CN104302670A - 制造用于经皮给药的透明质酸-蛋白结合体的方法以及由该方法制造的用于经皮给药的透明质酸-蛋白结合体 - Google Patents
制造用于经皮给药的透明质酸-蛋白结合体的方法以及由该方法制造的用于经皮给药的透明质酸-蛋白结合体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104302670A CN104302670A CN201380018200.3A CN201380018200A CN104302670A CN 104302670 A CN104302670 A CN 104302670A CN 201380018200 A CN201380018200 A CN 201380018200A CN 104302670 A CN104302670 A CN 104302670A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hyaluronic acid
- hgh
- hyaluronic
- aldehyde
- protein binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 75
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 12
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 87
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 83
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 80
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 33
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 14
- -1 amylalcohol amine Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 9
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical group [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- VYSYZMNJHYOXGN-UHFFFAOYSA-N ethyl n-aminocarbamate Chemical group CCOC(=O)NN VYSYZMNJHYOXGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- KGWDUNBJIMUFAP-KVVVOXFISA-N Ethanolamine Oleate Chemical compound NCCO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O KGWDUNBJIMUFAP-KVVVOXFISA-N 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 claims description 3
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- DKACXUFSLUYRFU-UHFFFAOYSA-N tert-butyl n-aminocarbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NN DKACXUFSLUYRFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BLFRQYKZFKYQLO-UHFFFAOYSA-N 4-aminobutan-1-ol Chemical compound NCCCCO BLFRQYKZFKYQLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 2
- WUGQZFFCHPXWKQ-UHFFFAOYSA-N Propanolamine Chemical compound NCCCO WUGQZFFCHPXWKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 claims description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 2
- XMYQHJDBLRZMLW-UHFFFAOYSA-N methanolamine Chemical group NCO XMYQHJDBLRZMLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000007347 radical substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 31
- 230000037317 transdermal delivery Effects 0.000 abstract description 25
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 abstract description 8
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 abstract 1
- 238000013271 transdermal drug delivery Methods 0.000 abstract 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 46
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 39
- 230000008569 process Effects 0.000 description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 23
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 19
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 206010018873 Haemoconcentration Diseases 0.000 description 9
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 9
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 9
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 9
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 8
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 8
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 8
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 7
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 6
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 241000872931 Myoporum sandwicense Species 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000000516 activation analysis Methods 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 0 CCC1(CC(C[C@@](C*([C@@]2C(*)C2)=C(C)CC)*2)*2=*=C)*C1 Chemical compound CCC1(CC(C[C@@](C*([C@@]2C(*)C2)=C(C)CC)*2)*2=*=C)*C1 0.000 description 3
