CN104304096A - 一种牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系的选育方法 - Google Patents
一种牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系的选育方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明建立了牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系选育方法，主要包括如下的步骤：迟钝爱德华氏菌感染牙鲆鱼苗及其抗病力测定方法、抗迟钝爱德华氏菌病群体筛选方法、抗迟钝爱德华氏菌病家系筛选方法以及抗迟钝爱德华氏菌病家系特异微卫星标记筛选方法等，筛选到抗病家系特异微卫星标记；建立了抗病家系后代抗病力和养殖成活率测试方法，创制了牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系。采用本发明技术生产的牙鲆苗种具有抗迟钝爱德华氏菌病能力强、养殖成活率高、死亡率低、生长速度较快的特点，基本解决了牙鲆苗种夏季因感染迟钝爱德华氏菌而爆发腹水病引起大量死亡的问题，适合在全国沿海地区牙鲆养殖场推广应用。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖业的鱼类遗传育种技术领域，具体涉及一种牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系的选育方法。
背景技术
牙鲆是中国、日本和韩国重要的海水养殖鱼类，也是人们喜爱的高蛋白水产品。目前我国牙鲆的养殖产量大约是每年2万吨，产值为25-30亿元人民币。除满足国内市场的需要外，牙鲆还是出口创汇的主要水产品之一。然而，随着牙鲆养殖业的快速发展，一些问题相继出现，特别是病害频发、种质退化、苗种成活率低等，每年给牙鲆养殖业造成高达近10亿元人民币的经济损失，从而极大限制了牙鲆养殖业的发展。
危害牙鲆的主要病害是细菌性和病毒性疾病，尤以细菌性疾病造成的危害最大。目前牙鲆养殖业中危害最大的细菌性疾病是由迟钝爱德华氏菌引起的腹水病(张晓君等，2005；朱壮春等，2006)和由鳗弧菌引起的弧菌病(周丽等，1997)。特别是由迟钝爱德华氏菌引起的腹水病危害尤为严重，导致苗种阶段死亡率高达70％以上。一些学者虽然针对鲆鲽类腹水病的病原和病理开展过一些研究，但这些研究主要是针对自然发病的病鱼进行迟钝爱德华氏菌的分离、鉴定及抗菌素类药物防治等(王印庚等，2007；秦雷等，2009)。尽管采取抗菌素类药物等传统的防病措施对腹水病的治疗有一定效果，但仍无法从根本上解决病害频发及其导致的重大经济损失等问题；并且抗菌素类药物容易在鱼体内积累、对消费者的健康具有潜在危害、容易使病原菌产生抗药性以及严重污染养殖环境等问题，因此在鱼类养殖业中的应用越来越受到限制；同时抗菌素的使用也不能满足人们日益增长的对无药物残留绿色水产品的需求。因此，采用现代生物技术培育抗迟钝爱德华氏菌病能力强、生长速度快的牙鲆新品种，已成为海洋渔业科技工作者必须解决的重大课题，也是解决牙鲆病害问题的根本途径。在海水鱼类遗传育种研究方面，迄今主要在牙鲆、大菱鲆和大黄鱼上开展了人工雌核发育、单性苗种培育及快速生长良种选育的研究工作(王新成等，1997；王晓清等，2006；苏鹏志等，2008；陈松林等，2008)，同时，还开展了一些分子标记筛选和遗传多样性评价、种质鉴定以及抗鳗弧菌病相关MHC基因标记筛选等方面的研究工作，如邹曙明等(2000)采用RAPD技术对牙鲆和大菱鲆养殖群体遗传结构进行的检测分析；尤峰等(2001)采用同工酶技术对山东近海牙鲆和养殖牙鲆的遗传多样性进行的分 析；Liu等(2005a，b)利用微卫星标记和AFLP技术评价牙鲆养殖群体和野生群体的遗传结构，表明养殖群体的遗传多样性具有一定程度的下降；陈微等(2005)开展了牙鲆微卫星标记筛选和遗传多样性的分子研究；张玉喜等(2006)分析了牙鲆抗鳗弧菌病群体和不抗病群体的MHC基因多态性，初步筛选到抗鳗弧菌病相关的MHC基因型。