CN104297470A - 一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡及其制备方法和使用方法 - Google Patents

Abstract

一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡及其制备方法和使用方法，该速测卡包括卡壳和卡壳内的试纸条，所述试纸条包括底板、粘着在底板上依次相连的样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫；金标垫上包被拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体，在反应膜的检测线上包被拟除虫菊酯类农药抗体，反应膜的控制线上包被羊抗兔二抗，其中，所述拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体是用纳米级氯金酸胶体颗粒包被而得。本发明制备的速测卡可同时检测至少9种拟除虫菊酯类农药，检测限可达到0.01mg/kg，在常温下可稳定保存1.5年以上，特异性强、灵敏度高、稳定性好，并且操作简便、快速、准确，检测时间短，可广泛用于农产品和水环境及土壤中的拟除虫菊酯残留快速检测。

Description

一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡及其制备方法和使用方法

技术领域

本发明属于拟除虫菊酯类农药残留检测技术领域，具体涉及一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡及其制备方法和使用方法。

背景技术

拟除虫菊酯类农药(Pyrethriod insecticids)是一类天然仿生杀虫剂，具有灭虫快、毒性低、使用安全等特点。是我国农产品中农药残留检出率较高的药种之一。目前拟除虫菊酯类农药产量占杀虫剂类产量的20％，使用面积约占整个杀虫剂使用面积的25％。由于部分拟除虫菊酯类农药残留期较长，对非目标性生物毒性较大，且具有环境内分泌干扰作用，因此，建立快速检测技术具有十分重要的意义。

目前，实验室用于检测拟除虫菊酯的方法多为色谱方法或毛细管电泳方法，这类方法检测的周期长、成本高、操作不简便，样本制备复杂，几乎都是侧重于终端检测，即使获得检测结果后，可能大批的检测材料已经流向市场或者消费者手中。由于监管分散、样本分散，实验室方法难以及时快速、全面地从源头和现场进行检测。

免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为失踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl₄)在还原剂如白磷、抗坏血酸、柠檬酸钠等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称胶体金。胶体金在弱碱性环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金标记技术是免疫层析快速诊断的核心技术，它以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体反应，其实质是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。根据胶体金的一些物理性状，如高电子云密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。已有的免疫学检测方法由于没有较好的宽谱抗体，检测的灵敏度和稳定性不高，难以满足现场快速检测的需要。利用宽谱抗体建立免疫胶体金速测卡是目前农药残留检测领域的一个重要的发展方向。

目前，将现有的免疫胶体金技术应用到检测农药残留，仍然存在许多问题，如，特异性差，稳定性差，灵敏度不高，成本高，操作不简便，因此本领域技术人员亟需对现有免疫金技术进行改进，研制特异性强、灵敏度高、稳定性好、重复性好的检测多种拟除虫菊酯类农药的新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡及其制备方法和使用方法，克服了现有技术难以实现现场快速检测农产品、水环境及土壤中拟除虫菊酯类农药残留的难题，可用于拟除虫菊酯类农药的现场快速检测盒筛查。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡，包括卡壳和卡壳内的试纸条，所述试纸条包括底板、粘着在底板上依次相连的样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述卡壳上开有加样孔和观察窗；所述加样孔设于对应所述样品垫上方壳体，所述观察窗设于对应所述反应膜上方壳体，所述反应膜上设有检测线和质控线，所述金标垫上包被拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体，在反应膜的检测线上包被拟除虫菊酯类农药宽谱抗体，反应膜的质控线上包被羊抗兔二抗，其中，所述拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体为将拟除虫菊酯类农药宽谱抗体偶联到20～25nm氯金酸胶体颗粒表面所得。

进一步，所述样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫之间设有1～2mm的重叠区；所述检测线和质控线间隔0.5～1.0cm。

所述底板为PVC板，所述反应膜为硝酸纤维素膜。所述样品垫由玻璃纤维膜或滤纸制成，所述吸水纸由滤纸制成。

又，所述拟除虫菊酯类农药宽谱抗体为拟除虫菊酯类农药宽谱多克隆抗体。

所述拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体的标金量是14～16μg/mL，金标垫上包被的拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体的浓度为14～16μg/mL。

本发明拟除虫菊酯类农药宽谱抗体偶联到氯金酸胶体颗粒表面所得时，所用氯金酸胶体颗粒溶液的pH值为8.0～8.5。

再，所述反应膜的检测线上包被拟除虫菊酯类农药宽谱抗体的浓度为0.8～1.4mg/mL。

本发明所述拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡的制备方法，包括如下步骤：

1)将样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫依次粘贴在底板上制成试纸条；

2)将拟除虫菊酯类农药宽谱抗体用20～25nm氯金酸胶体颗粒包被，制得蛋白浓度为14～16μg/mL拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体，喷涂于金标垫上，干燥；再将蛋白浓度为0.8～1.4μg/mL的拟除虫菊酯类农药宽谱抗体喷涂于反应膜上的检测线位置，36～37℃干燥；然后将羊抗兔二抗(亲和层析纯化)喷涂于反应膜上的质控线位置，干燥后将试纸条装到卡壳内制备成速测卡。