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N benzyl N-[2-hydroxy-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]carbamate Chemical compound OC1=C(NC(=O)OCC2=CC=CC=C2)C=CC(=C1)N1CCOCC1=O FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100317264 Caenorhabditis elegans wts-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 102000015617 Janus Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010024121 Janus Kinases Proteins 0.000 description 2
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- SYECJBOWSGTPLU-UHFFFAOYSA-N hexane-1,1-diamine Chemical compound CCCCCC(N)N SYECJBOWSGTPLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N n'-hydroxybutanediamide Chemical compound NC(=O)CCC(=O)NO HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007142 ring opening reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 101001054921 Homo sapiens Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026849 Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010033733 Papule Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010040880 Skin irritation Diseases 0.000 description 1
- 125000000738 acetamido group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)N([H])[*] 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 125000005336 allyloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000000976 ink Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037368 penetrate the skin Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036556 skin irritation Effects 0.000 description 1
- 231100000475 skin irritation Toxicity 0.000 description 1
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
- A61K31/728—Hyaluronic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
- A61K8/73—Polysaccharides
- A61K8/735—Mucopolysaccharides, e.g. hyaluronic acid; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
- C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08H—DERIVATIVES OF NATURAL MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08H1/00—Macromolecular products derived from proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
- C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L89/00—Compositions of proteins; Compositions of derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
- A61K2800/57—Compounds covalently linked to a(n inert) carrier molecule, e.g. conjugates, pro-fragrances
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
- A61K2800/91—Injection
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Birds (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Mycology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
本发明涉及用于药物的经皮给药的剂型及其制造方法。更特别地，涉及用于经皮给药的药物给药体的制造方法、由该方法制造的用于经皮给药的药物给药体及其用途，通过使用具有生物适应性、生物降解特性和经皮给药特性的给药体，能够适用于包括疫苗的各种各样的蛋白药品及化学药品的经皮药物给药***，能够安全地适用于人体，并且使得蛋白的生物活性最大化、生物结合效率高、药效保持时间增加。
Description
技术领域
本发明涉及经皮给药***以及制造该经皮给药***的方法。更特别地，通过使用具有生物适应性、生物降解能力和经皮给药能力的给药***，本发明提供一种经皮给药***和制造该经皮给药***的方法，对于各种蛋白、化学药物和疫苗都是安全的给药工具，并提供一种最有效的经皮给药方式，能够对具有最大生物活性的、强生物结合的和长期疗效的蛋白进行给药。
背景技术
经皮给药***是将有效成分通过皮肤进行给药，具有无疼痛、自我给药和可在任何时间处理等优点。
但是，只有少量的药物才能渗透过作为外部物质的最初屏障的皮肤，经皮给药***尚未被积极地采用。
因此，为了通过提高皮肤组织屏障的渗透性来增加穿过皮肤的量，正在积极进行对使用微芯片的补丁***(patch system)的研究、以及对使用外部刺激例如超声波、电场等的经皮给药***的研究。
包括精密成型的微芯片的补丁在制造方面存在困难且成本高。在使用外部刺激来提高皮肤渗透性的给药***的情况下，因为需要设备和刺激，会丧失经皮给药***的优点。
因此，对于具有高皮肤渗透性和有效经皮给药能力的，不需要设备和外部刺激的经皮给药***提出了需求。
发明内容
为了克服现有技术的问题，本发明提供一种制备透明质酸(HA)-蛋白结合体的方法、由该方法制备的HA-蛋白结合体及其应用，其中，HA-蛋白结合体可以被用作经皮给药***，该经皮给药***能够维持蛋白质药物的最大生物活性，并具有强生物结合效率，且能够用于多种水溶性活性成分。
在研究中，本发明的发明人发现，使用透明质酸的经皮给药***与注射相比使用起来更简单，且给药效率更高，尽管透明质酸的分子量高，但其具有优异的经皮能力。此外，发明人发现，由于人体皮肤上存在HA受体因而细胞的生长可以被浓度控制，并且可以在例如皮肤组织再生和化妆品的应用中有用。特别地，本发明中，被转送给透明质酸的蛋白的结合是在特定pH条件下进行的，防止具有胺基的其他氨基酸的反应，例如蛋白质中的赖氨酸，从而增加最大活性、生物结合效率和有效性的持续时间。
根据本发明的实施方式，提供一种制备透明质酸-蛋白结合体的方法，包括制备由化学式1所表示的透明质酸-醛(HA-醛)的第1步骤，和该透明质酸-醛与水溶性蛋白的N-末端反应的第2步骤。
根据该方法，提供由化学式2所表示的透明质酸-蛋白结合体。
[化学式1]
在化学式1中，
m和n的合计为50至10000的整数，且
n为5至5000的整数。
[化学式2]
化学式2中，
P是水溶性蛋白，
m、n和l的合计为50至10000的整数，
n和l的合计为5至5000的整数，且
l是1至100的整数。
以下，详细说明根据本发明的实施方式的透明质酸-蛋白结合体及其制备方法。
本发明的透明质酸在生物适应性、生物降解和经皮给药方面有很多优点，因而可以安全地用于人体，用于各种蛋白药物、化学药物以及抗原蛋白的经皮给药(实验例8至13)。
这里，术语“透明质酸(Hyaluronic acid,HA)”只要没有其他清楚的描述和规定，则指含有以下通式1所表示的重复单元的聚合物、其盐和衍生物。
[通式1]
在通式1中，m是50至10000的整数。