尽管黄海水产研究所陈松林等人已经对牙鲆抗鳗弧菌病群体和家系筛选开展过大量研究，筛选出抗鳗弧菌病群体和家系(陈松林等，2008)，但这些群体和家系仅仅只是针对鳗弧菌这一单一病原具有一定抗性，因而还满足不了牙鲆养殖产业中对抗病家系的迫切需求。因此，抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆家系的选育就显得格外重要，也是牙鲆养殖业中急需攻克的重大课题。而有关牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病家系的构建及优良品系选育技术，迄今国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是建立一种牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系选育方法，弥补现有技术的不足，为鱼类抗迟钝爱德华氏菌病优良品种培育提供技术方法，解决牙鲆养殖业中缺乏抗迟钝爱德华氏菌病优良品系选育方法的问题，为鱼类养殖业提供抗病优良品系选育的技术手段。
本发明牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系选育方法，包括有如下的步骤：
1)抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆群体的筛选：采用自然选择途径或人工感染途径筛选牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病的群体；
2)抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆家系的选育：将培养成熟的牙鲆抗爱德华氏菌病群体进行不同地理群体杂交来建立牙鲆家系，当不同牙鲆家系鱼苗生长至10-12厘米时，采用迟钝爱德华氏菌对构建的家系鱼苗进行人工感染，筛选出抗迟钝爱德华氏菌病家系；
3)牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病家系特异微卫星标记的筛选：通过牙鲆多态性微卫星标记引物对筛选出的牙鲆抗病家系进行基因分型，筛选出牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病家系的特异微卫星标记；
4)牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病品系的选育：采用筛选到的牙鲆抗病家系与其它家系进行交配，建立抗病家系的后代家系，采用特异的微卫星标记对建立的牙鲆家系进行鉴定，筛选出牙鲆抗病家系的后代家系；然后对获得的后代家系再次进行抗迟钝爱德华氏菌感染的筛选，将感染后存活率高的家系确定为抗迟钝爱德华氏菌病品系；
5)通过混合养殖鱼苗的成活率高低筛选抗病优良品系：采用筛选到的牙鲆抗病家系与其它家系进行交配，建立抗病家系的后代家系，当各家系鱼苗生长至10-12厘米时，每个家系取200-250尾鱼苗进行荧光标记，每个家系标记一种颜色，然后将标记了不同颜色的家系鱼苗混合养殖，混合养殖1年后进行体长、体重测量，统计存活鱼的数量，筛选出抗迟钝爱德华氏菌病品系。
6)将获得的抗迟钝爱德华氏菌病品系作为亲本来繁育抗迟钝爱德华氏菌的牙鲆苗种。
作为优选，上述步骤3)中的微卫星标记为scaffold774_63384，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
用于检测微卫星标记scaffold774_63384的引物对，其序列信息如下：
F:GTGACCCTGAGTAGGATAAGCG(SEQ ID NO:2)
R:GTGTTTACGTGACAAGCACCAC(SEQ ID NO:3)。
上述微卫星标记，其一种基因型组成包含有187-189bp和175-177bp的2个等位基因；另一种基因型包含有183-185bp和175-177bp的两个等位基因。
