没有特别处理治疗的情况下，软骨缺损常常由纤维软骨组织来修复，而这种软骨的功能与透明软骨的功能是差别挺大的。由于组织工程的理念的应用，目前合成的生物组织工程材料致力于修复组织损伤及缺损，并改善组织功能。近上来，各种各样的生物相容性生物材料被用于软骨缺损修复，并且应用干细胞与生物材料相结合促进软骨生成。当把干细胞种植于3D环境时，细胞活性得以很好的保持。而当细胞脱离3D环境时，它们将快速去分化，丧失细胞表型及蛋白合成功能。合成的水凝胶是具有特定的组织化学特性的组织工程生物学支架，可以作为一个研究干细胞分化，细胞间的相互关系及细胞与基质间关系的好的模型。
在软骨修复过程中，应用非侵入性方法将干细胞及活性分子置入于软骨缺损是非常受欢迎的。可注射性水凝胶，因为其能形成各种不同形状而适用于各种不规则软骨缺损，可以将各种需要成份移植于需要部位，而不需要开放手术。同时水凝胶可塑性强，并且应用方便，可以在微创的情况下用于充填不同类型的软骨缺损。水凝胶能维持细胞原始的圆形形状，包裹细胞，传递生物机械负荷，他们拥有孔隙结构，有利于营养及废弃物的转运。
天然多糖的安全性高，通过对其改性，将其中的部分羟基转化为醛基，可以与其他的天然改性材料在体内的温和条件下，发生化学交联，形成稳定性较好的水溶胶。如MA实验组发明了可注射性中空纳米纤维星形球状PLA聚合物作为软骨细胞载体用修复软骨缺损，并取得良好效果。MIkos 及他的同事应用低聚的聚乙二醇延胡索酸盐作为骨架以提供一3D可注射的水凝胶网状支架结构以载荷干细胞及生长因子用于软骨重建修复。Tan等应用希夫碱结构于氧化透明质酸的醛基上及N-琥珀酰壳聚糖的氨基上以构建原位水凝胶，并在体外检测了软骨细胞在水凝胶内的情况。
然而现有技术中，对多糖的改性过程中需要将其羟基端氧化以形成醛基，改性过程中需要使用强氧化剂，如高碘酸等。强氧化剂的使用，会破坏多糖的原始结构，导致多糖的活性发生变化，生成不需要的杂质，这限制了其应用。
开发出一种不破坏多糖原始结构的改性方面，在多糖中引入醛基具有非常实际的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在具有自由羟基多糖中引入醛基的方法。
本发明所采取的技术方案是：
在具自由羟基的多糖类化合物引入醛基的方法，包括如下步骤：
1) 将具自由羟基的多糖类化合物溶解于水性溶剂中，加入酰胺化反应催化剂和1-氨基-3，3二乙氧基丙烷，调节反应体系的pH，搅拌使其反应完全；
2) 将反应产物沉淀，纯化、干燥，得到中间产物；
3) 将中间产物溶解，调节其pH至5～7.4，醛化，得到带有醛基的多糖类化合物。
优选的，上述方法中，步骤1）中调节反应体系的pH为4～7.4。
优选的，上述方法中，步骤1）中使用的水性溶剂选自水性pH缓冲液。
优选的，上述方法中，1-氨基-3，3二乙氧基丙烷与多糖类化合物中的-COOH或-COO-的摩尔比为0.1～10：1。
优选的，上述方法中，酰胺化反应催化剂为EDC和NHS的混合物。
优选的，上述方法中，EDC和NHS摩尔比为0.1～10：1。
优选的，上述方法中，使用水性pH缓冲液将中间产物溶解。
优选的，上述方法中，步骤1）中使用的水性pH缓冲液选自D-PBS溶液、Tris-HCl缓冲液或者有机盐缓冲液。
优选的，上述方法中，步骤3）中使用的水性pH缓冲液选自PBS溶液、Tris-HCl缓冲液、有机盐缓冲液。
优选的，上述方法中，具自由羟基的多糖类化合物选自海藻酸盐。
本发明的有益效果是：
本发明方法，反应条件温和，不会破坏多糖的原始结构，可以高效地在具自由羟基多糖类化合物上引入醛基，得到改性多糖类化合物，改性多糖类化合物可以通过希夫碱与其他高分子材料在温和条件下反应，共价交联形成水凝胶，具有非常广泛的应用价值。
附图说明
图1是AALG-CS水凝胶的形成前后的照片；
图2是AALG-CS水凝胶的SEM照片；
图3是不同化合物的红外光谱图；
图4是AALG-CS 水凝胶的流变学特性图；
图5是细胞在水凝胶上的活性检测结果图；
图6是软骨相关基因表达情况；