术语“透明质酸衍生物”是指透明质酸的全部衍生物，其包括将诸如胺基、醛基、乙烯基、硫醇基、烯丙氧基、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸盐(SPDP)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的取代基，导入到透明质酸的基本骨架结构等。透明质酸的衍生物的例子包括HA-二氨基丁烷、HA-己二胺、HA-醛、HA-己二酸二酰肼(HA-ADH)、HA-2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐、HA-精胺、HA-亚精胺、HA-SPDP、HA-NHS等。
术语“羧基的取代率”是指含有取代羧基的重复单元相对于HA衍生物中全部重复单元的摩尔比例或摩尔百分比。因此，取代率能够大于0但小于1，或大于0mol％但小于100mol％。
用于制备HA衍生物的HA存在于大多数的动物中，是具有生物降解性和生物相容性的线状寡糖，不具有免疫原性。由于HA在体内基于其分子量来承担不同的角色，其能够发挥各种作用。
在制备根据本发明的透明质酸-蛋白结合体的过程中，对于可以使用的透明质酸、透明质酸的盐或透明质酸的衍生物没有限制，可以优选具有10000至3000000Da的分子量，这样适用于制备给药***的结合体。
以下，参考反应流程1，更加详细地说明制备透明质酸-蛋白结合体的过程各个步骤。
[反应流程1]
在反应流程1中，m”、m、n、l和P与在通式1、化学式1和化学式2的限定相同。
制备透明质酸-醛(HA-醛)(化学式1)的第1步骤是指通过溶解透明质酸(HA)、透明质酸的盐或透明质酸的衍生物并和氧化剂在黑暗条件下反应来进行的纤维素的开环反应。在本发明的过程中，醛基被导入到开环结构，并且保留有能够与透明质酸受体反应的羧基，能够与作为活性成分的蛋白特定性结合，从而使透明质酸的经皮给药特性最大化。
本发明中使用的氧化剂可以是诱导开环反应的任何氧化剂，并优选过碘酸钠(NaIO4)。
在一个实施方式中，基于透明质酸、HA的盐或HA衍生物的单位，氧化剂可以以1至10摩尔倍的量来反应2至24小时，优选1至5摩尔倍来反应2至12小时。当使用以2摩尔倍的氧化剂进行第1步骤3小时时，10mol％被取代。当使用5摩尔倍氧化剂进行12小时时，产物具有50mol％的取代度。
反应氧化剂的上述范围的量能够使HA-醛衍生物具有10至50mol％的取代度。当取代度低于这一范围时，蛋白的反应量低，达不到所需的效果。当取代度高于这一范围时，具有过高取代的HA-醛衍生物难以与HA受体相互反应，导致靶向效果降低。
在与氧化剂反应后，优选用蒸馏水进行渗析来提纯产物。
第2步骤是使由第1步骤获得的透明质酸-醛衍生物与水溶性蛋白的N-末端反应来制由化学式2所表示的透明质酸-蛋白结合体，能够在pH5至7的缓冲溶液中进行，优选pH5至6.5的乙酸钠缓冲溶液。第2结合步骤中的该反应pH值能够阻止透明质酸-醛与具有胺基的氨基酸诸如赖氨酸反应，从而获得最大活性的蛋白，提高生物结合效率和药效保持时间。
特别地，透明质酸-醛溶解于缓冲溶液，之后与蛋白反应，在透明质酸-醛衍生物的醛基和蛋白的N-末端的胺基之间形成键合。
作为在N-末端具有胺基的蛋白，该蛋白可以被用于第2步骤而不需要另外的制备胺基的步骤。优选该蛋白能作为溶解了蛋白的水溶液来使用。
用于与透明质酸-醛衍生物生物结合的蛋白可以是任何能够在水溶液中溶解的蛋白而没有限制。优选该蛋白是用于预防和治疗需要长期定期治疗的疾病和与皮肤关联的健康状况的蛋白药物，例如包括hGH、α干扰素、红细胞生成素、TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，Tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand)和胰岛素。需要长期定期治疗的疾病和与皮肤关联的健康状况优选包括侏儒症、癌症、糖尿病、烧伤、特应性皮炎、牛皮癣、湿疹、皮炎、丘疹和带状疱疹。
优选，该蛋白是抗原蛋白，例如重组蛋白、醣蛋白和病原体的肽。
抗原蛋白与透明质酸或其衍生物的结合体会作为皮肤组织中免疫细胞的刺激朗氏细胞和树突细胞，与单独的抗原蛋白相比，诱导更强烈的免疫反应(实验例15)。
对于一个透明质酸-醛分子，优选使用1至10个分子的蛋白。相对于1个分子的HA具有1至10个蛋白的结合比的透明质酸-蛋白结合体，根据透明质酸衍生物的取代度，能够在体内保持24小时至96小时，能够被用于长期的给药***。由于具有良好的经皮给药特性，本发明的透明质酸-蛋白结合体能够被应用于与皮肤关联的疾病和/或化妆品，以及蛋白药物的各种的经皮给药***。
在一个实施方式的方法中，蛋白可以优选与添加的氰基硼氢化钠(NaCNBH3)反应。氰基硼氢化钠会还原在HA衍生物的醛基与蛋白的N-末端胺基反应后产生的双键。优选，可以添加的氰基硼氢化钠的量为透明质酸-醛的醛基的摩尔量的2至10摩尔倍，根据取代度，反应12至24小时。
由于醛基具有高活性，优选在第2步骤之后进一步进行第3步骤来封闭残余的醛基。与未反应醛基的封闭反应可以防止醛基与结合到透明质酸衍生物的蛋白的其他胺基进行反应，并防止透明质酸-蛋白结合体被引入人体后醛基与人体内的蛋白的非特应性反应，从而有效防止不希望的反应并提高反应效率。
用于封闭步骤的材料可以是任何能够与羧基或醛基反应的材料而没有限定，并优选胺类。封闭反应的示例示于反应流程2。
[反应流程2]
胺类可以是C1至C5直链或支链的肼基甲酸烷基酯，或C1至C5的低级烷醇胺。
肼基甲酸烷基酯优选为肼基甲酸乙酯或肼基甲酸叔丁酯，低级烷醇胺例如是乙醇胺(MEA)、甲醇胺、1-氨基-2-丙醇、1-氨基-3-丙醇、丁醇胺和戊醇胺，并优选乙醇胺。
作为胺类使用肼基甲酸烷基酯时，第3步骤可以示于反应流程3，并优选添加相对于化学式2的化合物中的醛基的摩尔量为5至10摩尔倍，进行反应12至24小时，来制备由化学式3表示的未反应的醛基被封闭的化合物。
[反应流程3]
当使用烷醇胺作为胺类时，优选添加相对于化学式2的化合物中的醛基的摩尔量为5至10摩尔倍来进行反应12至24小时。
胺类的上述量能够完全封闭未反应的醛基的反应。当添加的胺类少于上述量时，因不能确保完全封闭而不优选。
当使用肼基甲酸烷基酯作为胺类时，第3步骤优选在pH5至7的条件下进行，更优选在第1步骤的乙酸盐缓冲溶液中进行。
当使用烷醇胺作为胺类时，第3步骤优选在pH7至9的条件下进行，更优选在第1步骤的磷酸盐缓冲溶液中进行。
如上所述，在本发明的制备透明质酸-蛋白结合体的方法中，结合反应优选在水溶液中进行，能够被用于能在水溶液中溶解的水溶性肽和蛋白通过生物结合的给药***的制备。
在一个实施方式中，提供由化学式2所表示的透明质酸-蛋白结合体。
[化学式2]
化学式2中，
P是水溶性蛋白，
m、n和l的合计为50至10000的整数，
n和l的合计为5至5000的整数，且
l是1至100的整数。
透明质酸-蛋白结合体在体内是安全的，提高了通过与蛋白的特定氨基酸的反应而获得的最大活性的蛋白的生物适应性和药效保持时间，从而提供有效的经皮给药***。
透明质酸在化妆品中被用作保湿剂或抗皱剂。由于皮肤细胞诸如表皮层中的角化细胞和真皮层中的成纤维细胞具有透明质酸的受体，因此，皮肤细胞的生长可以由透明质酸的浓度来控制。各种免疫细胞都在皮肤组织中，并通过刺激皮肤细胞来诱导免疫反应活化。透明质酸可以被用于制备具有强免疫刺激活性的经皮给药疫苗组合物。因此，使用透明质酸并具有经皮特性的透明质酸-蛋白结合体可以被用作用于治疗与皮肤相关的疾病的制剂、蛋白药物的经皮给药***、化妆品、疫苗等。
在一个实施方式中，用于皮肤细胞再生的药物组合物、化妆品组合物和疫苗组合物以有效治疗量含有透明质酸-蛋白结合体。
这里，术语“有效治疗量”是指能够导致有益效果或期望的临床或生化结果诸如缓解、改善、稳定、恢复或延缓疾病进展的量。该有效治疗量可以以单一剂量或两份以上剂量来给药。
优选药物组合物、化妆品组合物或疫苗组合物能够进一步含有药学上可接受的稀释剂或载体、化妆品可接受的稀释剂或载体、或疫苗可接受的稀释剂或载体。稀释剂和载体的例子可以选自本领域技术人员所熟知的，例如赋形剂、添加剂、稳定剂等。
在本发明的一个实施方式中，提供一种由化学式2所表示的透明质酸-蛋白结合体的给药方法，包括制造透明质酸-蛋白结合体的步骤，和对所需的对象给予有效治疗量的透明质酸-蛋白结合体的步骤。
蛋白、透明质酸和治疗可接受的量与上述的内容相同，或能够由本领域技术人员来调节。
给药优选为经皮给药，且对象优选为哺乳动物。
本发明的透明质酸-生物药物结合体能够在水溶液中进行结合，因此，通过维持生物适应性的、生物可降解的透明质酸的经皮特性，可以适用于各种作为活性成分的水溶性肽和蛋白，适用于简单且安全的蛋白药物组合物、化妆品组合物和疫苗组合物。此外，透明质酸的醛衍生物能够在特定的pH条件下与蛋白的N-末端胺结合，而不与蛋白的其他胺反应。因此，在最大活性状态的蛋白能够与HA衍生物结合。本发明的透明质酸-蛋白结合体可以被有效地用于治疗与皮肤有关的疾病的制剂，蛋白药物的经皮给药***、化妆品和疫苗。
附图说明
图1是显示根据本发明的实施方式的含有醛基的HA衍生物以及使用该HA衍生物制备HA-蛋白结合体的方法的示意图。
图2是根据本发明的实施方式制备的HA-醛-TBC衍生物的1H-NMR分析结果。
图3a是实施例1中制备的HA-人体生长激素(HA-hGH)结合体和hGH的GPC分析结果，图3b是实施例2中制备的HA-卵清蛋白(HA-OVA)结合体和OVA的GPC分析结果。