进一步，拟除虫菊酯类农药宽谱抗体用纳米金颗粒包被的具体方法是：取20～25nm氯金酸胶体颗粒溶液至小试管中，离心，出去上清液，用等体积超纯水悬浮，调节pH值为8.0～8.5，随后将拟除虫菊酯类农药宽谱抗体缓缓滴入纳米金颗粒悬液，室温震荡，再滴加BSA，使BSA的终浓度为0.1％(体积浓度)，室温震荡，以封闭纳米金颗粒上为结合的位点，避免非特异性吸附。离心，除去多余的拟除虫菊酯类农药宽谱抗体和BSA，超纯水悬浮，洗涤，完成纳米金颗粒与拟除虫菊酯类农药宽谱抗体的偶联，得到拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体，其中，标金量是14～16μg/mL。

本发明所述一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡的使用方法，包括如下步骤：

1)待测样品的前处理：若待测样品为水和植物组织提取液或土壤水提液等液体物质时，可直接取50μl待测样品检测。若待测样品为植物叶片、茎干、种子等固体物质时，则需要将待测样品进行预处理，即将待测样品磨碎，加入样品处理液，静置后取50μl检测。其中，所述样品处理液为磷酸盐缓冲液(包括磷酸钠缓冲液和磷酸钾缓冲液)。

2)检测：将所取样品滴入加样孔内，样品在毛细作用下沿着样品垫迁移，室温作用5～10min，观察结果。

3)结果判断：

阳性：质控线、检测线均呈现红色条带，说明样本中有拟除虫菊酯类农药存在。

阴性：质控线呈现红色条带，检测线不呈现红色条带，说明样本中没有拟除虫菊酯类农药存在。

失效：质控线、检测线均不呈现红色条带或仅有检测线呈现红色条带，说明试纸条失效。

本发明所述胶体金免疫层析速测卡主要针对二型拟除虫菊酯类农药进行检测，拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体的标金量是14～16μg/mL，金标垫上包被的拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体的浓度为14～16μg/mL，所述反应膜的检测线上包被拟除虫菊酯类农药宽谱抗体的浓度为0.8～1.4mg/mL，在这样的条件下，反应的灵敏度最高，结合特性性最好，试纸条最稳定。本发明整个检测过程在5～10min内完成，操作简单、快速，且不需任何仪器。

本发明的有益效果：

1)本发明首次选用拟除虫菊酯类农药宽谱抗体用于快速检测农药残留，拟除虫菊酯类农药宽谱抗体是由最大程度突出和保留拟除虫菊酯类农药共性结构的分子制备成，大幅度提高了与多种拟除虫菊酯类农药抗原分子结合的特异性。

2)本发明首次选用纳米级氯金酸胶体颗粒来包被拟除虫菊酯类农药宽谱抗体，纳米级颗粒包被抗体优于常规胶体金颗粒包被，纳米级颗粒包被提高了与抗体结合的静电引力，不影响抗体的功能和效价，同时，纳米级颗粒标记抗体与硝酸纤维素膜结合的稳定性大幅度提高。

3)本发明首次选用羊抗兔二抗，该抗体效价优于羊抗鼠抗体，同时便于大量制备和纯化。

4)本发明制备的速测卡可同时检测至少9种拟除虫菊酯类农药，检测限可达到0.01mg/kg，在常温下可稳定保存1.5年以上，特异性强、灵敏度高、稳定性好，并且操作简便、快速、准确，检测时间短，可广泛用于农产品和水环境及土壤中的拟除虫菊酯残留快速检测。

附图说明

图1为本发明实施例速测卡的结构示意图；

图2为本发明实施例速测卡的侧面结构示意图；

图3为本发明实施例卡壳的结构示意图；

图4为本发明实施例的检测结果呈阳性示意图；

图5为本发明实施例的检测结果呈阴性示意图；

图6为本发明实施例的检测结果呈失效示意图之一；

图7为本发明实施例的检测结果呈失效示意图之二。

具体实施方式：

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。

实施例1：

参见图1～7，一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡，其包括卡壳1和卡壳1内的试纸条2，其中，所述试纸2包括底板3、粘着在底板3上依次相连的样品垫4、金标垫5、反应膜6和吸水垫7。所述卡壳1上设有加样孔8和观察窗9，所述加样孔8设于对应所述样品垫4上方壳体，所述观察窗9设于对应所述反应膜6上方壳体。所述依次相连的样品垫4、金标垫5、反应膜6和吸水垫7之间设有1～2mm的重复区。所述底板3为PVC板，所述反应膜6为硝酸纤维素膜。所述样品垫4由玻璃纤维或滤纸制成，所述吸水垫7由滤纸制成。

