CN104313068B

CN104313068B - 一种磷脂型dha的发酵制备方法

Info

Publication number: CN104313068B
Application number: CN201410547056.9A
Authority: CN
Inventors: 黄和; 任路静; 赵晓艳; 庄小燕; 纪晓俊
Original assignee: JIANGSU TIANKAI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ANHUI TIANKAI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2014-09-03
Filing date: 2014-10-15
Publication date: 2017-08-25
Anticipated expiration: 2034-10-15
Also published as: CN104313068A

Abstract

本发明公开了一种磷脂型DHA的发酵制备方法，它包括以下步骤：(1)以产DHA的菌株为出发菌株，在液体培养基中进行高密度发酵，获得富含甘油脂型DHA的菌体细胞；(2)向步骤(1)高密度发酵结束后的发酵液中添加碳源、氮源、磷源、氨基酸，继续发酵获得富含磷脂型DHA的菌体细胞；(3)收集步骤(2)得到的富含磷脂型DHA的菌体细胞，经破碎、萃取获得富含磷脂型DHA的油脂。本发明最终得到15‑40％的极性油脂，其中主要成分为磷脂，极性油脂中DHA含量达到48.16％。本发明将富含甘油酯型DHA的油脂转化为富含磷脂型DHA的油脂，并有效提高了油脂中磷脂型DHA的含量。

Description

一种磷脂型DHA的发酵制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种磷脂型DNA的发酵制备方法。

背景技术

二十二碳六烯酸(DHA)是一种重要的omega-3长链多不饱和脂肪酸，是大脑和视网膜组织中细胞膜的组成成分，具有增强视力、促进脑细胞发育及预防高血压、动脉硬化、心血管疾病等生理功效。由于人体很难通过自身合成来满足机体对DHA的需求，因此必须依靠从外界食物中获取。

目前，DHA的主要来源是鱼油，且主要以甘油三酯的形式被人体摄入。DHA的另一种存在形式为磷脂型DHA(DHA-containing PL)。磷脂是生物膜的主要成分，研究表明它具有降血脂，抗动脉粥样硬化等作用。DHA的存在形式不同，在人体内的吸收方式和吸收效率也不同。甘油酯型DHA在人体内主要以被动扩散的方式被吸收，吸收率为50％左右。而磷脂型DHA在人体内主要以主动吸收的方式被吸收，吸收率接近100％。Kafrawy等人研究发现，与其他磷脂型脂肪酸相比，磷脂型DHA对小鼠白血病细胞具有更大的毒性。研究还发现，磷脂型DHA能够有效降低小鼠血浆和肝脏中的总胆固醇和甘油三酯含量，改善正常小鼠的血脂水平。Gisbert等人研究发现，磷脂型DHA较甘油酯型DHA而言，对仔鱼的生长有更好的促进作用。Schaefer等人研究发现，血浆中磷脂型DHA水平的增加可以有效减少痴呆的发病率。

磷脂型DHA只存在于蛋黄中，且含量极低。目前，国内磷脂型DHA的研究主要集中在以下几个方面：(1)磷脂型DHA的应用；(2)磷脂型DHA的提取；(4)磷脂型DHA的生理作用研究。其中，并未发现利用生物发酵法制备磷脂型DHA的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种磷脂型DHA的发酵制备方法以填补国内空白。

为解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

(1)以产DHA的菌株为出发菌株，在液体培养基中进行高密度发酵，获得富含甘油脂型DHA的菌体细胞；

(2)向步骤(1)高密度发酵结束后的发酵液中添加营养物质，继续发酵获得富含磷脂型DHA的菌体细胞；

(3)收集步骤(2)得到的富含磷脂型DHA的菌体细胞，经破碎、萃取获得富含磷脂型DHA的油脂；

其中，所述的营养物质为碳源、氮源、磷源、氨基酸中的任意一种或几种的组合。

其中，所述的产DHA的菌株为裂殖壶菌属、破囊壶菌属、吾肯氏壶藻属，优选为裂殖壶菌属，最优选为CCTCC No：M209059菌株(该菌株已经公开在申请号为200910033869.5的中国专利中)。