图4显示包含于HA-hGH结合体中的HA的hGH分子的数量以及基于hGH分子数量的生物结合效率。
图5是比较hGH与透明质酸-hGH结合体的圆二色谱(CD)的分析结果。
图6a是ELISA/Bradford分析的比率，表示实施例1中得到的HA-hGH结合体和hGH的活性分析，图6b是ELISA/Bradford分析的比率，表示实施例2中得到的HA-OVA结合体和OVA的活性分析。
图7是实施例1中得到的HA-hGH结合体和hGH在人血清中的稳定性。
图8显示HA-hGH结合体和hGH在IM-9细胞(人B淋巴母细胞)中的细胞信号传导活性(A：在各种浓度的hGH下的hGH细胞信号传导活性，B：含有500ng/ml hGH的HA-hGH结合体的细胞信号传导活性，C：A和B的谱带强度定量分析结果)。
图9显示hGH和HA-hGH结合体在人体皮肤细胞Detroit551上处理的JAK2磷酸化程度(A：hGH受体的细胞信号传导活性的结果，从hGH处理后的JAK2磷酸化程度的测量中获得，B：hGH受体的细胞信号传导活性，从HA-hGH结合体处理后的JAK2磷酸化程度的测量中获得，C：A的谱带强度的定量分析曲线，D：B的谱带强度的定量分析曲线)。
图10显示受到在各种浓度的HA和HA-hGH结合体的透明质酸和HA-hGH结合体处理的人体皮肤细胞(HEKn，Detroit551)的细胞生长效果(A：由各种浓度的HA处理的HEKn的细胞生长效果，B：由各种浓度的HA处理的Detroit551的细胞生长效果，C：由各种浓度的HA-hGH结合体处理的HEKn的细胞生长效果，D：由各种浓度的HA-hGH结合体处理的Detroit551的细胞生长效果)。
图11显示静脉注射由实施例1中得到的HA-hGH结合体的药代动力学分析结果。
图12显示实施例1中得到的HA-hGH结合体、hGH和HA的经皮给药活性分析(A：对照，B：FITC，C：hGH-FITC，D：HA-FITC，E：HA-hGH-FITC)。
图13显示实施例2中得到的HA-OVA结合体、OVA和HA的经皮给药活性分析(A：PBS，B：FITC，C：OVA-FITC，D：HA-FITC，E：HA-OVA-FITC)。
图14显示静脉注射实施例1中得到的HA-hGH结合体的药代动力学分析结果。
图15显示实施例2中得到的HA-OVA结合体的经皮疫苗的特性，并且是在处理2和4周后进行测定的PBS、OVA和HA-OVA的血液中的OVA抗体浓度的ELISA结果。
具体实施方式
下面，基于各种实施例来说明本发明，但这些仅是作为发明的示例，并不应被解释为对本发明权利要求范围的限制。
<实施例：透明质酸-蛋白结合体的制备>
实施例1.HA-hGH结合体
将HA(MW＝100kDa)溶解于水中，浓度达到10mg/ml，在黑暗条件下与添加的HA摩尔单位的1摩尔倍的过碘酸钠(NaIO4)反应3小时、6小时或12小时。使用水和具有7000Da截留分子量的渗析膜对反应产物进行渗析，然后冻干3天，获得具有不同取代度的HA-醛衍生物。
HA-醛衍生物溶解于100mM乙酸盐缓冲溶液(pH5.5)，浓度达到10mg/ml，添加由LG生命科学提供的hGH水溶液，对于每1分子(链)的HA达到1分子、4分子、6分子或8分子的反应hGH。基于HA-醛衍生物的取代度(其中取代度由实验例1的方法获得)，以醛基的摩尔量的5摩尔倍添加氰基硼氢化钠(NaCNBH3)并反应24小时，以制备透明质酸-蛋白结合体。然后，在反应产物中以醛基的摩尔量的5摩尔倍加入肼基甲酸乙酯用来封闭未反应的醛基，并再反应2小时。当使用乙醇胺代替肼基甲酸乙酯时，在反应产物中加入醛基摩尔量的5摩尔倍的乙醇胺，并通过添加NaOH调节至pH8，然后再反应12小时。
反应后的溶液用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)透析，并保存在-70℃。
实施例2.HA-OVA结合体
将HA(MW＝215kDa)溶解于水，浓度达到10mg/ml，在黑暗条件下与添加的HA摩尔单位的2摩尔倍的过碘酸钠(NaIO4)反应3小时。使用水和具有7000Da截留分子量的渗析膜对反应产物进行渗析，然后冻干3天，获得具有不同取代度的HA-醛衍生物。
将HA-醛衍生物溶解于100mM乙酸盐缓冲溶液(pH5.5)，浓度达到8mg/ml，添加卵清蛋白(西格玛奥德里奇)，对于每1分子(链)的HA达到3分子或6分子的反应OVA。基于HA-醛衍生物的取代度(其中取代度由实验例1的方法获得)，以醛基的摩尔量的5摩尔倍添加氰基硼氢化钠(NaCNBH3)并反应24小时，以制备HA-蛋白结合体。然后，在反应产物中以醛基的摩尔量的5摩尔倍加入肼基甲酸乙酯用来封闭未反应的醛基，并再反应2小时。当使用乙醇胺代替肼基甲酸乙酯时，在反应产物中加入醛基摩尔量的5摩尔倍的乙醇胺，并通过添加NaOH调节至pH8，然后再反应12小时。
用GPC(凝胶渗透色谱法)在GPC分析条件下分析产物，从而从未反应的OVA、氰基硼氢化钠、肼基甲酸乙酯等中分离HA-OVA。用离心过滤机在5000rpm将分离的HA-OVA浓缩，并保存在-70℃。
<GPC分析条件>
泵：沃特世1525二元HPLC泵
吸光度检测器：沃特世2487双λ吸光度检测器
取样器：沃特世717plus自动取样器
柱：(hGH)沃特世Ultrahydrogel500+沃特世Ultrahydrogel250
(OVA)沃特世Ultrahydrogel500+沃特世Ultrahydrogel1000
移动相：PBS(pH7.4)
流速：0.5mL/min
测量波长：在210nm和280nm双检测
<实验例>
1.HA醛衍生物取代度分析
1)分析方法
为了分析实施例1中制备的HA-hGH结合体和实施例2中制备的HA-OVA结合体中的HA-醛衍生物产物的取代度，将制备的HA-醛衍生物溶解于100mM乙酸盐缓冲溶液(pH5.2)，浓度达到5mg/ml HA，并与相对于每单位的HA-醛衍生物为5摩尔倍而添加的肼基甲酸叔丁酯(TBC)和氰基硼氢化钠(NaCNBH3)反应25小时，来使得TBC结合到HA-醛衍生物的醛基上(HA-醛-TBC衍生物)。用MWCO7000渗析膜用蒸馏水对产物进行3天渗析并冻干。由1H-NMR(DPX300，布鲁克，德国)对产物进行分析获得取代度。
2)分析结果
如图2所示，在1)项目中获得的HA-醛-TBC衍生物的1H-NMR图谱表示出HA的峰和TBC中的三个甲基的峰，表明在δ＝1.2～1.4ppm有9个氢。为了定量分析，将δ＝1.85～1.95ppm的HA的乙酰氨基基团的甲基共振定为内标。
从δ＝1.85～1.95ppm的峰面积和δ＝1.2～1.4ppm的峰面积计算出实施例1和实施例2的HA-醛衍生物的取代度。从HA-醛衍生物的取代度的1H-NMR的分析结果确认可以通过改变氰基硼氢化钠的反应时间来控制在10～50mol％。即，随着反应时间变长，HA-醛的取代度变大。在实施例1的反应中，反应时间为3小时、6小时和12小时时，反应导致10mol％、20mol％和50mol％的取代度。在实施例2的反应中，反应时间为3小时时，导致15mol％的取代度。
2.HA-蛋白结合体的GPC分析
1)分析方法
通过GPC分析确认HA-蛋白结合体的形成，是对于实施例1中得到的HA-hGH结合体(与NaIO4反应3小时而获得具有约10mol％取代度的HA-醛衍生物，并且与相对于1摩尔HA(100kDa)为6摩尔倍量的hGH反应而获得，反应率：95mol％以上)，以及对于实施例2中得到的HA-OVA结合体(与NaIO4反应3小时而获得具有约15mol％取代度的HA-醛衍生物，并且与相对于1摩尔HA(215kDa)为3摩尔倍量的OVA反应而获得，反应率：80mol％以上)。HA-蛋白结合体的GPC分析是由HPLC在如下分析条件下进行的。
<GPC分析条件>
泵：沃特世1525二元HPLC泵
吸光度检测器：沃特世2487双λ吸光度检测器
取样器：沃特世717plus自动取样器
柱：(hGH)沃特世Ultrahydrogel500+沃特世Ultrahydrogel250
(OVA)沃特世Ultrahydrogel500+沃特世Ultrahydrogel1000
移动相：PBS(pH7.4)
流速：0.5mL/min
测量波长：在210nm和280nm双检测
2)分析结果
如图3a所示，HA-hGH的GPC分析结果显示在14至15分钟和280nm波长处有HA的峰，这表明蛋白结合到HA上。如图3b的HA-OVA的GPC分析结果所示，OVA在210nm的峰位移向大分子量方向，并显示在31～32分钟，这确认了蛋白的结合。
3.HA-蛋白结合体的定量分析
1)分析方法
在实施例1和2中获得的HA-蛋白结合体中的蛋白含量通过根据实验例2的GPC分析方法测量的GPC曲线的峰面积来算出。
为了分析HA-hGH，用蒸馏水稀释1mg/mL hGH溶液来制备hGH标准溶液。表示峰面积相对于hGH浓度的关系的标准曲线是通过在实验例2的分析条件下分析hGH的标准溶液来得到。通过与hGH标准溶液相同的方法来分析实施例1的HA-hGH结合体来获得GPC峰面积，并代入标准曲线来得到HA-hGH结合体中的hGH含量。