图7是不同处理组实验兔的软骨再生情况；
图8是软骨的肉眼ICRS评分情况图；
图9是不同处理组软骨的HE染色图；
图10是不同处理组软骨的阿利氏蓝染色图；
图11是不同处理组软骨的甲苯胺蓝染色图；
图12是不同处理组软骨的Masson染色图；
图13是不同处理组动物实验12周后的软骨相关基因表达情况；
图14是不同处理组动物实验12周后的GAGs定量检测情况。
具体实施方式
在本发明中，具有自由羟基的多糖类化合物指糖链上具有羧基或-COO-基团的多糖或其衍生物，如海藻酸钠及其衍生的酯类及氨类化合物等。
EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的简称写；NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的简称；ADEP为1-氨基-3，3二乙氧基丙烷的简称。
在具自由羟基的多糖类化合物引入醛基的方法，包括如下步骤：
1) 将具自由羟基的多糖类化合物溶解于水性溶剂中，加入酰胺化反应催化剂和1-氨基-3，3二乙氧基丙烷，调节反应体系的pH，搅拌使其反应完全；
2) 将反应产物沉淀，纯化、干燥，得到中间产物；
3) 将中间产物溶解，调节其pH至5～7.4，醛化，得到带有醛基的多糖类化合物。
在具有自由羟基的多糖类化合物引入醛基的反应原理如下：
式中，代表具有自由羟基的多糖类化合物的主体部分。
具自由羟基的多糖类化合物上的-COO-基团在催化剂的作用下被活化，之后与1-氨基-3，3二乙氧基丙烷发生酰胺化反应，得到的产物在酸的作用下醛化。
-COO-活化剂可以是EDC和NHS，EDC可以和多糖类化合物上的-COO-基团反应形成酰胺类活性中间产物，NHS进一步将酰胺类活性中间产物活化成为活化酯，转换出替换出EDC的氨基，活化酯接着与1-氨基-3，3二乙氧基丙烷发生氨基-羧基反应。EDC可以先于NHS加入，也可以同时加入，EDC与NHS的摩尔比可以根据反应的需要进行相应的调整。如EDC、NHS的活化反应及1-氨基-3，3二乙氧基丙烷与活化酯的氨基-羧基反应的pH优选为4～7.5，也可以根据反应需要，分段调节pH，如先将溶剂的pH调节为4～6，加速-COO-基团的活化，之后再调整pH至5～7.4，使活化酯与1-氨基-3，3二乙氧基丙烷的氨基-羧基反应。
优选的，上述方法中，酰胺化反应催化剂为EDC和NHS的混合物。
优选的，上述方法中，步骤1）中调节反应体系的pH为4～7.4。
优选的，上述方法中，步骤1）中使用的水性溶剂选自水性pH缓冲液。
优选的，上述方法中，1-氨基-3，3二乙氧基丙烷与多糖类化合物中的-COOH或-COO-的摩尔比为（0.1～10）：1，优选为（1～10）：1，更佳为（3～10）：1，（5～10）：1
优选的，上述方法中，EDC和NHS摩尔比为0.1～10：1，其使用量可以根据需要进行调整。
为更好地稳定反应体系的pH，使反应在温和条件下进行，优选使用水性pH缓冲液作为反应溶剂。为更好地调节反应体系的pH，同时不破坏多糖的原有结构，在调低pH时，优选使用非氧化性的无机强酸，如盐酸、硫酸。
优选的，上述方法中，使用水性pH缓冲液将中间产物溶解。
优选的，上述方法中，步骤1）中使用的水性pH缓冲液选自D-PBS溶液、Tris-HCl缓冲液或者有机盐缓冲液。
优选的，上述方法中，步骤3）中使用的水性pH缓冲液选自PBS溶液、Tris-HCl缓冲液、有机盐缓冲液。
优选的，上述方法中，具自由羟基的多糖类化合物选自海藻酸盐。
为了保证多糖类化合物可以更为完全地反应，同时简化后续的纯化操作，1-氨基-3，3二乙氧基丙烷宜过量加入。
反应生成的中间产物可以通过透析、沉淀后洗涤等方式，去除未反应的小分子。中间产物的沉淀可以参照相应糖的沉淀操作，如使用丙酮沉淀。
正面结合具体实施例，进一步说明本发明的技术方案。
实施例1 海藻酸钠的改性
1) 海藻酸钠溶于0.1mol PH 7.4 DPBS中，浓度为50mg/ml，在磁力的水凝胶搅拌过程中，EDC、NHS以相同的摩尔比例与海藻酸钠同时加入，搅拌反应，活化海藻酸钠的羧基；
