CN104323008A - 一种中等螯合强度有机锰用作鸡饲料的新型锰源添加剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中等螯合强度有机锰用作鸡饲料的新型锰源添加剂，具体涉及一种中等螯合强度的有机锰用作鸡饲料的新型锰源添加剂的应用。与常规的锰源添加剂(主要是无机硫酸锰和氧化锰)相比，新型中等螯合强度的有机锰中锰的存在形态与锰元素在鸡体内的存在形态更接近，且具有更高的生物学利用率。因此，在配制鸡配合饲粮过程中选择新型中等螯合强度的有机锰，能大大减少饲料中锰的添加量，降低锰排放对环境的污染，有力地促进养鸡业的高效和可持续发展。

Description

一种中等螯合强度有机锰用作鸡饲料的新型锰源添加剂

技术领域

本发明涉及一种新型有机锰产品的用途，具体涉及一种在鸡全价平衡饲粮配制过程中，选择中等螯合强度的有机锰作为新型锰源添加剂，以满足鸡对锰的需求，防止出现缺锰或亚临界缺锰的应用。

背景技术

锰是动物的必须微量元素之一，具有促进生长、增强免疫力和提高动物繁殖性能等重要生理作用。与哺乳动物相比，鸡等家禽对锰的需要量高，且在体内周转速度快，因此锰对鸡等家禽有着特殊的重要性(罗绪刚,1989)。养殖生产中，为满足鸡对锰的需求，防止鸡缺锰，在饲料配制过程中常需大量添加锰制剂。传统的锰制剂，如硫酸锰和氧化锰等，可破坏饲料中的维生素及其他活性物质，且吸收利用率很低(仅1～3％)，大量未吸收的锰随粪排出体外，既浪费了有限的锰资源，给环境带来了潜在锰污染。因此，具有较高生物学利用率的有机锰从一出现就备受营养学家的关注。

畜禽的健康和正常生产需要各种营养物质以适当的形式进行供应。许多研究发现，微量元素在体内主要以有机复合物而不是以游离无机离子的形式发挥作用，所以有机微量元素产品一出现即引起了动物营养界人士的极大兴趣(罗绪刚,2004)。本实验室在总结前人研究基础上，在不同形态锰在鸡的生物学利用率上做了大量工作，并取得了一系列研究成果。如研究发现，与无机硫酸锰相比，中等螯合强度有机锰更能有效地降低腹脂中脂蛋白脂酶的活性，有效地增强腿肌锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因的表达，从而改善肉品质(吕林,2004；Lu等,2007a,2007b)。此外，本实验室用自然饲喂的试验方法还发现，有机锰对鸡的生物学利用率与其螯合强度有密切的相关性，以无机硫酸锰的利用率为100％，则中等螯合强度有机锰的生物学利用率最高(132％)，强螯合强度次之(112％)，弱螯合强度有机锰最差(99.0％)，与无机硫酸锰接近(李素芬,2002；Li等,2004,2005,2008,2011；Luo等,2007)。用外翻肠囊法比较了不同锰源在鸡上的吸收利用率差异，发现有机锰的吸收显著高于无机硫酸锰，并以强螯合强度的有机锰吸收最好，中等螯合强度和弱螯合强度有机锰依次次之，说明有机锰的螯合强度与其在鸡小肠中的吸收有密切相关性(计峰,2003；Ji等,2006a,2006b)。用原位结扎灌注肠段法探讨了锰在鸡小肠中的吸收动力学模式，发现锰在鸡十二指肠和空肠中主要是以饱和载体转运方式吸收，而在回肠中主要是以非饱和载体扩散方式吸收；不同形态锰吸收率的差异可能是通过小肠锰转运载体(DMT1)基因表达的调节实现的，即鸡十二指肠和空肠DMT1 mRNA的表达与有机锰的螯合强度有密切关系(白世平,2008；Bai等,2008a,2008b,2012)。用Caco-2细胞构建锰吸收转运细胞模型，并用该模型进一步研究不同螯合强度有机锰的吸收转运规律，发现有机锰在Caco-2细胞中的吸收转运显著高于无机硫酸锰，且随着有机锰螯合强度的增加，锰的吸收量增加，并以强螯合强度有机锰的吸收量最高；细胞膜上DMT1、中性氨基酸转运载体1(B⁰AT1)、碱性氨基酸转运载体(rBAT)和酸性氨基酸转运载体3(EAAT3)可能参与不同形态锰在Caco-2细胞顶膜的摄取，细胞膜上膜铁转运蛋白1(FPN1)、中性氨基酸转运载体2(LAT2)、和碱性氨基酸转运载体1(y⁺LAT1)可能参与不同形态锰在Caco-2细胞基底膜的排出，说明有机锰与无机锰可能存在不同的载体转运***(李晓丽,2013；Li等,2013)。以上新研究成果都表明，有机锰的螯合强度是影响其生物学利用率的主要因素，即在鸡上并非任意螯合强度的有机锰产品的相对生物学利用率都显著高于无机硫酸锰，而是只有中等螯合强度的有机锰产品才具有该优势。但在实际生产中由于对该规律的认识不足导致饲料生产者盲目选择有机锰产品作为锰源来配制鸡全价平衡饲粮，造成添加效果不理想，没有达到增强鸡只健康、提高生产水平和效率以及减少环境污染的目标。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种中等螯合强度有机锰用作鸡饲料的新型锰源添加剂，提高鸡对配合饲粮中锰的利用率，减少未吸收的锰随粪排出体外对环境造成的污染，同时达到增强鸡只健康和促进其高效生长发育的目的。