为了分析HA-OVA，根据与HA-hGH分析同样的方法获得表示峰面积相对于OVA浓度的标准曲线。从提纯前的未反应的OVA浓度来算出反应的OVA含量。如图3b所示，实施例2的HA-OVA结合体中的未反应OVA的峰示于36～37分钟。峰面积被代入标准曲线以获得HA-OVA结合体中未反应的OVA的浓度。
2)分析结果
在实施例1中获得的HA-hGH结合体中包含的蛋白(hGH)的含量随着用于结合到一个HA分子的蛋白的分子数量的提高而增加。当每HA分子的蛋白的分子数量增加到1、4、6和8，用于结合到一个HA分子的蛋白的平均数量可以被控制为1、4、6和8。无论蛋白的数量如何，蛋白的生物结合效率(％)显示为95％或更高(图4)。由实施例2获得的HA-OVA结合体的生物结合效率(％)则显示为，对于3个蛋白分子为约80％，对于6个分子为约65％。
4.HA-hGH结合体的CD分析
1)分析方法
使用hGH浓度作为参照，用圆二色谱(CD)来分析hGH溶液(0.25mg/ml)和HA-hGH结合体溶液。CD的分析条件如下所示。
<CD分析条件>
UV分光光度计：JASCOJ-715
测量条件：25℃，200～250nm，N2气氛
石英比色杯：通道长2mm
原始数据：在1秒的反应时间为0.2mm间隔
2)分析结果
如图5所示，hGH图谱和HA-hGH结合体的CD峰相同，这确认了hGH的二级结构被保留在HA结合体中。
5.HA-hGH结合体的活性的分析
1)分析方法
用蒸馏水稀释1mg/ml hGH溶液以获得浓度为0.5、1、5、10、20、30或50ug/ml的稀释溶液，以制备hGH的标准溶液，并通过使用Bradford分析来获得标准曲线。即，hGH的标准溶液与蛋白分析试剂以混合体积比1：1进行混合，在室温培养10分钟。对产物在595nm进行吸光度的测量以获得标准曲线。
基于Bradford分析，实施例1的HA-hGH结合体和稀释至100倍的hGH溶液在与标准曲线相同的条件下进行分析，吸光度被代入标准曲线以获得结合体中的hGH的含量。
然后，用于Bradford分析的hGH、每一HA-hGH和hGH的标准溶液被稀释至1000倍，通过ELISA获得hGH的含量。
特别地，稀释1mg/ml的hGH标准溶液以获得浓度为0、1、2、5、10或20ng/ml的参考溶液。用PBS稀释样品，使浓度为0、1、2、5、10或20ng/ml。将200ul的各参考溶液和样品稀释液载入用hGH抗体进行预处理后的96孔板上，并在37℃培养1小时。用250ul/孔的洗液冲洗孔5次，载入200ul/孔的抗-hGH-DIG溶液并在37℃培养1小时。然后用250ul/孔的洗液冲洗孔板5次，用200ul/孔的抗-DIG-POD二级抗体处理，并在37℃培养1小时。用250ul/孔的洗液冲洗孔板5次，添加200ul的POD基质(过氧化物酶)，并在黑暗条件下培养20分钟。在405nm下测量孔板的吸光度。将测量到的吸光度值代入参考溶液的标准曲线，测定与抗体相互作用的样品的浓度。用于ELISA的全部材料都包含在hGH ELISA试剂盒(罗氏)中。
ELISA/Bradford分析的比例用来分析HA-hGH结合体的活性。
2)分析结果
如图6a所示，HA-hGH结合体的ELISA/Bradford分析的比例为70％或更高。
特别地，Bradford分析是测定蛋白的赖氨酸的分析方法，ELISA分析是通过hGH与所结合的抗体的相互作用来定量的分析方法。ELISA/Bradford分析的比例给出HA-hGH结合体的活性。如图6a所示，结合体中含有的70％或更高的蛋白具有活性。
6.HA-OVA结合体的活性的分析
1)分析方法
将1mg/ml OVA溶液用蒸馏水稀释，获得具有0.6、1.2、2.5、5、10、20ug/ml浓度的稀释溶液，来制备OVA的标准溶液。使用Bradford分析的标准曲线由与实验例5相同的方法来获得，仅是由OVA溶液替代hGH溶液。
实施例2的HA-OVA结合体和OVA被稀释至1000倍。在与Bradford分析相同的条件下检测吸光度，并代入标准曲线来获得OVA含量。
然后，OVA、每一HA-OVA和用于Bradford分析的OVA的标准溶液被稀释至1000倍，通过ELISA获得OVA含量。
特别地，将1mg/ml的OVA标准溶液稀释来得到具有0、0.6、1.2、2.5、5、10或20ng/ml浓度的参考溶液。将样品用PBS稀释至浓度0至20ng/ml。将50ul的各参考溶液和样品稀释液载入96孔板并在37℃培养1小时。用300ul/孔的洗液冲洗孔3次，载入100ul/孔的抗-OVA-HRP溶液(赛默飞世尔科技)并在室温培养1小时。然后用洗液冲洗孔板3次，用50ul的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)处理，在黑暗条件下培养20分钟。用停止液(2N硫酸)处理孔板，并在450nm下检测孔板的吸光度。将检测到的吸光度值代入参考溶液的标准曲线，测定与抗体相互作用的样品的浓度。用于ELISA的全部材料都包含于hGH ELISA试剂盒(罗氏)中。
通过ELISA/Bradford分析的比例分析了HA-hGH结合体的活性。
2)分析结果
如图6a所示，HA-OVA结合体的ELISA/Bradford分析的比例为80％或更高。特别地，Bradford分析和ELISA分析与在实验例5中的说明相同。如图6b所示，结合体中含有的80％或更高的蛋白具有活性。
7.HA-hGH结合体的血清稳定性分析(体外)
1)分析方法
为了测试HA-蛋白结合体的血清稳定性，使用未结合到HA的hGH和以下样品来分析。
-HA-hGH结合体(20/6：醛基取代度为20mol％，每HA分子结合6个hGH分子)
将HA-hGH结合体和hGH的样品分别溶解于人血清(西格玛奥德里奇)，使hGH浓度为1mg/mL，在37℃培养120小时。规定时间过后，将获得的部分样品用PBS稀释至1000倍以防止人体血清的影响，并冷冻。用hGH ELISA试剂盒(罗氏)根据制造者的操作规程来分析样品的生物活性。
2)分析结果
如图7所示，在长时间内，HA-hGH结合体比hGH具有更高的稳定性，特别地，随着结合于HA的hGH的数量的增加，血清稳定性变得更高。
8.HA-hGH结合体的细胞信号传导活性测试(体外)
1)分析方法
IM-9细胞是人B淋巴母细胞并具有hGH受体，因此，如果hGH结合到受体JAK2(Janus激酶2)，则JAK2(Janus激酶2)被磷酸化。使用IM-9细胞的特性来测试HA-hGH的生物活性。
将IM-9细胞(韩国细胞系库)在富含10％(v/v)FBS和25mM HEPES的RPMI1640(GIBCO)中培养。全部细胞在标准组织培养盘中培养，其被储存在37℃的维持5％CO2(g)和相对湿度的条件的培养室。用各种浓度的hGH处理IM-9细胞，并在37℃培养24小时。然后，由蛋白印记法定量分析培养细胞的磷酸化JAK2以确定显示最大细胞信号传导的hGH浓度。在相同的hGH浓度下，用实施例1中得到的HA-hGH结合体处理细胞并用于分析细胞信号传导活性(Laemmli，自然(Nature)，227，680-685(1970))。所使用的抗体购自圣克鲁斯生物技术公司。
2)分析结果
如图8A至8C所示，在用500ng/ml的hGH的处理下，得到最高的细胞信号传导活性(图8A)。当对含有相同浓度hGH的HA-hGH结合体进行处理时，得到细胞信号传导活性(图8B)。图8C是显示图8A和图8B的蛋白印记结果中测量谱带强度的定量结果的曲线。因此，这一结果确认了结合于HA的hGH维持了其生物活性。
9.用hGH和HA-hGH结合体处理的人体皮肤细胞Detroit551细胞的JAK2磷酸化
1)分析方法
将作为人体皮肤正常的成纤维细胞的Detroit551(ATCC)在富含10％FBS和25mMHEPES的DMEM(GIBCO)中培养。全部细胞在标准组织培养盘中培养，其被储存在37℃的维持5％CO2(g)和相对湿度的条件的培养室。用各种浓度的实施例1的hGH和HA-hGH结合体处理Detroit551细胞，并在37℃培养24小时。然后，用与实验例7相同的方法来定量分析培养细胞的磷酸化JAK2。
2)分析结果
如上所述，当hGH结合到hGH受体时产生JAK2的磷酸化。
如图9A所示，在由hGH处理Detroit551细胞时，JAK2的磷酸化确认产生了由hGH受体导致的细胞信号传导。如图9B所示，在由HA-hGH结合体处理Detroit551细胞时，JAK2的磷酸化确认产生了由hGH受体导致的细胞信号传导。图9C和9D是显示图9A和图9B的蛋白印记结果中测量谱带强度的定量结果的曲线。因此，这一结果确认了HA-hGH结合体结合到HA受体和/或hGH受体，并显示细胞信号传导活性。
10.由HA-hGH结合体处理的人体皮肤细胞系的生长
1)分析方法
将作为人新生儿表皮的角化细胞的HEKn细胞(英杰生命技术)在富含1％HKGS(人角化细胞生成补充剂)的EpiLife培养基(英杰生命技术)中培养。将Detroit551细胞(ATCC)在富含10％FBS和25mM HEPES的DMEM(GIBCO)中培养。全部细胞在标准组织培养盘中培养，其被储存在37℃的维持5％CO2(g)和相对湿度的条件的培养室。将细胞以每一孔3x103细胞的量种植在96孔板中(A：HEKn，B：Detroit551)并培养24小时。然后，用各种不同浓度的实施例1的HA和HA-hGH结合体处理孔板。为了检测细胞生成度，48小时后，用WTS-1(宝生物工程)处理细胞。当活细胞线粒体脱氢酶将WTS-1(四唑鎓盐)转化为甲瓒(Formazan)时，检测到培养基溶液的吸光度改变。用WST-1处理后的孔板在37℃培养1小时，然后在450nm下检测吸光度。