本实施例中金标垫5包被拟除虫菊酯类宽谱抗体-纳米级胶体金结合物。

所述反应膜6上设有包被拟除虫菊酯类宽谱抗体的检测线61和包被羊抗兔二抗IgG的质控线62，所述检测线61和所述质控线62间隔0.5cm。

本实施例拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡的制备过程如下：

1)偶联拟除虫菊酯类农药宽谱抗体到纳米金颗粒表面的具体方法是：本实施例使用的纳米金颗粒是由上海市农业科学院生物安全评价与检测实验室合成，量取10ml 20nm氯金酸胶体颗粒溶液至小试管中，离心(10000rpm，10min)，出去上清液，用等体积超纯水悬浮，调节pH值为8.0，随后将亲和层析纯化后的0.3ml拟除虫菊酯类农药宽谱抗体(宽谱抗体由上海市农业科学院生物安全评价与检测实验室制备)缓缓滴入纳米金颗粒悬液，室温震荡2h，再滴加1％BSA，使BSA的终浓度为0.1％，室温震荡2h，以封闭纳米金颗粒上为结合的位点，避免非特异性吸附。离心(8000rpm，10min)，除去多余的拟除虫菊酯类农药宽谱抗体和BSA，超纯水悬浮，重复洗涤3次，完成纳米金颗粒与拟除虫菊酯类农药宽谱抗体的偶联，制备好的纳米金标抗体可存放在4℃冰箱备用。其中，纳米金标抗体的标金量是16μg/mL。

2)将制备的16μg/mL纳米金标抗体喷涂于金标垫上，干燥；再将1.4μg/mL拟除虫菊酯类农药抗体喷涂于反应膜上的检测线位置，36-37℃干燥；然后将16μg/mL羊抗兔二抗喷涂于反应膜上的质控线位置，干燥后将试纸条装到卡壳内制备成速测卡。

本实施例胶体金免疫层析速测卡的使用：

(1)待测样品的前处理：若待测样品为水和植物组织提取液或土壤水提液等液体物质时，可直接取50μl样品检测。若待检测样品为植物叶片、茎干、种子等样品时，则需要将样品进行预处理，即将样品磨碎，加入样品处理液(5Mm PBS pH 7.4)，静置后取50μl检测。

(2)检测：将所取样品滴入加样孔8内，样品溶液在毛细作用下沿着样品垫迁移，室温作用5～10min，然后观察窗9观察结果。

(3)结果判断：

阳性：检测线61、质控线62、均为红色条带，说明样本中有拟除虫菊酯农药存在，如图4所示。

阴性：检测线61不出现红色条带，质控线62出现红色条带，说明样本中没有拟除虫菊酯农药存在，如图5所示。

失效：检测线61、质控线62均不出现红色条带或仅有检测线出现红色条带，说明速测卡失效，如图6、图7所示。

实施例2拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡的灵敏度测试

按照实例1中的方法制备拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡。分别测试该胶体金免疫层析速测卡对氯氰菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯、苯醚氰菊酯、氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、乙氰菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊等9种菊酯类农药的检测灵敏度。分别将这9种菊酯类农药标准品稀释到一定浓度，能够检测出阳性结果的最低浓度，即为速测卡对该农药的检测灵敏度。

经测试，9种菊酯农药检测结果均为阳性，检出限见表1：对10mg/kg氯氰菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯、苯醚氰菊酯、氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、乙氰菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊的检出阳性率低于5％，视检测结果为阴性。表明该速测卡可用于多种菊酯农药的筛查。

表1菊酯类农药的检出限

农药名称	检测限(mg/kg)
		氯氰菊酯	0.05
甲氰菊酯	0.01
		溴氰菊酯	0.01
苯醚氰菊酯	0.01
		氟氰菊酯	0.01
氟氯氰菊酯	0.01
		乙氰菊酯	0.01
氰戊菊酯	0.05
		氟胺氰菊	0.05

实施例3：拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡的特异性测试

按照实例1中的方法制备拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡。将滴滴涕(DDT)、六六六(HCH)等有机氯农药及毒死蜱、甲胺磷、乐果、敌敌畏、马拉硫磷的有机磷农药和西维因、呋喃丹、灭多威等氨基甲酸酯类农药分别稀释至一定浓度，用速测卡进行检测。

检测结果显示，该速测卡对浓度为1mg/ml有机氯、有机磷和氨基甲酸酯类农药样品的阳性检测率均低于0.5％，即交叉反应率低于0.5％。表面该速测卡对拟除虫菊酯类农药具有很强的检测特异性，适用于多种拟除虫菊酯类农药的特异性残留检测。