本发明技术解决方案：一种中等螯合强度有机锰用作鸡饲料的新型锰源添加剂，所述中等螯合强度Qf范围为10-100。

所述新型有机锰具体包括中等螯合强度单一氨基酸锰螯合物、中等螯合强度复合氨基酸锰螯合物和中等螯合强度蛋白锰。

所述的饲料为鸡全价平衡饲粮。

本发明与现有技术相比的优点在于：本发明用自然饲喂、原位结扎灌注、外翻肠囊和细胞培养等多种试验方法探讨了不同形态锰在鸡小肠各段的吸收特点，发现锰在鸡小肠中主要以饱和载体吸收的方式为主，有机锰在鸡小肠中的吸收率与其螯合强度有密切的关系，原因可能是螯合的有机锰能更多的抵抗消化道的解离作用而促进锰的吸收。基于以上科学的试验结果，本发明发现了螯合强度是影响有机锰产品生物学利用率的主要因素，且只有中等螯合强度有机锰的生物学利用率最高，并发明了将中等螯合强度有机锰作为鸡饲料新型锰源添加剂，应用到鸡全价平衡饲粮配制过程中的方法用途，能大大提高鸡对饲料中锰的吸收利用率，减少配合饲料锰的添加量，降低饲料成本，同时减少锰排放对环境的污染。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的螯合强度测定方法仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

1.试验目的

通过观测添加不同形态锰源(三种螯合强度不同的有机锰源与无机硫酸锰)及锰水平对鸡心肌锰超氧化物歧化酶活性、含量以及基因表达的影响，分析有机锰源产品螯合强度与其在鸡体内生物学活性之间的相关性，为养鸡生产中科学研制和应用适宜螯合强度的新型高效有机锰源提供科学试验依据。