上述步骤(1)中的高密度发酵包括如下步骤：

(1a)将保存在甘油管中的菌株接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在20～30℃的摇床中，以150～200rpm的转速，培养24～48h，获得一级种子液；

(1b)将步骤(1a)得到的一级种子液按照2～10％v/v接种量接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在20～30℃的摇床中，以150～200rpm的转速，培养24～48h，获得二级种子液；

(1c)将步骤(1b)得到的二级种子液按照2～10％v/v接种量接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在20～30℃的摇床中，以150～200rpm的转速，培养24～48h，获得三级种子液；

(1d)将步骤(1c)中得到的三级种子液按照2～10％v/v接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，然后向发酵罐中加入消泡剂，进行发酵，使菌株发酵产富含甘油酯型DHA的油脂。

上述步骤(1d)中发酵条件的通气量为0.2～1vvm，优选为0.6vvm。

上述步骤(1d)中发酵条件的搅拌速度为100～200rpm，优选为200rpm。

上述步骤(1d)中发酵条件的罐温为20～30℃，优选为30℃。

上述步骤(1d)中发酵条件的培养时间为90～150h，优选为120h。

上述步骤(1d)中采用的发酵方法为间歇式发酵或补料式发酵方法。

上述高密度发酵中的种子培养基的碳含量为10～30g/L，优选为15～25g/L，最优选为20g/L。

上述高密度发酵中的发酵培养基碳含量为20～60g/L，优选为30～40g/L，最优选为40g/L；氮含量为2.1～2.5g/L，优选为1.8～2g/L，最优选为2g/L；硫含量为2～3g/L，优选为2.5～3g/L，最优选为3g/L；磷含量为0.4～1.5g/L优选为1.2～1.5g/L，最优选为1.5g/L。

所述的种子培养基和发酵培养基中，碳源为葡萄糖、果糖或甘油，优选葡萄糖；氮源为酵母膏、玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、硝酸铵或硫酸铵，优选酵母膏；磷源为磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，优选磷酸二氢钾；硫源为硫酸镁或硫酸铵，优选硫酸铵。