2)分析结果
如图10所示，基于HA-hGH结合体的浓度的改变，观察到细胞的生长。
在用10ug/ml的HA(高浓度)处理细胞时，HEKn细胞显示20％的细胞生长(图10A)，Detroit551细胞显示60％的细胞生长(图10B)。当其在高浓度使用时，过量浓度的结合的hGH会阻止hGH的细胞信号传导。因此，在低浓度下测试HA-hGH结合体以适当地测试HA和hGH。
在低浓度的hGH时，具有HA受体但没有hGH受体的HEKn细胞(图10C)，在增加HA-hGH结合体的量时显示细微的差别，而具有HA受体和hGH受体的Detroit551细胞(图10D)，随着HA-hGH结合体浓度的增加而显示更高的生长。在用显示最大的细胞信号传导活性的500ng/ml的HA-hGH结合体处理时，表现出最高的细胞生长(约40％的生长)。
11.HA-hGH结合体的药代动力学(PK)分析(体内)
1)分析方法
将含有1mg/ml hGH的300ul的PBS、hGH和HA-hGH结合体的各自溶液在特定时间间隔后通过尾静脉注射到SD鼠(雌性，6周，200g)中，从尾静脉采血，并用hGH ELISA试剂盒(罗氏)分析样品的血液浓度。
2)分析结果
如图11所示，在24小时之前hGH的血液浓度就下降到基准线下，但当以HA-hGH结合体形式提供时，维持在高水平。特别地，当使用含有醛基的20％高取代度的HA-hGH结合体(20/6)时，hGH的血液浓度没有降低到基准线下。这一结果确认了当蛋白药物以本发明的结合体形式提供时，蛋白药物的血液半衰期变长，使得药效保持时间长。
12.使用HA-hGH结合体的经皮给药***的特性分析
1)分析方法
准备无毛Balb/c鼠(雌性，6周，20g)和PBS、FITC(异硫氰酸荧光素)、hGH-FITC、HA-FITC、HA-hGH-FITC结合体。
具有FITC标记的hGH-FITC和HA-hGH-FITC结合体是通过将FITC溶解于2mg/ml的磷酸盐缓冲液(pH9)并以相对于hGH的5摩尔倍浓度的FITC与hGH反应3小时来制备。然后，用PD10柱除去未反应的FITC。
为了与FITC反应，不具有氨基的自由HA在EDC催化剂的存在下首先与己二胺结合来引入氨基，然后基于与HA-hGH同样的方法来与FITC反应。将准备好的样品以100ul的浓度1mg/ml的FITC施加于1cm x1cm面积的鼠背皮肤。1小时后，获得皮肤组织并用OCT化合物固定。对固定的皮肤组织冷冻切片为厚度30um，并通过共焦显微镜进行组织的荧光分析来检测，获得样品的经皮渗透效率。
2)分析结果
如图12所示(A：对照，B：FITC，C：hGH-FITC，D：HA-FITC，E：HA-hGH-FITC)，没有与HA结合的FITC hGH(B)和hGH-FITC(C)没有渗透过皮肤组织层，仅在皮肤组织的外部检测到荧光。但是，结合到HA的HA-FITC(D)和HA-hGH-FITC(E)，在皮肤组织中显示出均匀的荧光分布，确认了HA具有经皮给药特性。这一分析结果确认了结合到水溶液蛋白(E)hGH的HA衍生物也表现出良好的经皮效率。
13.使用HA-OVA结合体的经皮给药***的特性分析
1)分析方法
准备无毛Balb/c鼠(雌性，6周，20g)和PBS、FITC(异硫氰酸荧光素)、OVA-FITC、HA-FITC、HA-OVA-FITC结合体。
具有FITC标记的OVA-FITC和HA-OVA-FITC结合体是通过将FITC溶解于2mg/ml的磷酸盐缓冲液(pH9)并以相对于OVA浓度为10摩尔倍浓度的FITC与OVA溶液反应3小时来制备。然后，用PD10柱除去未反应的FITC。
为了与FITC反应，不具有氨基的自由HA在EDC催化剂的存在下首先与己二胺结合来引入氨基，然后基于与HA-OVA同样的方法来与FITC反应。将准备好的样品以100ul的浓度1mg/ml的FITC施加于1cm x1cm面积的鼠背皮肤。1小时后，获得皮肤组织并用OCT化合物固定。对固定的皮肤组织冷冻切片为厚度30um，并通过共焦显微镜进行组织的荧光分析来检测，获得样品的经皮渗透效率。
2)分析结果
如图13所示(A：PBS、B：FITC、C：OVA-FITC、D：HA-FITC、E：HA-OVA-FITC)，没有与HA结合的FITC(B)和OVA-FITC(C)没有渗透过皮肤组织层，仅在皮肤组织的外部检测到荧光。但是，结合到HA的HA-FITC(D)和HA-OVA-FITC(E)，在皮肤组织中显示出均匀的荧光分布，确认了HA具有经皮给药特性。这一分析结果确认了结合到水溶液蛋白(E)hGH的HA衍生物也表现出良好的经皮效率。
14.HA-hGH结合体的药代动力学(PK)分析(体内)
1)分析方法
将SD鼠(雌性，6周，200g)的背部皮肤剃毛后，以1.5mg/ml hGH的浓度分别用300ul的PBS、hGH、HA-hGH结合体处理3cm x3cm面积的无毛背部皮肤。在特定的时间间隔后，由尾静脉采血，并用hGH ELISA试剂盒(罗氏)分析样品的血液浓度。为了将该结果与皮下注射比较，相同体积的HA-hGH结合体被皮下注射进鼠，并由同样的方法在各个时间间隔分析样品的血液浓度。
2)分析结果
如图14所示，未结合至HA的hGH没有渗透进入皮肤组织，并显示血液浓度低于基准线。由于HA-hGH结合体(10/6)的经皮渗透，其血液浓度达到20ng/ml的Cmax，且hGH在血液中也被检测到。因此，当hGH以HA-hGH结合体的形式被经皮给药时，hGH能够渗透进入皮肤组织层，并被输送到血液中。
考虑到由于是通过皮肤的渗透所以经皮给药***的给药效率比皮下注射低，但本经皮给药***具有皮下注射***20％的生物利用率，表明该经皮给药***具有非常好的给药效率。此外，从患者的便利性来说，仅通过皮肤给药就能达到皮下注射的20％给药效率。特别是，经皮给药***对于诸如侏儒症这样的需要长期治疗的疾病，具有很多优点。
15.使用HA-OVA结合体的经皮疫苗特性分析(体内)
1)分析方法
将Balb/c鼠(雄性，8周，200g)的背部皮肤剃毛后，以10mg/ml浓度的OVA分别用50ul的PBS、OVA、HA-OVA结合体处理1cm x1cm面积的无毛背部皮肤。在2周和4周经皮给药后，从尾静脉采血并使用OVA ELISA试剂盒(罗氏)分析样品的血液浓度。
特别地，将OVA载入96孔板孔1小时并以300ul/孔冲洗3次。鼠的抗-OVA抗体的标准溶液(西格玛奥德里奇)被稀释至0、3、6、12.5、25、50、100、200ng/ml作为参考溶液。用PBS稀释样品至浓度0至20ng/ml。分别用50ul的参考溶液和稀释样品溶液处理孔板并在室温培养1小时。以300ul/孔冲洗孔板3次，载入100ul/孔的羊的抗鼠IgG抗体-HRP溶液(密理博)并在室温培养1小时。冲洗孔板3次，并用50ul的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)处理，在黑暗条件下在37℃培养20分钟。用50ul的停止液(2N硫酸)处理孔板并在450nm下检测孔板的吸光度。将检测到的吸光度值代入参考溶液的标准曲线，测定抗-OVA IgG抗体的血液浓度。
2)分析结果
如图15所示，当OVA和HA-OVA以相同体积和浓度被经皮给药时，相比于单独的OVA的抗体浓度，在2周后，以HA-OVA结合体形式给药的OVA产生5倍高的抗体浓度，4周后产生15倍高的抗体浓度。这一结果表明，HA-OVA结合体比单独的OVA更有效地渗透到表皮组织和真皮组织。HA-OVA结合体渗透到深层皮肤组织，并诱导在皮肤组织产生免疫细胞诸如朗氏细胞和树突细胞，从而有效地产生免疫反应。结果表明，诸如HA-OVA结合体的HA-疫苗结合体由于优异的经皮给药特性能够显著提高抗体的生成。因此，HA-疫苗结合体能改进患者的便利性和疫苗效果，适用于良好的疫苗给药***。
Claims (20)
1.一种制造透明质酸-蛋白结合体的方法，包括：
制造由化学式1表示的透明质酸-醛(HA-醛)化合物的第1步骤；和
使该透明质酸-醛与水溶性蛋白的N-末端反应的第2步骤，
[化学式1]
在化学式1中，m和n的合计为50至10000的整数，n是5至5000的整数。
2.如权利要求1所述的方法，其中，该方法包括通过使透明质酸(HA)、透明质酸的盐或透明质酸的衍生物在黑暗条件下与氧化剂反应来对纤维素环进行开环的步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其中，透明质酸(HA)、透明质酸的盐或透明质酸的衍生物具有10000至3000000Da的分子量。
4.如权利要求2所述的方法，其中，氧化剂是过碘酸钠。
5.如权利要求2所述的方法，其中，氧化剂以相对于透明质酸、透明质酸的盐或透明质酸的衍生物的摩尔量的1至10摩尔倍的量，与透明质酸、透明质酸的盐或透明质酸的衍生物反应2至24小时。
6.如权利要求1所述的方法，其中，透明质酸-醛化合物具有10至50mol％的醛基取代度。