2.材料和方法

2.1 试验设计与处理

本试验采用4×2+1两因子完全随机设计。4种锰源分别为无机硫酸锰(MnSO₄·H₂O，记为I组)和3种螯合强度分别为弱、中等、强的有机锰源(有机锰为本实验室采用极谱法分析有机锰源产品螯合强度后筛选的3种复合氨基酸锰源，测定方法依据农业行业标准《饲料添加剂氨基酸锰及蛋白锰络(螯)合强度的测定》。依据Holwerda(1995)对有机微量元素产品的界定方法，螯合强度测定值Qf小于10的有机锰为弱螯合强度有机锰，介于10和100之间为中等螯合强度，100和1000之间为强螯合强度，1000以上为极强螯合强度。本次分析测定的样品包括弱螯合强度锰源(稳定常数Qf值为2.35，记为W组)、中等螯合强度锰源(稳定常数Qf值为16.8，记为M组)和强螯合强度锰源(稳定常数Qf值为148，记为S组)。根据本实验室前期对肉鸡锰需要量的研究结果中所得的玉米-豆粕型饲粮中锰的需要量为120-130mg/kg(林月霞等，2008)，设置了3个锰添加水平，分别是0mg/kg的缺乏组(锰含量实测为16.1mg/kg)、100mg/kg的适宜添加组以及200mg/kg的过量而非毒性的锰添加组，共组成9个处理组。其中4种不同锰源共用一个不添加锰的玉米-豆粕型基础饲粮组作为对照组(记为C组)。

2.2 试验动物与饲粮

试验动物选用1日龄AA肉公鸡500只，在1-7日龄期间饲喂不添加锰的基础饲粮(锰含量实测值为16.13mg/kg)，进而达到使肉鸡临界缺锰，以提高肉鸡对锰反应的敏感性。在8日龄时，选取体重接近的鸡，按上述试验设计随机分为9个处理组，每个处理组48只鸡，分为6个重复，每个重复笼8只鸡，共432只，分别饲喂上述各处理组的试验饲粮至21日龄，试验期持续14天。试验期间鸡只自由饮水与采食，饲养管理按照《AA肉仔鸡饲养管理手册》进行。参照美国1994年NRC家禽营养需要量中的肉鸡营养需要建议量，配制l-21日龄肉鸡基础饲粮(见表l)，在此基础上，分别通过添加不同锰源间的不同锰水平而达到上述试验处理中所设置的要求，通过添加赖氨酸或蛋氨酸，来平衡所有处理组饲粮中的赖氨酸和蛋氨酸至同一水平。

表1：肉仔鸡基础饲粮组成成分与营养水平¹

¹饲喂基础。

^a试剂级。

^b实测值。

^c每千克饲粮中添加：V_A 15000IU,V_D33900IU,V_E 30.0IU,V_K33.00mg,V_B11.00mg,V_B28.50mg,V_B62.00mg,V_B120.01mg,Pantothenic acid calcium 10.0mg,Niacin 32.5mg,Folic acid 1.00mg,Biotin 0.16mg,Choline 700mg,Cu(CuSO₄·5H₂O)8.00mg,Zn(ZnSO₄·H₂O)80.0mg,Fe(FeSO₄·7H₂O)80.0mg,I(KI)0.35mg,Se(Na₃SeO₃)0.20mg。

2.3 样品的采集与制备

配制饲粮时现场采集饲粮样品，用于分析其粗蛋白、钙、锰的含量。在21日龄结束时，从每个重复笼中选取3只与该重复平均体重相近的鸡屠宰，取心肌，其中一部分用液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，用以分析心肌中MnSOD基因的mRNA含量、核转录因子Sp-1和AP-2的DNA结合活性、MnSOD-BP的RNA结合活性以及MnSOD的蛋白含量；一部分-20℃冷冻保存，用以分析心肌锰含量和MnSOD酶活。将3只鸡的样品进行合并后分析各指标。

2.4 样品分析

2.4.1 饲粮粗蛋白、钙、锰含量与心肌锰含量和MnSOD活性测定

配合饲粮中粗蛋白采用常规凯氏定氮法测定，饲粮中钙含量、锰含量和心肌锰含量采用等离子发射光谱仪(Thermal Jarrell Ash)测定。心肌MnSOD活性采用亚硝酸盐形成法测定(Li等,2004)。