步骤4)中对获得的后代家系再次进行抗迟钝爱德华氏菌感染的筛选，另一种方法如下：通过混合养殖鱼苗的成活率高低筛选抗病优良品系：采用筛选到的牙鲆抗病家系与其它家系进行交配，大量建立抗病家系的后代家系，当各家系鱼苗生长至10-12厘米时，每个家系取200-250尾鱼苗进行荧光标记，每个家系标记一种颜色，然后将标记了不同颜色的家系鱼苗混合养殖在同一个水泥池中，混合养殖1年后进行体长、体重测量，统计存活鱼的数量，计算不同家系的养殖成活率，将养殖成活率高的家系定义为抗病家系，据此筛选出抗迟钝爱德华氏菌病品系。
附图说明：
图1：牙鲆抗病家系的筛选，2007年建立的牙鲆家系鱼苗人工感染迟钝爱德华氏菌后存活率的比较。横坐标是家系号，纵坐标是感染后成活率；
图2：牙鲆抗病家系特异微卫星标记的筛选及其在后代中的遗传
A:牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病家系特异微卫星标记的筛选：采用微卫星标记scaffold774_63384鉴定不同家系电泳图；图中有5个家系，每个家系8个个体，依次排列为40个泳道，其中17-24泳道为抗病家系F0768。由图可见该标记在F0768家系个体中均可扩增出两条DNA条带，其中较小的条带(175-177bp)为该家系不同个体所共有，较大的条带(187-189bp或183-185bp)在不 同的个体中存在两种形式，每个个体的两条DNA条带组合起来，与其他家系存在明显不同，可用于区分F0768家系与其他牙鲆家系。
B:牙鲆抗病家系特异微卫星标记在子代中的遗传
标记scaffold774_63384在F0768家系个体及其后代家系F1323中的DNA电泳图，M为Marker，1和2为F0768家系中的2个个体，代表2种不同的基因型：AC和BC基因型；3-9为0768家系的后代F1323家系个体，可见基因型为BC、CC，因此可以推断，建立F1323家系所用父母本，其中之一为F0768家系个体，在该位点基因型BC，而来自于其他家系的另一个体基因型为CC，因而子代中有BC、CC两种基因型，每个子代个体的其中一条DNA条带遗传自F0768家系的鱼(A、B、C三种条带大小分别为187-189bp、183-185bp和175-177bp)
图3：牙鲆抗病家系后代鱼苗人工感染迟钝爱德华氏菌后成活率比较
横坐标是家系号，纵坐标是感染后成活率。抗病家系F0768的后代家系F1333、F1323和F1337在迟钝爱德华氏菌感染后的存活率显著高于其他家系，表现出抗迟钝爱德华氏菌的能力。
图4：牙鲆抗病家系后代鱼苗在同一水泥池中养殖335-360天后的成活率比较
横坐标是家系号，纵坐标是养殖成活率。2012年建立的53个家系鱼苗的养殖存活率差异显著，其中2007年建立的抗病家系F0768的后代家系F1228和F1263的养殖存活率分别为82.8％和74.4％，明显优于其他家系。
图5：不同家系对迟钝爱德华氏菌感染的反应
易感家系在注射迟钝爱德华氏菌后第3天开始出现死亡，第5～6天进入死亡高峰期，第8天即达到稳定状态；抗病家系在注射后第5天开始出现死亡，第6～8天进入死亡高峰期，第10天达到稳定状态。易感家系人工感染后，发病早，死亡迅速，发病周期短，死亡率高。抗病家系表现为发病晚，死亡慢，发病周期较长。两者患病个体症状无差异，抗病家系的最终存活率明显比易感家系高。
具体实施方式
本发明通过长期的研究建立了牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系选育方法，主要包括如下的步骤：迟钝爱德华氏菌感染牙鲆鱼苗及其抗病力测定方法、抗迟钝爱德华氏菌病群体筛选方法、抗迟钝爱德华氏菌病家系筛选方法以及抗迟钝爱德华氏菌病家系特异微卫星标记筛选方法等，筛选到抗病家系特异 微卫星标记；建立了抗病家系后代抗病力和养殖成活率测试方法，创制了牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系。
对于本发明中所用到的术语，解释如下：
1、群体：主要指不同地理群体和抗病群体，不同地理群体指中国黄渤海野生群体、日本牙鲆群体、韩国牙鲆群体等；抗病群体指在迟钝爱德华氏菌病发病后自然存活的牙鲆鱼苗以及通过人工感染迟钝爱德华氏菌后存活的鱼苗。