7.如权利要求1所述的方法，其中，第2步骤在pH5至7的缓冲溶液中进行。
8.如权利要求1所述的方法，其中，缓冲溶液是pH5至6.5的乙酸钠缓冲溶液。
9.如权利要求1所述的方法，其中，透明质酸-蛋白结合体具有结合到1个透明质酸-醛化合物的分子上的1至10个蛋白分子。
10.如权利要求1所述的方法，其中，该方法进一步包括在第2步骤之后使用胺来封闭未与蛋白反应的残留醛基的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其中，胺是C1至C5的直链或支链的肼基甲酸烷基酯或C1至C5的低级烷醇胺。
12.如权利要求11所述的方法，其中，肼基甲酸烷基酯是肼基甲酸乙酯或肼基甲酸叔丁酯，烷醇胺是甲醇胺、乙醇胺、丙醇胺、丁醇胺或戊醇胺。
13.如权利要求10所述的方法，其中，胺是肼基甲酸烷基酯，且以相对于醛基的摩尔量为5至10摩尔倍的肼基甲酸烷基酯反应12至24小时。
14.如权利要求10所述的方法，其中，胺是烷醇胺，且以相对于醛基的摩尔量为5至10摩尔倍的烷醇胺反应12至24小时。
15.如权利要求1所述的方法，其中，水溶性蛋白是人体生长激素、α干扰素、红细胞生成素、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、卵清蛋白或胰岛素。
16.一种透明质酸-蛋白结合体，由化学式2表示，并由权利要求1～15中任一项所述的方法来制造，
[化学式2]
化学式2中，
P是水溶性蛋白，
m、n和l的合计为50至10000的整数，
n和l的合计为5至5000的整数，且
l是1至100的整数。
17.一种用于经皮给药的药物组合物，含有权利要求16所述的透明质酸-蛋白结合体。
18.一种化妆品组合物，含有权利要求16所述的透明质酸-蛋白结合体。
19.一种疫苗组合物，含有权利要求16所述的透明质酸-蛋白结合体。
20.一种透明质酸-蛋白结合体的给药方法，包括：
制造由化学式2表示并由权利要求1～15中任一项所述的方法来制造的透明质酸-蛋白结合体；和
对所需对象以有效治疗量给药该透明质酸-蛋白结合体，
[化学式2]
化学式2中，
P是水溶性蛋白，
m、n和l的合计为50至10000的整数，
n和l的合计为5至5000的整数，且
l是1至100的整数。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2012-0012315 | 2012-02-07 | ||
| KR20120012315 | 2012-02-07 | ||
| PCT/KR2013/001002 WO2013119061A1 (ko) | 2012-02-07 | 2013-02-07 | 경피 전달용 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법 및 이에 따라 제조된 경피 전달용 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104302670A true CN104302670A (zh) | 2015-01-21 |
Family
ID=48947769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201380018200.3A Pending CN104302670A (zh) | 2012-02-07 | 2013-02-07 | 制造用于经皮给药的透明质酸-蛋白结合体的方法以及由该方法制造的用于经皮给药的透明质酸-蛋白结合体 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10092658B2 (zh) |
| EP (1) | EP2813515B1 (zh) |
| JP (1) | JP6047178B2 (zh) |
| KR (1) | KR101658627B1 (zh) |
| CN (1) | CN104302670A (zh) |
| CA (1) | CA2867917C (zh) |
| WO (1) | WO2013119061A1 (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107469090A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-12-15 | 浙江大学 | 可共载抗肿瘤药物和核酸药物的纳米载体及抗肿瘤药物纳米制剂 |
| CN112851951A (zh) * | 2021-01-14 | 2021-05-28 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种接枝ε-聚赖氨酸的双醛基壳聚糖及其制备方法和应用 |
| CN114805631A (zh) * | 2022-03-01 | 2022-07-29 | 吉林省奇健生物技术有限公司 | 高活性透明质酸-多肽缀合物及其制备方法和应用 |
| CN116789869A (zh) * | 2023-06-25 | 2023-09-22 | 吉林省奇健生物技术有限公司 | 一种透明质酸-蛋白偶联体的制备方法及其应用 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6253925B2 (ja) * | 2013-09-04 | 2017-12-27 | 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 | 多糖類の分解方法、細胞培養用担体、マイクロ粒子 |
| CN109260457B (zh) * | 2017-07-18 | 2023-06-13 | 苏州高泓利康生物科技有限公司 | 一种透明质酸-白介素10复合物、其制备方法及其应用 |
| US20210386863A1 (en) * | 2018-10-24 | 2021-12-16 | Phi Biomed Inc. | Drug conjugate prepared using aldehyde group at end of hyaluronic acid |
| US20220323780A1 (en) * | 2019-09-11 | 2022-10-13 | Phi Biomed Inc. | System for corneal cross-linking and correcting vision by using led contact lens and eye dye |
| WO2021209645A1 (en) * | 2020-04-17 | 2021-10-21 | Pvac Medical Technologies Ltd | Composition for treating keratin tissue |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU6357900A (en) * | 1999-07-20 | 2001-02-05 | Amgen, Inc. | Hyaluronic acid-protein conjugates, pharmaceutical compositions and related methods |
| US20040028649A1 (en) * | 2000-06-07 | 2004-02-12 | GIANNI Alessandro | Human growth hormone to stimulate mobilization of pluripotent hematopoietic stem cells |
| US20020192205A1 (en) * | 2001-05-11 | 2002-12-19 | Francis Michon | Immunogenic compositions of low molecular weight hyaluronic acid and methods to prevent, treat and diagnose infections and diseases caused by group A and group C streptococci |
| WO2003094929A2 (en) * | 2002-05-06 | 2003-11-20 | University Of Utah Research Foundation | Preblocking with non-ha gags increases effectiveness of ha conjugated anticancer agents |
| GB0212405D0 (en) * | 2002-05-29 | 2002-07-10 | Insignion Holdings Ltd | Composition and its therapeutic use |
| EP1848461A2 (en) * | 2005-02-16 | 2007-10-31 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates of an epo moiety and a polymer |