2) 在反应液中加入与海藻酸钠相同摩尔比例的1-氨基-3，3二乙氧基丙烷以，搅拌反应24h；
3) 在反应液中加入丙酮，将中间产物（ALG-ADEP）沉淀，将沉淀用去离子水洗涤纯化；
4) 将纯化后的中间产物溶解于PBS溶液中，使用盐酸调节溶液的pH至5，反应24 h，得到引入醛基的改性海藻酸钠（AALG-ADEP）。
水凝胶的合成
1) 取实施例1制得的改性海藻酸钠溶解在溶剂中（pH约为7.4的D-PBS溶液）中，改性海藻酸钠的浓度为100mg/ml；
2) 取壳聚糖粉末溶解于10%（质量百分浓度）的醋酸溶液中，壳聚糖的浓度为25mg/ml；
3) 将改性海藻酸钠溶液和壳聚糖溶液按4：1的体积比混合，调节反应体系的pH为7.4，37℃水浴30 min，得到水凝胶，记为AALG-CS水凝胶。
AALG-CS水凝胶的形成前后结果如图1所示，从图中可以看出，AALG可以快速和CS反应生成水凝胶，得到的AALG-CS水凝胶具有较好的强度，可以稳定存在于倒立的试管中而不掉落。
AALG-CS水凝胶的横切片应用电镜扫描检测，SEM (Cambridge Stereoscan 120) ，加速电压为10kV. 水凝胶应用液氮处理，然后冷冻干燥处理2天，然后样本固定于硅胶板上，喷金及SEM检测。AALG-CS水凝胶的扫描电镜照片如图2所示，从图中可以看出，AALG-CS水凝胶内部具有均匀分布的孔隙。
结构特征分析：
分别取改性前的海藻酸钠（ALG）、ADEP、CS、ALG-ADEP、AALG-ADEP和AALG-CS进红外光谱检测，红外光谱检测采用20%透明度应用红外光谱测量仪（Nicolet Avtar 360, USA）， 样本压成溴化钾片，所有的检测在空白背影及室温下进行。红外光谱图如图3所示。海藻酸盐及壳聚糖的光谱显示出多糖结构的吸收峰，1320 cm-1 (C-O stretching), 1130 cm-1 (C-C stretching), 1020 cm-1 (C-O-C stretching), and 950 cm-1 (C-O stretching). 而在3450 cm-1这个长而宽的吸收峰是多糖羧基的振幅。1621 and 1420 cm-1是藻沅酸盐的羧酸盐基产生的。醛基的存在常显示在1738 cm-1的峰，AALG-CS红外光谱中未显示此吸收峰，因为两个醛基形成半缩醛，显示壳聚糖的氨基与AALG-ADEP的醛基的希夫碱反应。另外新形成的C=N基团在1670 cm-1形成峰，显示了AALG-CS希夫碱反应成胶。
AALG-CS水凝胶流变学分析
AALG-CS的流变学检测通过流变仪上的粘弹性测试试验来完成AR 2000 Rheometer (TA Instruments, UK)。在试验进行中测量存储模量G’及丢失模量G’’数据。所有试验在室温下进行。
通过测量AALG-CS水凝胶的机械反应，在振动拉力变形的情况下获取水凝胶的粘弹性及流变学特点的量变信息，如图4所示。在成胶开始，G’ 比 G”小（图4A），在成胶过程中，G’ 与G”同时增加，但G’ 增加速度明显比G”快，主要是因为希夫碱反应形成链的原因。这个不同的增长率形成了成胶点，成胶点后，G’ 比G”大。
AALG-CS的流变学性能通过动态振动流变仪检测，G’ and G” 在低应变振幅情况下，检测模量与频率之间关系。如图4B所示，AALG-CS的存储模量G’在频率检测范围内显示出清晰的平台期，并且与相应的损失模量G”相比明显高。
细胞活性与细胞增殖能力检测
BMSCs来自1.5个月大的新西南大白兔。于股骨上段用培养基抽吸及冲洗肝素化骨髓，于800 rpm 离心10min。然后将收集的细胞种植于75cm2的细胞培养瓶中，加入常规培养基进行细胞培养，每隔两天换液一次。当细胞密度达80%时细胞以后1：3比例传代。
修饰的藻沅酸盐、壳聚糖各100 μL分别滴在盖玻片上，玻片合起后形成水凝胶。水凝胶合成后浸泡在PBS中，去除盖玻片，然后高浓度细胞（106）滴在胶上，在孵箱内放置20分钟，让细胞进入胶表面及胶内。最后加入2ml培养基放回孵箱进行培养。