2、家系：是由1尾雄鱼的***和1尾雌鱼的卵子授精而获得的鱼苗。
3、品系：指经过2代选育后、性状稳定的家系。
下面结合附图，对发明的方法进行详细叙述。
1.抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆群体的筛选：采用自然选择途径或人工感染途径筛选牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病的群体。具体事例如下：
1)迟钝爱德华氏菌的培养及其对牙鲆鱼苗的感染方法：首先用划线法将迟钝爱德华氏菌接种在TSA培养基平板上，28℃培养24h，挑取单菌落接种于灭菌的TSB液体培养基中，接种后的培养基放置于震荡培养箱中，在28℃,200r/min的条件下培养约24h,测定OD600值，培养至菌液浓度达到1.0OD时，即对数生长中期，取出菌液，4℃保存备用。
当牙鲆鱼苗生长至10-12厘米时，进行人工感染实验，实验前一天停止投喂饲料，从每个家系中各随机选取7尾牙鲆个体，平均放到7个浓度梯度的鱼缸中，每个浓度梯度共32尾。用灭菌的PBS溶液把原菌液稀释到1.0OD，测得菌液浓度为4.33×109CFU/mL。将菌液分别按照不稀释、稀释50倍、100倍、500倍、1000倍和10000倍建立6个浓度梯度，另加一个对照组为灭菌PBS溶液，共7组进行感染，各组分别编号为A1、A2、A3、A4、A5、A6和A7。按照病原菌感染牙鲆鱼苗的常规腹腔接种法进行迟钝爱德华氏菌的感染。菌液剂量为0.2mL/10g体重。感染后观察鱼苗患病情况，记录鱼苗开始死亡时间和死亡鱼苗数量，统计鱼苗存活率。根据每个浓度梯度的死亡率，结合实际情况，计算出迟钝爱德华氏菌对牙鲆的半致死浓度LD50为3.69×105CFU/mL。
人工感染前，将培养好的菌液以8000r/min的转速离心15min，每次离心后倒掉上清液，并用1×PBS吹洗，连续3次，最后测定OD600的菌液值，将菌液用1×PBS稀释到上步所得半致死浓度，进行感染。
在确定了迟钝爱德华氏菌对牙鲆半致死浓度后，从每个家系中随机抽取75尾个体，按照0.2mL/10g体重的剂量腹腔接种感染半致死浓度的菌液，并 设置1次重复实验。实验时水温控制在(19±1)℃，每个家系实验用鱼独立养殖，保持正常的流水和通气。病原菌感染后每2h观察一次，记录每个家系实验鱼的体色变化、活动力大小、摄食强弱、有无发病症状和死亡时间等信息，及时捞出死鱼，测量其全长(从吻端到尾鳍末端)、体重，并剪取鳍条保存，在感染结束时，记录每个家系存活鱼的数目，测量每个个体全长和体重，并剪取少量鳍条保存。
2)抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆群体的筛选
通过2种途径筛选抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆群体。第一种途径是从牙鲆养殖场发病的牙鲆鱼苗中选育抗爱德华氏菌病牙鲆群体的方法。每年8-10月份山东等沿海地区水温较高，病原菌较多，牙鲆鱼苗极易出现各种疾病，特别是迟钝爱德华氏菌等细菌性疾病极易感染鱼苗引起腹水病，常常导致养殖的牙鲆鱼苗大量死亡，但在一个池塘中总有些抗病力比较强的鱼苗存活下来。因此，通过调查山东沿海地区多个牙鲆养殖场的牙鲆鱼苗患病情况，在确认某个养殖池塘的牙鲆鱼苗是因迟钝爱德华氏菌感染后幸存下来的，就将这些存活下来的鱼苗收集起来，一般应选择那些85-95％以上的鱼苗死亡、而只有约5-15％的鱼苗存活下来的池塘收集幸存鱼苗进行培养。将这些幸存的抗病鱼苗培育成亲鱼，达到性成熟，作为牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病群体。抗病群体一般应由至少100尾以上抗病个体组成。抗病牙鲆群体的养殖和繁殖按照常规方法进行。
第二种途径是通过人工感染的途径制备抗病牙鲆群体，按照1中所述方法对全长9-12厘米的牙鲆普通鱼苗进行迟钝爱德华氏菌感染，从中筛选出抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆群体。