上述步骤(1d)所述的消泡剂为silicone SE-2，添加量为0.3g/L。

其中，营养物质中，

所述的碳源为乙醇、乙酸钠中的任意一种或几种的混合物；碳源的添加量为2～4g/L，优选为4g/L。

所述的氮源为酵母膏、硫酸铵、谷氨酸钠中的任意一种或几种的混合物，氮源的添加量为5～20g/L，优选为15～20g/L，最优选为20g/L。

所述的磷源为磷酸二氢钾中，磷源的添加量为2～4g/L，优选为3～4g/L，最优选为4g/L。

所述的氨基酸为脯氨酸、赖氨酸，添加量为0.1～0.5g/L，优选为0.2～0.3g/L，最优选为0.3g/L。

所述的营养物质优选谷氨酸钠、硫酸铵、乙醇单独添加，硫酸铵和乙醇双添加，硫酸铵和脯氨酸双添加，最优选硫酸铵单独添加，硫酸铵和脯氨酸双添加。

其中，步骤(2)中，所述的继续发酵条件的通气量为0.5～1vvm，优选为0.6vvm。

其中，步骤(2)中，所述的继续发酵条件的搅拌速度100～200rpm，优选为170rpm。

其中，步骤(2)中，所述的继续发酵条件的罐温20～30℃，优选为30℃。

其中，步骤(2)中，所述的继续发酵条件的培养时间为48～72h，优选为72h。

步骤(3)具体过程为：收集菌体细胞，采用破壁酶破碎细胞，再用有机溶剂萃提4～8h，得到富含磷脂型DHA的油脂。

其中，所述的有机溶剂为正己烷、石油醚、乙醇和***中的任意一种或几种的混合物，按照有机溶剂与破碎细胞液体积比1:0.5～2的量添加。

其中，所述的破壁酶为蛋白酶，添加量为2～8g/L。

萃取得到油脂后，利用柱层析方法分离油脂组分，分别获得极性脂质和中性脂质，所述的柱层析方法如下：

取100～200目层析专用硅胶粉于120℃烘箱内烘24h，使其含水量在5％左右，待用。先将30ml石油醚加入层析柱中，拍打除去砂芯中的气泡；取一定量硅胶粉至烧杯中，加入一定量石油醚，搅拌至无气泡，再缓缓倒入层析柱中，使其均匀沉降，用中性洗脱剂(石油醚/***，9:1，v/v)冲洗柱子2h，使柱子紧实。称取2.0g左右油脂，用中性洗脱剂溶解。将样品沿柱壁缓缓加入层析柱内，先用500ml中性洗脱剂洗脱获得中性脂，再用极性洗脱剂(甲醇)洗脱至硅胶柱发白，分别旋转蒸发得各分离组分。

利用气相色谱分别检测总油脂、中性脂质和极性脂质中的脂肪酸分布情况，所述的气相色谱分析方法采用如下方法：

甲酯化方法：取0.5g左右油脂，用正己烷定容至10ml；用移液管移取1ml至10ml容量瓶，加入3ml 0.5mol/L的KOH-甲醇溶液，于65℃水浴15～20min，冷却；再加入2ml BF3-***-甲醇溶液(BF3-***:甲醇＝3:7,v/v)，水浴65℃，5～10min，冷却；再加饱和NaCl溶液、正己烷各2ml，振荡后静置、分层，取上层至另一个容量瓶中，用正己烷萃取2-3次后定容至10ml，取100μl萃取液并加入100μl十九烷酸甲酯(浓度已知)溶液混匀，可用作DHA分析。

气相分析条件：色谱柱：DB-23(60m*0.25mm*0.25μm)；检测器：FID；载气：氮气；分流比：30/1；进样口温度：250℃；检测器温度：280℃；进样量：1μl；升温程序：初始柱温为100℃，先以25℃/min的速度升至196℃，再以2℃/min的速度升至220℃，保持12min。柱流速：3.0ml/min；尾吹流速：30ml/min；氢气流速：40ml/min；空气流速：400ml/min。

有益效果：本发明提供了一种磷脂型DHA的制备方法，在海洋真菌发酵产DHA的基础上，采用双阶段发酵的方法，制备富含磷脂型DHA的油脂。得到的油脂中，极性脂占总油脂百分含量为15％-40％，极性脂中DHA含量最高可达到48.16％，其中大部分为磷脂型DHA。而目前利用微生物发酵制备DHA油脂的研究主要是富集胞内的甘油酯，对磷脂的研究很少，本专利提供的磷脂制备方法工艺简单，生产成本较低，且海洋真菌生长较快，更易于扩大生产规模。因此，该方法的提出，有利于我们进一步研究磷脂型DHA的生理作用，有效提高了DHA产品的应用效率。

附图说明

图1裂殖壶菌DHA单细胞油脂TLC分析：图1-A表明裂殖壶菌单细胞油脂中中性脂主要由甘油三酯(TAG)、甘油二酯(DAG)和甘油单酯(MAG)构成；将裂殖壶菌单细胞油脂在极性展层剂中进行薄层分析，图1-B表明极性脂中以卵磷脂为主。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例中使用的产DHA的菌株为保藏号为CCTCC No：M209059的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)。

实施例1：第一阶段发酵制备富含甘油酯型DHA油脂。

将保存在甘油管中的DHA菌种接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在摇床上进行种子的活化，温度30℃，转速170rpm，培养24h，获得活力较高的种子液。按照同样的方法活化三代后，将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，接种量10％(v/v)，通气量0.6vvm，搅拌转速200rpm，罐温30℃，加入消泡剂silicone SE-2，添加量为0.3g/L，发酵培养120h，得到富含甘油酯DHA油脂。发酵结果见表1。

表1 第一阶段发酵结果

实施例2：发酵过程中代谢物分析。

利用柱层析方法对第一阶段发酵过程中不同发酵时间的油脂进行组分分离，考察不同油脂组分随时间的变化情况。分析结果见表2。从表2中可以看出，随着发酵时间的延长，菌体细胞中中性脂含量不断升高，而极性脂含量逐渐降低。因此可以通过分析细胞生长阶段、发酵前期和发酵后期胞内各种代谢物含量的变化情况，从而确定极性脂的积累所需要的营养元素。