细胞活性检测应用Live/dead 试剂盒，成胶后，胶上种植BMSCs(如上述)。细胞种植两天后，进行Live/dead染色。
应用CCK-8实剂盒进行细胞增殖检测。细胞种植于等体积大小的胶上（96孔板孔大小，高度约为2mm），细胞种植密度为104/孔，以培养基及培养基-水凝胶组作为对照组。相同条件下培养。在不同的时间点6h, 12h, 24h, 48h, 72h 在450nm波长下分别检测各组吸光明度（n=3）。
将骨髓间充质干细胞种植于AALG-CS水凝胶上2天后，通过活死染色来鉴定细胞活死情况。显示细胞在水凝胶内均匀分布，如图5A所示，绿色细胞占绝大多数，红色细胞很少，说明细胞在水晶凝胶上活性可。细胞增殖实验采用CCK-8试剂盒进行检测，检测6小时，12小时，1，2，3，7天（n=3）细胞的活性情况。结果如图5B所示。显示细胞种植在水凝胶上对细胞活性没有明显影响。
相应体外实验软骨分化的基因表达
水凝胶3D培养***与细胞团培养***相比较，本实验设计分为以下四组：第一组，106细胞（四代）的细胞团培养于500μl的普通培养基里；第二组，106的细胞种植于水凝胶里面，培养于普通培养基里；第三组，106细胞的细胞团培养于500μl的成软骨诱导培养基里；第四组，106的细胞种植于水凝胶表面，培养于成软骨诱导培养基里。每两天更换培养基，各组的样本在（1周，2周，3周，4周）四个不同的时间点进行相应的检测。
应用RT-qPCR检测BMSCs在AALG-CS水凝胶上的软骨分化情况。SOX-9在软骨分化，软骨特殊基因上调及软骨形成过程非常重要。它可以作为早期干细胞向软骨细胞分化的重要指示标志。Aggrecan（聚蛋白聚糖）, II型胶原，glycosminoglycans (GAGs)是透明软骨中最基本，具有特征性的成份，而且在软骨细胞与软骨细胞，软骨细胞与软骨基质相互关系中，发挥着非常重要的作用。他们作为软骨修复再生及骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的重要标志物。Aggrecan（聚蛋白聚糖）是一种硫酸软骨素蛋白多糖，在透明软骨中聚集存在，可以调整水的平衡，构建一个Aggrecan（聚蛋白聚糖）与II型胶原网络结构以防止软骨的变形。
在本实验中，在四个不同的组别中检测了Aggrecan（聚蛋白聚糖）, II型胶原，SOX-9三个基因在不同时间点（1，2，3，4周）表达情况。如图6所示，与组1（细胞组）相比，第四组（细胞+水凝胶+成骨诱导培养基组）Aggrecan（聚蛋白聚糖）, II型胶原，SOX-9三个基因的表达明显高于第1组。第2组（细胞+水凝胶组）其成软骨相关基因的表达明显高于第1组。第1周，第4组以上三基因表达明显高于第2组(p<0.05)。AALG-CS水凝胶同时提供了一个好的支架以促进BMSCs软骨分化。BMSCs具有自我更新，高增殖性，多样性分化。在我们研究中，II型胶原、聚集蛋白聚糖有随时间增加的趋势，说明骨髓间充质干细胞在第2组、第3组、第4组具有软骨分化能力，说明3D水凝胶***与软骨诱导成份对软骨分化都很重要。如果比较第2，3组，结果示3D水凝胶的环境对骨髓间充质干细胞的软骨分化是非常重要，同时软骨诱导培养基对于骨髓间充质干细胞的软骨分化是非必要的。
软骨修复的大体及组织学评估
36只新西南大白兔标准备环境及饲料饲养，术前实验室动物中心养两周，所以动物实验都依据南方医科大学伦理委员会管理标准执行。动物实验部分分为四组，分别如下：第一组，正常组，无任何处理；第二组，缺损组，于兔股骨远端关节间隙造骨缺损；第三组，水凝胶处理组，软骨缺损处应用水凝胶进行处理；第四组，BMSCs载荷的水凝胶组，细胞水凝胶置于软骨缺损处。
详细步骤：麻醉满意后，取膑旁正中切口，将髌骨翻向一侧，显露膝关节，以磨钻在股骨远端关节面间隙正中造一直径5mm,深2mm 的软骨缺损（包含软骨全层及软骨下骨），BMSCs(1.6×106, passage 4)重悬于50ul培养基中，加入水凝胶内，培养两天后BMSCs载荷的水凝胶种植于骨缺损处。术后12周样本取材。