2.抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆家系的选育
将培养成熟的牙鲆抗爱德华氏菌病群体与牙鲆不同地理群体进行杂交，建立牙鲆家系，当不同牙鲆家系鱼苗生长至10-12厘米时，采用迟钝爱德华氏菌对构建的家系鱼苗进行人工感染，比较不同家系鱼苗感染后的成活率，筛选出抗迟钝爱德华氏菌病家系。
本发明中，将培养成熟的牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病群体与不同地理群体(日本群体和黄渤海野生群体等)进行杂交。将1尾雌鱼的50-100毫升卵和1尾雄鱼的约0.1-0.5毫升***授精后放在一个30-40立方米的小网箱中孵化，大约36小时候后，收集孵化出膜前的胚胎放在1个3立方米的圆形水缸内进行育苗，共建立了40个家系。牙鲆家系的培育和日常管理按照常规方法进行。
当不同家系鱼苗生长至10-12厘米时，采用迟钝爱德华氏菌等病原菌对各个家系鱼苗进行人工感染。比较不同家系鱼苗感染后的成活率，将感染实验中成活率居前2-4名的家系的成活率作为确定抗病家系的数值，比如本发明中有3个家系的成活率在70％以上，所以选择成活率在70％以上的家系为抗病家系，而将成活率在30％-70％的家系确定为比较抗病家系，成活率为30％以下的定为不抗病家系。
从建立的牙鲆家系中选取25个家系进行感染，发现不同家系感染后的存活率显著不同。筛选出感染后成活率在70％以上的家系4个，将其确定为抗病家系，其中存活率最高的家系其存活率为86.7％(0768号家系)，其次家系感染后存活率为83％(0779家系)，这2个抗病家系的存活率显著高于所有家系感染后的平均存活率50.4％(p<0.05)；筛选出比较抗病的家系12个，其感染后存活率为30-70％；筛选出不抗病家系9个，其中0729和0747号家系的感染后存活率均为0，为最不抗病家系(表1和图1)。
表1：不同牙鲆家系病原菌感染后的存活率
3.牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病家系特异微卫星标记的筛选
通过牙鲆多态性微卫星标记引物对筛选出的牙鲆抗病家系进行基因分型，筛选出牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病家系的特异微卫星标记。
本发明中，采用中国水产科学研究院黄海水产研究所筛选的牙鲆多态性微卫星标记引物对筛选出的牙鲆抗病家系进行分析，筛选出可与其它家系区分开的抗病家系特异的微卫星标记，用于辅助牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病家系的选育。经过对20个微卫星标记的比较筛选后确定采用牙鲆多态性微卫星标记scaffold774_63384(核苷酸序列为SEQ ID NO:1)进行抗病家系的鉴定。
选取0768、0780、0781、1320、1328等牙鲆家系，剪取不同家系鱼苗及其亲本鳍条，置于1.5mL离心管中，在每个装有鳍条的离心管中加入500μL裂解液和15μL蛋白酶K，55℃水浴裂解1小时，期间轻摇数次以加速裂解。将裂解好的离心管取出，加入500μL酚：氯仿：异戊醇，颠倒轻摇10min,12000转离心10min，取上清液450μL加入提前准备好对应编号装有500μL酒精的离心管中，轻摇30次，12000转离心5min，可见白色DNA沉淀于离心管底部。倒掉离心管中的液体，将DNA沉淀晾干，加入100μLddH2O,涡旋两次使DNA充分溶解。
使用scaffold774_63384引物(引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)对提取的牙鲆基因组DNA进行PCR扩增，反应体系为15μL，包括10×buffer1.5μL、dNTP0.8μL、上下游引物各0.6μL、模板DNA1μL、ddH2O11.3μL，最后加入rTaq酶0.2μL。反应程序为95℃10分钟，95℃变性、54℃复性、72℃延伸35个循环，72℃10分钟后冷却。
