CN104313067A - 红球菌高效利用木糖渣生产生物柴油的方法 - Google Patents

红球菌高效利用木糖渣生产生物柴油的方法 Download PDF

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Abstract

生物柴油含硫量低，且不含芳香族化合物，可生物降解，是一种环境友好型的可再生能源。红球菌属有很强的碳源转化能力，能够将生活生产中难以利用的木质纤维素高效率转化为脂肪酸，浑浊红球菌（ Rhodococcusopacus PD630）利用葡萄糖为碳源时油脂积累量可高达细胞干重的86%，是一种优质的产油菌株。本发明提供了一种通过浑浊红球菌（ Rhodococcusopacus PD630）高效利用木糖渣生产脂肪酸的方法。相比常用的酵母菌属，红球菌属对极性条件的耐受力强，碳源转化能力高，发酵条件较为简单，是一种非常有潜力的生物柴油工业化生产途径。

Description

红球菌高效利用木糖渣生产生物柴油的方法
技术领域
本发明涉及一种生物柴油的生产方法，尤其是关于红球菌利用木糖渣产生的脂肪酸，然后采用生物柴油生产工艺将产出的脂肪酸转化为生物柴油的一种方法。
背景技术
自20世纪以来，石油一直成为人类大规模开采和使用的能源。到了20世纪后期，人类逐渐意识到石油资源的短缺及其使用带来的环境问题。从而，为解决能源和环境的双重压力，相关研究人员也一直致力于新能源的开发。其中，生物柴油含硫量低，且不含芳香族化合物，可生物降解，是一种环境友好型的可再生能源。生物柴油的生产原料来源广，随着社会的发展和技术的进步，生物柴油在人类生活生产中所占比例将越来越大。
    动植物油脂用来作为生产生物柴油的原料有一定的局限。首先，产油的农作物受限于土地的利用度，与粮食竞争土地来生产生物柴油有些得不偿失。而目前也不断在尝试用微生物油脂作为绿色可持续的生物柴油原料，红球菌属有很强的碳源转化能力，能够将生活生产中难以利用的木质纤维素高效率转化为脂肪酸。浑浊红球菌（Rhodococcus opacus PD630）利用葡萄糖为碳源时油脂积累量可高达细胞干重的86%，是一种优质的产油菌株。
木糖渣是利用玉米芯生产木糖时的下脚料，其主要成分为48.5%的纤维素、23.5%的半纤维素和21.3%的木质素,是一种优质的生物质资源，并且我国每年有约25万t的木糖渣产生，发明者长期探索发明了一种通过浑浊红球菌（Rhodococcus opacus PD630）高效利用木糖渣生产脂肪酸的方法。相比常用的酵母菌属，红球菌属对极性条件的耐受力强，碳源转化能力高，发酵条件较为简单，是一种非常有潜力的生物柴油工业化生产途径。
发明内容
本发明提供一种高效产油红球菌—Rhodococcus opacus PD630，保藏编号DMSZ44193。在浑浊红球菌（Rhodococcus opacus PD630）的发酵培养基中配入适量的木糖渣粉，在发酵过程中实时监测其浓度，及时补料，同时也要控制好其他条件参数。通过匀浆使得红球菌细胞破碎释放胞内油脂，然后将浑浊红球菌发酵积累的油脂通过极性有机溶剂（如氯仿、己烷）萃取出来，接着用酯交换的方法将提纯出来的微生物油脂转化为生物柴油。或者对红球菌生物质进行直接酯交换以制备生物柴油。具体的实施方式，本文将通过以下几个实施例来加以详细说明。
具体实施方式
实施例1
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母提取物5g/L，麦芽提取物10g/L，Na2HPO4·12H2O 9g/L，KH2PO4 1.5g/L。除葡萄糖外将培养基其他成分于121℃条件下灭菌20min，葡萄糖单独于115℃灭菌20min。接种量为2%，起始pH7.2±0.02，28℃，200rpm，培养24h。
24h后测得OD600为47.2。
实施例2
改变培养基中氮源的量，将上述实施例1中的种子培养罐中的菌体分别转入下面的培养培养基中扩大培养。
营养平衡培养基：木糖渣80g/L，尿素10g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl2·2H2O 0.02g/L，FeSO4·7H2O 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，MnSO4·5H2O 0.02g/L，H3BO3  0.015g/L，NiCl2·2H2O 0.01g/L，EDTA 0.25g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.005g/L，Stock A溶液 1ml/L,1.0M磷酸缓冲溶液 35.2ml/L。
氮源限制培养基：木糖渣 80g/L，尿素0.636g/L，其他成分与营养平衡型培养基一致。
Stock A溶液配方：NaMoO4·2H2O 2g/L，FeNa·EDTA 5g/L。
1.0M磷酸缓冲溶液配方：KH2PO4 47g/L，K2HPO4 113g/L。