2.4.2 心肌MnSOD mRNA水平测定

采用荧光定量RT-PCR法(Avital-Cohen,2012)来测定肉鸡心肌中MnSOD mRNA含量。主要步骤为：用Trizol试剂提取心肌细胞中的总RNA→用紫外可见分光光度计测其260nm和280nm下的OD值→计算比值并定量→用0.8％的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性→用RT-PCR试剂盒合成cDNA模板→设计合成MnsOD基因和β-actin基因扩增引物检验扩增产物的正确性→进行mRNA定量。

2.4.3 心肌中核转录因子Sp-1、AP-2 DNA结合活性测定

用凝胶电泳迁移率变动分析法(EMSA,Xu,2002)测定肉鸡心肌细胞线粒体中核转录因子Sp-1、AP-2的DNA结合活性。主要操作步骤为：设计Sp-1、AP-2探针→用生物素标记探针→标记效率的检测→设计探针特异性检验试验→确定探针序列→将蛋白与探针孵育结合→电泳→转膜→交联→封闭→孵育抗体→洗涤→显色→压片→曝光→显影→定影→扫描→分析密度值。

2.4.4 心肌细胞中MnSOD翻译蛋白水平的测定

用Western-blot法(Thongphasuk等,1999)来测定心肌中MnSOD翻译后的蛋白水平。主要操作步骤为：采用IUPA裂解液提取心肌细胞总蛋白→采用Bradford法测定蛋白浓度→经SDS-PAGE电泳→转膜→封闭→孵育抗体→化学发光显色→显影→定影→将胶片进行扫描→分析光密度值。

2.4.5 心肌细胞中MnSOD-BP RNA结合活性测定

用EMSA法(Xu,2002)测定心肌细胞线粒体中MnSOD-BP的RNA结合活性。探针设计采用生物信息学法和BioEdit软件分析比较人、鼠、鸡的MnSOD mRNA 3'非翻译区，比较大鼠序列后得出肉鸡MnSOD mRNA 3'非翻译区的翻译增强子序列为

5'-CTAAGTGGAAACGCACACTTTGTGTTACCTATGAACAAATA-3'

然后根据此序列来设计cRNA探针的DNA模板序列为：

5'-TATTTGTTCATAGGTAACACAAAGTGTGCGTTTCCAC

TTAGGTATAGTGAGTCGTATTA-3'

T7 Primer：

5'-TAATACGACTCACTATACC-3'

主要操作步骤为：蛋白的提取→蛋白浓度的测定→探针设计→探针合成与标记→标记效率的检测→探针特异性检测→样品与探针孵育→电泳→转膜→交联→封闭→孵育抗体→洗涤→显色→压片→曝光→显影→定影→扫描→分析密度值。

2.5 统计分析

所有试验数据都采用SAS 9.0***中的一般线性模型(GLM)程序，进行两因子方差分析，其中方差分析差异显著者，以LSD法比较平均数间的差异显著性，以0.05作为本试验检验各项数据差异的显著性水平。

3.结果

3.1 锰源和锰水平对心肌锰含量、MnSOD蛋白含量、MnSOD活性和MnSOD mRNA表达水平的影响

结果见表2。心肌锰浓度、MnSOD含量和MnSOD活性与MnSOD mRNA表达水平受到锰添加水平的显著影响(r>0.56，P<0.01)。与C组相比，添加锰组显著提高了上述四个指标的含量(活性)，且与100mg/kg锰添加组比，添加高剂量锰(200mg/kg)也显著提高了上述指标的含量(活性)。与I组和W组相比，M组显著提高了心肌锰含量(P<0.05)，但I组和W组间差异不显著。M组的心肌MnSOD mRNA表达水平显著高于其余锰源组，MnSOD活性显著高于I组，且S组的心肌MnSOD mRNA表达水平也显著高于I组。锰源并未对心肌MnSOD蛋白含量造成显著影响。