对不同家系鱼苗的PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，发现该微卫星标记在不同家系中出现不同的基因型，其中，在抗病家系F0768中扩增出3种特异的DNA片段分别为(A、B、C三种条带大小分别为187-189bp、183-185bp和175-177bp)，每个F0768家系的个体包括其中2种DNA条带,所组合而成的基 因型与其他家系明显不同(图2A)。由此筛选出牙鲆抗病家系0768的特异微卫星标记，可用于区分抗病家系0768和其它不抗病家系鱼苗。
4.牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病品系的选育：
采用筛选到的牙鲆抗病家系与其它家系进行交配，建立抗病家系的后代家系，采用特异的微卫星标记对建立的牙鲆家系进行鉴定，筛选出牙鲆抗病家系的后代家系；然后对获得的后代家系再次进行抗迟钝爱德华氏菌感染的筛选，根据所有家系存活率的实际情况，将存活率位于前10-15％的抗病家系的后代家系定义为抗病品系。
在本发明中，采用抗病家系0768特异的微卫星标记scaffold774_63384可以鉴定某个家系鱼苗是否为抗病家系0768的后代。剪取不同家系鱼苗的鳍条，提取基因组DNA，采用微卫星标记scaffold774_63384进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳，如果是抗病家系0768的后代，必定含有0768的微卫星标记条带。采用这个特异标记发现抗病家系0768的后代家系F1323家系的每个个体均遗传到一条F0768家系的DNA条带(图2B)。由此表明该特异标记scaffold774_63384可以鉴定抗病家系0768的后代，可用于辅助牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病品系的选育。
在本发明中，在采用迟钝爱德华氏菌感染前，先确定迟钝爱德华氏菌液对牙鲆家系鱼苗的半致死浓度LD50为3.69×105CFU/mL。从每个家系中随机抽取150尾鱼苗，分2批进行感染，每批每个家系感染75尾鱼苗。按照0.2mL/10g体重的剂量进行迟钝爱德华氏菌人工感染，设置1次重复。人工感染时水温控制在19±1℃。感染后16天内统计各家系存活鱼苗数量，计算每个家系的感染存活率。
本发明中以建立的牙鲆抗病家系0768和快速生长家系等为亲本交配建立了牙鲆家系32个，在用微卫星标记进行第一次筛选后，再次对这些家系进行迟缓爱德华氏菌感染。当各家系鱼苗生长到全长9-12厘米(5月龄)时，进行病原菌感染实验，感染实验前一天停止投喂饲料，从每个家系中各随机选取7尾鱼苗，平均放到7个浓度梯度的鱼缸中，每个浓度梯度共32尾。用灭菌的PBS溶液把原菌液稀释到1.0OD，测得菌液浓度为4.33×109CFU/mL。将菌液分别按照0倍稀释、50倍稀释、100倍稀释、500倍稀释、1000倍稀释和10000倍稀释建立6个浓度梯度，另加一个对照组为灭菌PBS溶液，共7组进行注射，各组分别编号为A1、A2、A3、A4、A5、A6和A7。按照常规的腹腔感染法进行迟钝爱德华氏菌感染，感染剂量为0.2mL/10g体重菌液，感染后每 2h观察一次，记录结果。7天后，A7(对照组)没有出现死亡，A1(原菌液)组全部死亡，其他家系出现不同程度的死亡。根据每个浓度梯度的死亡率，结合实际情况，计算出此次预实验迟钝爱德华氏菌对牙鲆的半致死浓度LD50为3.69×105CFU/mL。感染结果表明不同家系对病原菌感染的抵抗能力存在明显差别，在对32个家系的4800尾9-12厘米(5月龄)鱼苗进行迟钝爱德华氏菌人工感染后，第1～3天，所有家系鱼摄食量和活力明显下降，缸底出现数量不同的白便，游动变缓，偶有上浮，第3天开始出现死鱼，无明显症状。第4天大部分家系鱼已出现死亡，部分家系鱼苗腹部不同程度***。第5-6天为死亡高峰期，实验第12天，所有家系日死亡数低于10尾，第16天未再出现死亡，实验结束，整个实验过程中有95％以上死亡个体出现腹水。各家系存活率在8.2％～50.9％之间，平均存活率为31.2％。将32个家系按照抗病力从高到低排序，如图3所示，筛选出抗病力强的家系4个，分别为F1334，F1333，F1323和F1337，其感染后存活率在45％以上，明显高于所有家系感染的平均存活率(表2和图3)(P<0.05)。在这4个抗迟钝爱德华氏菌感染的家系中，有3个家系(1323、1333和1337)是2007年筛选出的抗病家系0768的后代。由此可见，0768家系的后代普遍具有较强的抗爱德华氏菌感染的能力。从而证明0768家系的抗病能力可以遗传给后代，从而筛选出牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系。