将实施例1发酵得到的种子液分别转入营养平衡培养基和氮源限制培养基，分别置于于7L全自动发酵罐中。发酵罐参数设定为：转速500rpm，pH7.2±0,02，温度28℃，通气量0.5vvm，培养周期为110h。发酵过程中随着木糖渣浓度低于8g/L时，要及时向培养液中补料使得木糖渣的浓度维持在80g/L左右。
实施例3：测定红球菌细胞油脂产率
A.测定红球菌细胞干重
上述实施例2发酵结束后，分别在两个发酵罐取1ml发酵液，在10000rpm下离心10min，用水洗涤生物质沉淀两次，并在40℃下恒温干燥24h，通过重量分析确定生物质。
B.从浑浊红球菌细胞中提取油脂（Folch油的提取方法）
将上述实施例发酵产生的红球菌生物质与20体积的氯仿：甲醇（2:1）混合液一起匀浆。分散后，室温下在轨道振荡器上过夜搅拌整个混合液，离心并回收液相。用0.2体积的水洗涤溶剂。漩涡混合几秒后，2000rpm下离心分开两相。虹吸去除上相，氮气流氛围下在旋转蒸发器中蒸发含有脂质的下相，回收油脂，称重。
C.浑浊红球菌细胞的油脂产率
通过用红球菌细胞产油脂的量与浑浊红球菌细胞干重的比值来表示细胞的油脂产率。
D.营养平衡培养基和氮源限制培养基的红球菌细胞的产油率
表1
  细胞干重 产油量 细胞产油率
营养平衡培养基 40.2g/L 8.7g/L 21.6%
氮源限制培养基 22.3g/L 18.42g/L 82.7%
经实验发现红球菌在氮源限制的条件下，胞内油脂积累效率显著提高。
实施例4：胞内脂肪酸的含量及组成分析：气相色谱分析
向实施例3提取出来的油脂加入1ml正己烷，4000rpm离心5min，上清转移至气相瓶。气相色谱分析用岛津GC-2010，色谱柱为DB-Wax(30m×0.32mm，0.25μm)，氢离子火焰检测器，汽化室和检测器温度分别为240℃和260℃。分流方式为进样1μl,分流比为10:1，载气为氮气。程序升温设置：
120℃ Hold 3min
以5℃/min,升温至190℃
以4℃/min,升温至220℃
Hold 20min
红球菌胞内积累油脂的定性、定量分析结果如下：
表2
红球菌胞内积累的脂肪酸主要是C14-C18的中链脂肪酸为主，积累的脂肪酸主要以甘油三酯存储于细胞内，其中棕榈油酸（C16：0)和油酸（C18：1)含量最高。
实施例5：利用红球菌所产油脂生产生物柴油
将上述实施例中，浑浊红球菌胞内积累的油脂提取出来后进行酯交换：向10g的油中加入0.8ml的甲醇并在150rpm下充分混合1h。用1%的硫酸酸化混合物、并在35℃、150rpm下持续酸化1h。恒速搅拌下，将溶解于甲醇的4%NaOH缓慢加入到混合液中。150rpm恒速搅拌下，将反应混合物在70℃维持1h。静置，混合物以相分离。分离出含有生物柴油的上层相。
实施例6：直接对红球菌细胞进行酯交换反应，提取生物柴油
将实施例2中发酵获得的红球菌冻干，取1g冻干细胞加入到10ml的甲醇硫酸中（硫酸浓度为1%）并剧烈混合。加入10ml氯仿，并在80℃下加热混合物2h。酯交换期间向混合液加入抗氧化剂（没食子酸丙酯），冷却混合物至室温。加入20ml的水并剧烈震荡，静置约12h，发生相分离，回收氯仿相的生物柴油。
实施例7：红球菌细胞产油与麻风树油成分比较
麻风树油是生产生物柴油的良好原料，本实施例将实施例4所分析得到的红球菌胞内积累油脂成分及含量与麻风树油进行比较。
表3
脂肪酸类型 麻风树油（%总脂肪酸含量） 红球菌PD630产油（%总脂肪酸）
C14：0(肉豆蔻酸) — 2.48
C16：0(棕榈酸) 14.66 24.92
C16：1(棕榈油酸) 0.94 7.42
C18：0(硬脂酸) 6.86 4.04
C18：1(油酸) 39.08 21.51
C18：2(亚油酸) 32.48 —
C18：3(亚麻酸) 0.30 —
C20：0(花生酸) 0.24 —
其他 5.44 39.65
由表3对比可以看出，红球菌（Rhodococcus opacus PD630）细胞产油的脂肪酸成分及含量与麻风树油较为相似，充分说明红球菌（Rhodococcus opacus PD630）细胞是适合生产生物柴油的优质菌属。

Claims (8)

1.一种高效生产生物柴油的方法，其特征在于：生产生物柴油的原料油脂是微生物油脂。
2.根据权利要求1所述，微生物油脂的的生产菌种为红球菌属。
3.根据权利要求2所述产油菌种包括Rhodococcus opacus PD630、Rhodococcus jostii RHA1等红球菌属的多个种。
4.根据权利要求1、2或3所述，产油红球菌产油利用的碳源为工业废弃木糖渣。
5.根据权利要求4所述，木糖渣添加方式为直接配入培养基和补料添加，添加量为8%—10%。
6.红球菌细胞产油的提取方式为氯仿-甲醇（2:1）萃取。
7.利用红球菌细胞产油生产生物柴油的方式为对提取的油脂进行酯交换或直接对冻干的红球菌细胞进行酯交换反应。
8.根据权利要求7所述，对细胞进行直接酯交换后提取生物柴油的方法为有机溶剂萃取，萃取剂包括：氯仿，己烷，***等。
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