3.2 心肌SP-1和AP-2 DNA结合蛋白活性

结果见表3。由表3可知，心肌SP-1和AP-2 DNA结合蛋白活性受到锰添加水平的显著影响(P<0.01)，且心肌SP-1蛋白结合活性与锰添加水平间正相关(r＝0.91，P<0.01)，而AP-2蛋白结合活性与锰添加水平呈负相关(r＝-0.46，P<0.01)。与C组比，加锰组的SP-1蛋白结合活性显著升高，而AP-2 DNA结合蛋白活性显著下降；与100mg/kg锰添加组比，高剂量锰组(200mg/kg)也表现出SP-1蛋白结合活性显著升高，而AP-2 DNA结合蛋白活性显著下降。同一锰添加水平上，与其他锰源添加组比，M组显著降低了AP-2 DNA结合蛋白活性；与I组和S组相比，W组的AP-2 DNA结合蛋白活性也显著下降。

3.3 心肌MnSOD-BP RNA结合活性

结果列于表3。由表3可知，心肌MnSOD-BP RNA结合活性与饲粮锰添加水平显著相关(r＝0.66，P<0.01)。与对照组比，添加锰后显著提高了心肌MnSOD-BP RNA结合活性；与100mg/kg添加组比，高剂量组(200mg/kg)也显著提高心肌MnSOD-BP RNA结合活性。同一锰添加水平下，不同锰源间，以M组的心肌MnSOD-BP RNA结合活性最高，显著高于其他锰源组；S组心肌MnSOD-BP RNA结合活性也显著高于I组合W组，而I组和W组间差异不显著。

4.结论

总之，本发明中上述试验结果表明，饲粮中锰可能通过Sp1、AP-2和MnSOD-BP在转录水平和转录后水平上调节MnSOD基因的表达。不论是在转录水平上还是转录后水平的调节上，中等螯合强度有机锰都是最有效的锰源添加剂。因此，本发明试验证明了只有中等螯合强度有机锰才最有利鸡对其中锰的利用。

表2：锰源和锰水平对肉仔鸡心肌锰含量、MnSOD mRNA表达水平、MnSOD蛋白表达水平与MnSOD活性的影响¹

¹数据以平均值±标准差表示(n＝6)。

²表示数据用MnSOD mRNA(蛋白)含量与β-actin mRNA(蛋白)含量之比。

³表示鲜组织样中，以抑制50％的亚硝酸盐形成所需的酶量定义为1个亚盐硝酸盐单位。

*表示与所有Mn添加组差异显著(P<0.05)。

^Ψ表示与100mg/kg Mn水平添加组差异显著(P<0.05)。

^a,b,c表示同一行中具有不同字母上标者间差异显著(P<0.05)。

表3：锰源和锰水平对心肌Sp1 DNA结合蛋白活性和AP_-2 DNA结合蛋白活性的影响¹

¹数据以平均值±标准差表示(n＝6)。

^*表示与所有Mn添加组差异显著(P<0.05)。

^Ψ表示与100mg/kg Mn水平添加组差异显著(P<0.05)。

^a,b,c表示同一行中具有不同肩标字母者间差异显著(P<0.05)。

Claims (3)

1.一种中等螯合强度有机锰用作鸡饲料的新型锰源添加剂，其特征在于：所述锰元素与有机配位体之间形成的配位键的强度Qf(Quotient of formation)测定值范围为10至100之间。

2.根据权利要求1所述中等螯合强度有机锰用作鸡饲料的新型锰源添加剂，其特征在于：所述的新型有机锰具体包括中等螯合强度单一氨基酸锰螯合物、中等螯合强度复合氨基酸锰螯合物和中等螯合强度蛋白锰。

3.根据权利要求1或2所述中等螯合强度有机锰用作鸡饲料的新型锰源添加剂，其特征在于：所述的饲料为鸡全价平衡饲粮。