应用国际软骨修复协会组织切片评分***评价软骨缺损修复的大体情况。这个评分项目有11个评价指标分别为：组织外形，基质染色，结构完整度，完整构造情况，潮线，骨形成情况，表面构造的组织学评价，缺损修复的组织学评价，缺损周围完整度，基底部完整度，感染有无。总分从11-45分不等。
所有的实验兔均活着，没有显示明显的免疫学及感染并发症。骨髓间充质干细胞载荷水凝胶组的再生的软骨外形及轮廓示再生组织白亮与本身的软骨组织近似，缺损被再生组织完全填充，并且与周围组织交接处愈合良好（图7D）。水凝胶组比细胞载荷水凝胶组再生活组织相对要薄，中心部有凹陷，交接处没有细胞载荷水凝胶组平滑（图7C），同时在中心部位仍有一黄色的小缺损，显示软骨缺损。在缺损组中，再生组织非常少，中心部位有一明显大的缺损区。综上述，骨髓间充质干细胞载荷的水凝胶与水凝胶组产生了更多的透明软骨样组织，能够很好的修复软骨缺损，尤其是前者效果好。
应用ICRS组织学评分进一步评价组织修复的情况（表3）。细胞载荷的水凝胶组38.37±0.97，水凝胶组评分为32.50±1.25，均明显高于缺损组的22.83±2.07。同时细胞载荷水凝胶组亦明显高于水凝胶组（如图8所示）。
HE染色显示了细胞载荷水凝胶组与水凝胶组在缺损区域有更多的软骨细胞样细胞（如图9），细胞载荷水凝胶组与水凝胶组在组织再生上与正常组相近，再生组织均染，纤维组织的密度低，高比例的均质红染的透明软骨细胞外基质。而在缺损组，一些新的纤维性组织形成。
阿利氏蓝染色主要是显示proteoglycans (PGNs)的染色，而PGNs是透明软骨的特征性标记物。细胞载荷的水凝胶组再生组织较厚且深染，有较多的软骨细胞样细胞，并且在细胞周围有深染的陷窝（图10）。而水凝胶组形成的再生组织较前者薄。而缺损组示薄而且淡染的组织。结果显示此水凝胶能促进PGNs生成，促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。甲苯胺蓝染色亦是PGNs的特殊染色，显示新生的透明软骨，所得结果与阿利氏蓝染色相近，在细胞载荷的水凝胶组与水凝胶组，与缺损组相比，增生组织更厚，染色更深，有更多的细胞在增生组织中（图11）。
Masson 染色主要显示了胶原的分布情况，I, III型胶原是纤维软骨与纤维***的特征性物质，并且在masson染色下显示蓝色或淡绿色。如图12所示，骨髓间充质干细胞载荷的水凝胶组在软骨再生区域可见更多的软骨细胞样细胞生成，主要增生的区域显示染成红色。缺损组及水凝胶组示主要增生区域被染成蓝色及绿色，显示主要为I及III型胶原分泌。这结果与体外RT-qPCR结果趋势相近。
动物实验部分软骨相关基因表达
Aggrecan（聚蛋白聚糖）, II型胶原 及GAGs是透明软骨最基本重要的成份，透明软骨对关节功能尤其是膝关节功能相当重要。I型胶原是纤维软骨及纤维***形成过程中特殊基因。
为了评估软骨形成，成软骨基因表达如Aggrecan（聚蛋白聚糖）, II型胶原，I型胶原， 及GAGs，PGNs及SOX9基因应用RT-qPCR被检测分析。动物实验12周后，软骨再生组织被提取，如图13所示第4组（骨髓间充质干细胞载荷的水凝胶组）与缺损组相比因表达明显高，Aggrecan高5.8倍，PGNs 高 5.3倍, SOX-9 高17.9倍。与水凝胶组相比，Aggrecan高1.4倍，II型胶原高0.5倍，PGNs 高 1.3倍, SOX-9 高1.2倍。但是I型胶原基因表达在骨髓间充质干细胞载荷的水凝胶组明显低于缺损组5倍。以上第4组Aggrecan（聚蛋白聚糖）, II型胶原 及GAGs基因表达明显比其他组高示骨髓间充质干细胞在水凝胶支架促软骨分化中起着重要作用。在缺损组中，I型胶原的高表达示丰富的纤维组织形成，与组织学分析结果相同。本研究结果表明，AALG-CS水凝胶可以为骨髓间充质干细胞提供一个好的3D微环境。
表达水平检测