表2 第一阶段发酵过程中油脂组分变化

利用GC-MS对发酵过程中各个阶段的代谢物进行分析检测分析，发现代谢物种类主要包括有机酸、氨基酸、糖类和磷酸类化合物。发酵各个阶段代谢物含量变化见表3。

表3 发酵各个阶段中间代谢物含量变化情况

由表3可知，在发酵过程中大部分代谢物的含量随发酵时间的变化而变化。由表2可知，0～48h极性脂含量较高，而48h之后极性脂含量下降，直至发酵结束。0～48h细胞处于生长阶段和发酵前期，结合发酵各个阶段胞内代谢物含量变化分析发现，磷酸、赖氨酸、脯氨酸在这个阶段含量较高，而在极性脂含量不断下降的发酵后期，磷酸、赖氨酸、脯氨酸在胞内的含量都有所下降。因此，磷酸、赖氨酸、脯氨酸等物质很有可能与前期磷脂积累有密切关系。因此，为促进磷脂的合成，将此类物质作为第二阶段发酵添加营养物质。

实施例3：第二阶段单营养物质添加发酵考察。

第一阶段发酵结束后，根据代谢组学所得的代谢物谱向发酵液中添加不同营养物质，添加氮源提供氨基酸，磷酸二氢钾提供磷酸。营养物质及添加量分别为2g/L乙酸钠、40ml/L乙醇、4g/L酵母膏、20g/L谷氨酸钠、3.6g/L硫酸铵、4g/L磷酸二氢钾。第二阶段发酵的条件如下：通气量为0.6vvm，搅拌速度为170rpm，罐温为30℃，培养时间为72h。发酵结束后，利用柱层析方法对获得的油脂进行油脂组分分离，考察添加不同营养物质的发酵液中油脂的组分进行考察，考察结果见表4。

表4 添加不同单营养元素发酵液油脂分析结果

从油脂含量角度出发，与第一阶段发酵结束时相比，经过第二阶段培养后，发酵液中的油脂含量都有了不同程度的减少。其中，未添加任何营养元素的对照组(33.624g/L)与第一阶段发酵结束时(52.847g/L)相比，油脂含量降低了36.37％。谷氨酸钠、乙醇、硫酸铵三种营养元素的添加可以较好的缓解油脂的消耗。

从不同油脂组分占总油脂百分含量角度分析，与第一阶段发酵结束相比，经过第二阶段发酵后，发酵液油脂中极性脂占总油脂的百分含量都发生了变化。与第一阶段发酵结束(6.88％)相比，对照组(9.21％)油脂极性脂/总油脂增加了33.87％。与对照组相比，添加不同的营养元素的油脂中，极性脂/总油脂也有所增加。其中，3.6g/L硫酸铵添加效果最为明显(14.59％)，与对照组相比，极性脂占总油脂含量增加了58.41％。

从油脂组分含量角度分析，与第一阶段发酵结束时极性脂含量为3.636g/L，经过第二阶段发酵，对照组和添加了酵母膏的油脂中极性脂含量有所下降，而添加了谷氨酸钠、乙醇、乙酸钠、硫酸铵和磷酸二氢钾的油脂中极性脂含量都有不同程度的增加。其中，硫酸铵、乙醇添加效果最为明显，与第一阶段发酵结束相比，分别增加了53.19％、68.87％。实施例4：第二阶段双营养物质添加发酵考察。

在实施实例3的基础上，在第一阶段发酵结束后向发酵液中添加双营养物质。营养物质及添加量分别为40ml/L乙醇、3.6g/L硫酸铵、4g/L磷酸二氢钾、0.3g/L脯氨酸、0.2g/L赖氨酸。并对油脂含量及油脂组分进行考察，考察结果见表5。

表5 添加双营养物质发酵液油脂分析结果

从上表可以看出，营养物质组合添加可以有效提高油脂中极性脂占总油脂的百分含量和极性脂含量。添加硫酸铵和脯氨酸后，极性脂占总油脂的百分含量可达到38.54％，与对照相比(9.21％)，增加了3.18倍，极性脂含量最高可达到13.87g/L，与对照相比(3.10g/L)，增加了3.47倍。