表2：2013年牙鲆家系感染迟钝爱德华氏菌后的存活率比较
5.通过混合养殖鱼苗的成活率高低筛选抗病优良品系：
采用筛选到的牙鲆抗病家系与其它家系进行交配，大量建立抗病家系的后代家系，当各家系鱼苗生长至10-12厘米时，每个家系取200-250尾鱼苗进行荧光标记，每个家系标记一种颜色，然后将标记了不同颜色的家系鱼苗混合养殖在同一个水泥池中，混合养殖1年后进行体长、体重测量，统计存活鱼的数量，计算不同家系的养殖成活率，将养殖成活率居前10-15％的家系定义为抗病家系，据此筛选出抗迟钝爱德华氏菌病品系。
本发明中，2012年，采用2007年筛选到的牙鲆抗病家系0768等与其它家系进行交配，建立了53个家系。当各家系鱼苗生长至10-12厘米时，每个家系取200-250尾鱼苗进行荧光标记，每个家系标记一种颜色，然后将标记了不同颜色的家系鱼苗混合养殖在同一个水泥池中，混合养殖1年后将同一个水泥池中养殖的所有鱼苗进行体长、体重测量，统计存活鱼的数量，计算不同家系的养殖成活率，将养殖成活率在70％以上的家系定义为抗病家系，据此筛选出抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆品系。
2014年，通过对2012年建立的53个家系苗种混合养殖后的成活率分析，发现0768后代家系1228和1263的养殖存活率最高，分别为82.8％和74.4％，明显高于所有家系的平均养殖存活率(28％)(表3)(P<0.05)(图4)，其养殖成活率平均提高50％左右。由此表明0768家系的后代不仅具有抗迟钝爱德华氏菌人工感染的能力，而且其在养殖过程中能够抵抗迟钝爱德华氏菌等病原微生物的侵袭，明显提高牙鲆苗种的养殖成活率。
表3：2014年测量2012年建立的牙鲆家系的养殖成活率及日增重结果汇总
6.牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系的筛选与应用
将获得的抗迟钝爱德华氏菌病品系作为亲本来繁育抗迟钝爱德华氏菌的牙鲆苗种。将人工感染迟钝爱德华氏菌后存活率高的家系以及混合养殖后成活率高的家系筛选出来培育成熟并作为亲本繁育后代，即可大量生产抗腹水病的牙鲆优良苗种。
上述的结果表明，采用本发明技术生产的牙鲆苗种具有抗迟钝爱德华氏菌病能力强、养殖成活率高、死亡率低、生长速度较快的特点，基本解决了牙鲆苗种夏季因感染迟钝爱德华氏菌而爆发腹水病引起大量死亡的问题，适合在全国沿海地区牙鲆养殖场推广应用。
Claims (7)
1.一种牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系选育方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤：
1)抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆群体的筛选：采用自然选择途径或人工感染途径筛选牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病的群体；
2)抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆家系的选育：将培养成熟的牙鲆抗爱德华氏菌病群体进行不同地理群体杂交来建立牙鲆家系，当不同牙鲆家系鱼苗生长至10-12厘米时，采用迟钝爱德华氏菌对构建的家系鱼苗进行人工感染，筛选出抗迟钝爱德华氏菌病家系；