动物实验术后12周，再生的软骨组织进行GAGs定量检测，所有检测过程及处理按照提取的标准程序进行。结果显示骨髓间充质干细胞载荷的水凝胶组GAGs表达量最高，而缺损组最低（如图14）。作为透明软骨的主要成份，骨髓间充质干细胞载荷的水凝胶组及水凝胶组GAGs表达水平明显高，显示AALG-CS 水凝胶是软骨组织再生理想的3D支架材料，当加入骨髓间充质干细胞的一，其可以促进骨髓间充质干细胞软骨细胞分化并形成更多的GAGs。
综上，本发明方法制备得到改性多糖类化合物，可以壳聚糖反应形成可注射水凝胶AALG-CS，通过体内体外的软骨相应成软骨指标的检测骨髓间充质干细胞与水凝胶修复软骨的作用，结果显示骨髓间充质干细胞载荷的水凝胶能促进骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化，促进透明软骨形成，上调PGNs, aggrecan， II型胶原，SOX9的表达，对软骨的修复具有极好的促进作用。
Claims (10)
1.在具自由羟基的多糖类化合物引入醛基的方法，包括如下步骤：
1）将具自由羟基的多糖类化合物溶解于水性溶剂中，加入酰胺化反应催化剂和1-氨基-3，3二乙氧基丙烷，调节反应体系的pH，搅拌使其反应完全；
2）将反应产物沉淀，纯化、干燥，得到中间产物；
3）将中间产物溶解，调节其pH至5～7.4，醛化，得到带有醛基的多糖类化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中调节反应体系的pH为4～7.4。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中使用的水性溶剂选自水性pH缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：1-氨基-3，3二乙氧基丙烷与多糖类化合物中的-COOH或-COO-的摩尔比为0.1～10：1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：酰胺化反应催化剂为EDC和NHS的混合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：EDC和NHS摩尔比为0.1～10：1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：使用水性pH缓冲液将中间产物溶解。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤1）中使用的水性pH缓冲液选自D-PBS溶液、Tris-HCl缓冲液或者有机盐缓冲液。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤3）中使用的水性pH缓冲液选自PBS溶液、Tris-HCl缓冲液、有机盐缓冲液。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：具自由羟基的多糖类化合物选自海藻酸盐。
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| CN108969797A (zh) * | 2018-07-23 | 2018-12-11 | 武汉理工大学 | 一种具有电刺激与抑制神经瘢痕作用的载脂质体凝胶及其制备方法 |
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| US20060166928A1 (en) * | 2002-07-26 | 2006-07-27 | Moon Tae S | Hyaluronic acid derivative gel and method for preparing the same |
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2014
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