实施例5：第二阶段发酵DHA含量考察。

利用柱层析分离实施例1、实施例3和实施例4各实验组最终得到的油脂，利用气象色谱进行分析。对添加不同营养元素的发酵液中不同油脂组分的DHA含量进行考察，考察结果见表6。

表6 添加不同营养元素后发酵液中不同油脂组分的DHA含量分析结果

由上述实例可知，第二阶段发酵结束后，添加不同营养物质的油脂中不同组分的DHA含量都会发生变化。其中，与第一阶段发酵结束相比，对照组总油脂DHA含量增加了27.31％，添加了酵母膏的发酵中总油脂DHA含量增加了31.78％，极性脂的DHA含量达到48.42％。添加硫酸铵的发酵液中极性脂的DHA含量达到48.16％，与对照组相比增加了8.59％。

实施例6：单细胞油脂TLC分析。

按照如下方法破碎细胞实施例4和5添加了营养物质发酵后得到的细胞，并萃取得到油脂：收集菌体细胞，采用破壁酶破碎细胞，再用有机溶剂萃提4h，得到富含磷脂型DHA的油脂。有机溶剂为正己烷和乙醇按体积比1:1的混合物，按照有机溶剂与破碎细胞液体积比1:1的量添加。破壁酶为蛋白酶，添加量为3g/L。对裂殖壶菌单细胞油脂进行薄层色谱分析，分析结果如图1所示。

将裂殖壶菌单细胞油脂在中性展层剂中进行薄层分析，表明裂殖壶菌单细胞油脂中中性脂主要由甘油三酯(TAG)、甘油二酯(DAG)和甘油单酯(MAG)构成(见图1-A)；将裂殖壶菌单细胞油脂在极性展层剂中进行薄层分析，表明极性脂中以卵磷脂为主(见图1-B)。

Claims

1.一种磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

其中，所述的营养物质为碳源、氮源、磷源、氨基酸的任意一种或几种的组合；

所述的碳源为乙醇、乙酸钠中的任意一种或几种的混合物，碳源的添加量为2～4g/L；

所述的氮源为硫酸铵、谷氨酸钠中的任意一种或几种的混合物，氮源的添加量为5～20g/L；

所述的磷源为磷酸二氢钾，磷源的添加量为2～4g/L；

所述的氨基酸为脯氨酸或赖氨酸，添加量为0.1～0.5g/L；

所述的产DHA的菌株为CCTCC No：M209059；

步骤(1)中，所述的高密度发酵包括如下步骤：

(1d)将步骤(1c)中得到的三级种子液按照2～10％v/v接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，然后向发酵罐中加入消泡剂，在通气量为0.2～1vvm、搅拌速度为100～200rpm、罐温为20～30℃的条件下培养90～150h，使菌株发酵产富含甘油酯型DHA的油脂。

2.根据权利要求1所述的磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，所述的种子培养基的碳含量为10～30g/L，所述的发酵培养基碳含量为20～60g/L，氮含量为2.1～2.5g/L，硫含量为2～3g/L，磷含量为0.4～1.5g/L；上述培养基中，碳源为葡萄糖、果糖或甘油；氮源为酵母膏、玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、硝酸铵或硫酸铵；磷源为磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，硫源为硫酸镁或硫酸铵。

3.根据权利要求1所述的磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，步骤(1d)中，所述的消泡剂为silicone SE-2，添加量为0.3g/L。

4.根据权利要求1所述的磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的继续发酵条件为：通气量0.5～1vvm，搅拌速度100～200rpm，罐温20～30℃，继续培养48～72h。

5.根据权利要求1所述的磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，步骤(3)具体过程为：收集菌体细胞，采用破壁酶破碎细胞，再用有机溶剂萃提4～8h，得到富含磷脂型DHA的油脂。

6.根据权利要求5所述的磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为正己烷、石油醚、乙醇和***中的任意一种或几种的混合物，按照有机溶剂与破碎细胞液体积比1:0.5～2的量添加。

7.根据权利要求5所述的磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，所述的破壁酶为蛋白酶，添加量为2～8g/L。