3)牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病家系特异微卫星标记的筛选：通过牙鲆多态性微卫星标记引物对筛选出的牙鲆抗病家系进行基因分型，筛选出牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病家系的特异微卫星标记；
4)牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病品系的选育：采用筛选到的牙鲆抗病家系与其它家系进行交配，建立抗病家系的后代家系，采用特异的微卫星标记对建立的牙鲆家系进行鉴定，筛选出牙鲆抗病家系的后代家系；然后对获得的后代家系再次进行抗迟钝爱德华氏菌感染的筛选，将感染后存活率高的家系确定为抗迟钝爱德华氏菌病品系；
5)通过混合养殖鱼苗的成活率高低筛选抗病优良品系：采用筛选到的牙鲆抗病家系与其它家系进行交配，建立抗病家系的后代家系，当各家系鱼苗生长至10-12厘米时，每个家系取200-250尾鱼苗进行荧光标记，每个家系标记一种颜色，然后将标记了不同颜色的家系鱼苗混合养殖，混合养殖1年后进行体长、体重测量，统计存活鱼的数量，筛选出抗迟钝爱德华氏菌病品系；
6)将获得的抗迟钝爱德华氏菌病品系作为亲本来繁育抗迟钝爱德华氏菌的牙鲆苗种。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中的微卫星标记为scaffold774_63384，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的微卫星标记的检测引物的序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的微卫星标记的一种基因型组成包含有187-189bp和175-177bp的两个等位基因。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的微卫星标记的一种基因型包含有183-185bp和175-177bp的两个等位基因。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤4)中筛选出牙鲆抗病家系的后代家系，是用人工感染迟钝爱德华氏菌方式筛选的。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤4)中对获得的后代家系再次进行抗迟钝爱德华氏菌感染的筛选，其筛选方法如下：通过混合养殖鱼苗的成活率高低筛选抗病优良品系：采用筛选到的牙鲆抗病家系与其它家系进行交配，大量建立抗病家系的后代家系，当各家系鱼苗生长至10-12厘米时，每个家系取200-250尾鱼苗进行荧光标记，每个家系标记一种颜色，然后将标记了不同颜色的家系鱼苗混合养殖在同一个水泥池中，混合养殖1年后进行体长、体重测量，统计存活鱼的数量，计算不同家系的养殖成活率，将养殖成活率高的家系定义为抗病家系，据此筛选出抗迟钝爱德华氏菌病品系。
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|---|---|---|---|---|
| CN107232095A (zh) * | 2017-06-05 | 2017-10-10 | 舟山市普陀兴海养殖优质种苗选育研究所 | 一种牙鲆抗爱德华氏菌病优良品种的人工选育方法 |
| CN110463659A (zh) * | 2019-09-11 | 2019-11-19 | 内江师范学院 | 一种抗鮰爱德华氏菌杂交黄颡鱼优良品系选育方法 |
| CN111278994A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-06-12 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种牙鲆抗病育种基因芯片及其应用 |
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| CN104304096B (zh) | 2016-01-27 |
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