实施例4：拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡的稳定性试验

按照实例1中的方法制备拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡。制作好的速测卡放入密封袋，内置干燥片，至于45℃烘箱，分别于第7、14、21、28、35、42、49、56天取出，检测试纸的稳定性。

分别对3个批次的速测卡进行批内和批间差异测试。结果表明，批内差均小于5％，即速测卡检测线与质控线包被均匀，材料处理均匀，纳米级氯金酸颗粒包被抗体质量好。3个批次产品显色程度一致性高，检测重复性好，可满足重复性生产要求。

通过高温加速老化试验显示，45℃保持7天、14天、21天、28天、35天、42天，检测结果均无明显改变。45℃保持49天，金标垫上的抗体出现复溶现象，质控线和检测线颜色均变浅，灵敏度下降，到56天，检测线已经很微弱。45℃保存49天，相当于常温保持一年半。

Claims (10)

1.一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡，包括卡壳和卡壳内的试纸条，所述试纸条包括底板、粘着在底板上依次相连的样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述卡壳上开有加样孔和观察窗；所述加样孔设于对应所述样品垫上方壳体，所述观察窗设于对应所述反应膜上方壳体，所述反应膜上设有检测线和质控线，其特征在于，所述金标垫上包被拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体，在反应膜的检测线上包被拟除虫菊酯类农药宽谱抗体，反应膜的质控线上包被羊抗兔二抗，其中，所述拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体为将拟除虫菊酯类农药宽谱抗体偶联到20～25nm氯金酸胶体颗粒表面所得。

2.根据权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述底板为PVC板，所述反应膜为硝酸纤维素膜，所述样品垫由玻璃纤维膜或滤纸制成，所述吸水纸由滤纸制成。

3.根据权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫之间设有1～2mm的重叠区；所述检测线和质控线间隔0.5～1.0cm。

4.根据权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体的标金量是14～16μg/mL，金标垫上包被的拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体的浓度为14～16μg/mL。

5.根据权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，拟除虫菊酯类农药宽谱抗体偶联到氯金酸胶体颗粒表面时，所用氯金酸胶体颗粒溶液的pH值为8.0～8.5。

6.根据权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述反应膜的检测线上包被拟除虫菊酯类农药宽谱抗体的浓度为0.8～1.4mg/mL。

7.根据权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述拟除虫菊酯类农药宽谱抗体为拟除虫菊酯类农药宽谱多克隆抗体。

8.如权利要求1～7任一项所述拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡的制备方法，包括如下步骤：

1)将样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫依次粘贴在底板上制成试纸条；

2)将拟除虫菊酯类农药宽谱抗体用20～25nm氯金酸胶体颗粒包被，制得蛋白浓度为14～16μg/mL的拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体，喷涂于金标垫上，干燥；再将蛋白浓度为0.8～1.4μg/mL的拟除虫菊酯类农药宽谱抗体喷涂于反应膜上的检测线位置，36～37℃干燥；然后将羊抗兔二抗喷涂于反应膜上的质控线位置，干燥后将试纸条装到卡壳内制备成速测卡。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中拟除虫菊酯类农药宽谱抗体用纳米金颗粒包被的具体方法是：取20～25nm氯金酸胶体颗粒溶液至小试管中，离心，除去上清液，用等体积超纯水悬浮，调节pH值为8.0～8.5，随后将拟除虫菊酯类农药宽谱抗体缓缓滴入纳米金颗粒悬液，室温震荡，再滴加BSA，使BSA的终浓度为0.1％，室温震荡，以封闭纳米金颗粒上为结合的位点，避免非特异性吸附；离心，除去多余的拟除虫菊酯类农药宽谱抗体和BSA，超纯水悬浮，洗涤，完成纳米金颗粒与拟除虫菊酯类农药宽谱抗体的偶联，得到拟除虫菊酯类农药金标宽谱抗体，其中，标金量是14～16μg/mL。

10.如权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析速测卡的使用方法，包括如下步骤：

1)待测样品的前处理：若待测样品为液体物质时，可直接取待测样品检测；若待测样品为固体物质时，将待测样品磨碎，加入样品处理液，静置后检测；其中，所述样品处理液为磷酸盐缓冲液；

2)检测：将所取样品滴入加样孔内，样品在毛细作用下沿着样品垫迁移，室温作用5～10min，观察结果；

3)结果判断：

阳性：质控线、检测线均呈现红色条带，说明样品中有拟除虫菊酯类农药存在；

阴性：质控线呈现红色条带，检测线不呈现红色条带，说明样品中没有拟除虫菊酯类农药存在；

失效：质控线、检测线均不呈现红色条带或仅有检测线呈现红色条带，说明试纸条失效。