| WO2009155384A1 (en) * | 2008-06-17 | 2009-12-23 | Georgia Tech Research Corporation | Superparamagnetic nanoparticles for removal of cells, pathogens or viruses |
| CZ302504B6 (cs) | 2009-12-11 | 2011-06-22 | Contipro C A.S. | Derivát kyseliny hyaluronové oxidovaný v poloze 6 glukosaminové cásti polysacharidu selektivne na aldehyd, zpusob jeho prípravy a zpusob jeho modifikace |
| KR101309566B1 (ko) | 2010-12-10 | 2013-09-17 | 포항공과대학교 산학협력단 | 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법 |
-
2013
- 2013-02-07 US US14/376,202 patent/US10092658B2/en active Active
- 2013-02-07 EP EP13746520.9A patent/EP2813515B1/en active Active
- 2013-02-07 CN CN201380018200.3A patent/CN104302670A/zh active Pending
- 2013-02-07 JP JP2014556478A patent/JP6047178B2/ja active Active
- 2013-02-07 KR KR1020147022195A patent/KR101658627B1/ko active IP Right Grant
- 2013-02-07 CA CA2867917A patent/CA2867917C/en active Active
- 2013-02-07 WO PCT/KR2013/001002 patent/WO2013119061A1/ko active Application Filing
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ADVAIT V. BADKAR,: "Transdermal Delivery of Interferon Alpha-2B using Microporation and Iontophoresis in Hairless Rats", 《PHARMACEUTICAL RESEARCH》 * |
| JEONG-A YANG: "Target specific hyaluronic acid- interferon alpha conjugate for the treatment of hepatitis C virus infection", 《BIOMATERIALS》 * |
| JEONG-A YANG: "Transdermal delivery of hyaluronic acid e Human growth hormone conjugate", 《BIOMATERIALS》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107469090A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-12-15 | 浙江大学 | 可共载抗肿瘤药物和核酸药物的纳米载体及抗肿瘤药物纳米制剂 |
| CN112851951A (zh) * | 2021-01-14 | 2021-05-28 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种接枝ε-聚赖氨酸的双醛基壳聚糖及其制备方法和应用 |
| CN114805631A (zh) * | 2022-03-01 | 2022-07-29 | 吉林省奇健生物技术有限公司 | 高活性透明质酸-多肽缀合物及其制备方法和应用 |
| CN116789869A (zh) * | 2023-06-25 | 2023-09-22 | 吉林省奇健生物技术有限公司 | 一种透明质酸-蛋白偶联体的制备方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6047178B2 (ja) | 2016-12-21 |
| CA2867917C (en) | 2019-01-22 |
| US10092658B2 (en) | 2018-10-09 |
| EP2813515B1 (en) | 2019-07-10 |
| CA2867917A1 (en) | 2013-08-15 |
| KR20140136922A (ko) | 2014-12-01 |
| WO2013119061A1 (ko) | 2013-08-15 |
| JP2015510007A (ja) | 2015-04-02 |
| EP2813515A1 (en) | 2014-12-17 |
| EP2813515A4 (en) | 2015-10-14 |
| US20150056254A1 (en) | 2015-02-26 |
| KR101658627B1 (ko) | 2016-09-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104302670A (zh) | 制造用于经皮给药的透明质酸-蛋白结合体的方法以及由该方法制造的用于经皮给药的透明质酸-蛋白结合体 | |
| Yang et al. | Transdermal delivery of hyaluronic acid–human growth hormone conjugate | |
| JP6918816B2 (ja) | マイクロニードルパッチ支援送達による強化されたがん免疫療法 | |
| Chen et al. | PolyMPC–doxorubicin prodrugs | |
| JP5784142B2 (ja) | ヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲート及びその製造方法 | |
| CN101808668B (zh) | 药物内包活性靶向型高分子微团、医药组合物 | |
| US9867869B2 (en) | Insulin derivatives for diabetes treatment | |
| Yamada et al. | Fragmentation of injectable bioadhesive hydrogels affords chemotherapeutic macromolecules | |
| KR101062922B1 (ko) | 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법, 및 이에 의해 제조된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 | |
| Salmaso et al. | Supramolecular bioconjugates for protein and small drug delivery | |
| CA3194894A1 (en) | Oligonucleic acid conjugate | |
| JP6411648B2 (ja) | カチオン性分子輸送体およびアニオン性生物活性材料を含有する皮膚浸透用組成物 | |
| US20210386863A1 (en) | Drug conjugate prepared using aldehyde group at end of hyaluronic acid | |
| KR102277785B1 (ko) | 히알루론산 말단의 알데하이드 그룹을 이용하여 제조한 약물 접합체 | |
| Monfared et al. | Intratumoural Delivery of mRNA Loaded on a Cationic Hyper-Branched Cyclodextrin-Based Polymer Induced an Anti-Tumour Immunological Response in Melanoma | |
| CN112451681B (zh) | 酸敏感型聚合物-药物偶联物及其制备和应用 | |
| KR101575710B1 (ko) | 티올화 글리콜 키토산-거대분자 전송 도메인 복합체를 포함하는 안구질환 치료용 약물전달 시스템 및 그 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150121 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |