CN104293892A - 检测核基因组中与表型形状相关基因的方法 - Google Patents

检测核基因组中与表型形状相关基因的方法 Download PDF

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CN104293892A CN201310298676.9A CN201310298676A CN104293892A CN 104293892 A CN104293892 A CN 104293892A CN 201310298676 A CN201310298676 A CN 201310298676A CN 104293892 A CN104293892 A CN 104293892A
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张德强
王博文
杜庆章
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Abstract

本发明公开了一种检测核基因组中与表型性状相关基因的方法。该方法包括以下步骤：S1，测量F1代杂交群体的目标表型性状，选取极端的目标表型性状；S2，提取极端的目标表型性状个体的RNA，采用BSA法分组后构建表达谱基因芯片；S3，根据表达谱基因芯片的信息找出表达有差异的基因，该基因即为核基因组中与目标表型性状相关基因。应用本发明的技术方案，通过多次测量筛选F1代杂交群体的目标表型性状，从中挑选具有稳定极端目标表型性状的个体，应用BSA法混合分组构建基因池，从而突出目标表型性状的差异，结合基因芯片技术使大量基因同时进行杂交，通过分析芯片结果筛选出与目标表型性状相关的差异表达基因。

Description

检测核基因组中与表型形状相关基因的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种检测核基因组中与表型形状相关基因的方法。 
背景技术
光合作用是自然界最重要的化学反应之一，它是光合生物生物量的基础。在林木中，木材由光合产物转化，在农业上，作物产量的90%来源于光合，因此，对光合作用的研究对应对人口增长导致的粮食安全以及新能源的开发都有不容忽视的意义。 
随着对光合作用研究的深入，人们发现它由几个复杂过程组成，包括光捕捉、碳固定、光合磷酸化等等，并与营养物质吸收，运输效率，环境因素以及生物量的再分配等有关，其调控网络更是涉及多个层次水平，包括核质互作，转录调控等等。因为其过程的复杂性，性状的连续性，与许多外在因素相关的特性使得其相关基因的研究工作受到极大限制。 
目前，对于表型性状相关基因的鉴定通常是针对光合作用中某一特定位点，影响因素或过程展开，而对表型性状核基因组水平上基因的检测还处于起步阶段。现有技术中检测核基因组中与表型相关基因大多是针对某一类甚至某一个基因（如Rubisco酶），或者是针对某一个影响因素（光、CO2含量、氮含量、水含量等等），或者是针对某一个光合作用过程（如电子传递、光保护等），利用的方法主要是利用基因芯片寻找差异基因，或者基因工程技术。但是，无论是基因芯片还是基因工程技术，由于基因信息量大，检测周期长，所以，亟需开发一种能够快速检测核基因组中与表型性状相关基因的方法。 
发明内容
本发明旨在提供一种检测核基因组中与表型性状相关基因的方法，以解决现有技术中没有能够快速检测核基因组中与表型性状相关基因方法的技术问题。 
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测核基因组中与表型性状相关基因的方法。该方法包括以下步骤：S1，测量F1代杂交群体的目标表型性状，选取极端的目标表型性状；S2，提取极端的目标表型性状个体的RNA，采用BSA法分组后构建表达谱基因芯片；S3，根据表达谱基因芯片的信息找出表达有差异的基因，该基因即为核基因组中与目标表型性状相关的基因。 
进一步地，目标表型性状为净光合速率。 
进一步地，极端的净光合速率个体包括净光合速率高的个体15株，净光合速率低的个体15株。 
进一步地，提取极端的净光合速率个体的RNA每株2mg，净光合速率高的个体5株的RNA混为一池，3个生物学重复；净光合速率低的个体5株的RNA混为一池，3个生物学重复。 
进一步地，步骤S3中，通过杂交、图像处理、数据标准化对基因芯片进行数据分析，筛选出FC≥2，P<0.05的基因为表达有差异的基因。 
进一步地，该方法还包括：S4，通过RT-PCR分析步骤S3中找出的表达有差异的基因的表达模式，验证基因芯片结果可靠性。 
进一步地，该方法包括：通过与已知数据库进行比对，对步骤S3中找出的表达有差异的基因注释，进行功能分类。 
进一步地，步骤S1中测量F1代杂交群体的目标表型性状每个个体测量次数大于3次。 
进一步地，检测材料为杨树。 
应用本发明的技术方案，联合应用BSA法（混合分组分析法）及基因芯片技术检测与表型性状相关基因，通过多次测量筛选F1代杂交群体的目标表型性状，从中挑选具有稳定极端目标表型性状的个体，应用BSA法混合分组构建基因池，从而突出目标表型性状的差异，结合基因芯片技术使大量基因同时进行杂交，通过分析芯片结果筛选出与目标表型性状相关的差异表达基因。与现有技术的需要从大量的基因中寻找目标性状相关基因相比，本发明的检测更有针对性，所以能够快速地找出与目标表型性状相关的核基因。 
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： 
图1示出了根据本发明一实施方式的流程图； 
图2示出了根据本发明实施例1的具体流程图； 
图3示出了差异基因在基因芯片中的表达模式，X轴表示10个差异表达基因（CF936190，AF515607，CK089075，CV273041，CV260219，AJ780277，CX183751，CX185631，CV260015和DN487027），Y轴表示它们的表达量，Z轴表示不同的混合基因池； 
图4示出了差异基因在RT-PCR中的表达模式，X轴表示10个差异表达基因（CF936190，AF515607，CK089075，CV273041，CV260219，AJ780277，CX183751，CX185631，CV260015和DN487027），Y轴表示它们的表达量，Z轴表示不同的混合基因池；以及 
图5示出了GeneSpring11.0绘制的火山图，其中，X轴：log2(Fold Change)；Y轴：-log10（p-value）；X轴平行线：p-value=0.05：Y轴平行线:：Fold Change=2；红色区域：p-value<0.05Fold Change≥2差异基因。 
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。 
BSA法（Bulk Segregant Analysis），即混合分组分析法，是从分离群体中筛选出一定数量具有目标基因表型差异的植株，构建2个相对性状的“基因池”。因为2个“基因池”间除了在目标基因座所在的染色体区域的DNA组成上存在差异之外，其他部分的DNA组成应该是基本相同，所以，在两群间表现多态性的分子标记遗传上可能与目标性状基因座位相连锁。它于1991被Michelmore在莴苣抗病性研究中提出，被广泛用于基因定位，数量性状位点（QTL）作图，品种分类等等，常与分子标记技术联用。 
基因芯片技术是一种将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息的技术。通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达检测，基因发现，DNA测序，核酸突变检测及基因组多态性分析。 
在本发明中，发明人创造性地将其用于样本的采集和基因芯片的制备，在F1代杂交群体中，根据目标表型性状的不同，选择其中具有极端性状的个体混合分为两类。因为这两类除了影响目标表型性状的部分不同外，其它部分应该基本相同，所以突出了导致极端目标表型性状的遗传差异，从而可以检测在核基因组水平上检测到影响目标表型性状的基因。 
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种检测核基因组中与表型性状相关基因的方法。如图1所示，该方法包括以下步骤：S1，测量F1代杂交群体的目标表型性状，选取极端的目标表型性状；S2，提取极端的目标表型性状个体的RNA，采用BSA法分组后构建表达谱基因芯片；S3，根据表达谱基因芯片的信息找出表达有差异的基因，该基因即为核基因组中与目标表型性状相关基因。 
本发明是一种快速检测核基因组与表型形状相关基因的方法，它结合了BSA分析法和基因芯片技术，既可突出与目标表型性状相关的差异基因，又可在同一时间对大量基因进行检测，从而达到快速检测核基因组上与目标表型性状相关基因的目的。本发明对阐明与目标表型性状相关的核基因组基因的功能类型、差异表达、以及基因互作调控网络等具有重要的理论价值，可对差异基因进行GO（Gene Ontology）富集分析，分析核基因组在表型性状中主要调控或涉及的生物学过程、分子功能以及细胞部位，为分析复杂性状的核基因组差异基因和调控提供了研究思路，更为后续选育新品种奠定理论基础。 
采用本发明的技术方案，可以快速检测核基因组与任何表型形状相关基因，根据有本发明一种典型的实施方式，目标表型性状为净光合速率。本发明针对核基因组水平上光合作用相关基因的检测受其过程的复杂性，光合性状的连续性，以及与许多外在因素影响的现状，通过结合BSA法以及基因芯片技术，弱化光合性状的复杂性，突出净光合速率的差异，并在同一时间对大量基因进行筛选，从而达到快速检测核基因组光合作用相关基因的目的，进而 可绘制核基因组光合作用相关的通路图，分析差异基因在不同通路上的作用，对净光合速率的影响，从而为进一步了解光合作用在核基因组水平上的调控奠定基础。 
本发明中极端的净光合速率个体数量及生物学重复可以根据实验需要设置，优选地，极端的净光合速率个体包括净光合速率高的个体15株，净光合速率低的个体15株。这个数量的极端的净光合速率个体既能够反应基因的差别，又不会使数据处理量过大，便于提高检测的速度。 
优选地，提取极端的净光合速率个体的RNA每株2mg，净光合速率高的个体5株的RNA混为一池，3个生物学重复；净光合速率低的个体5株的RNA混为一池，3个生物学重复。优选地，步骤S3中，通过杂交、图像处理、数据标准化对基因芯片进行数据分析，筛选出FC≥2，P<0.05的基因为表达有差异的基因。FC（Fold change）是差异表达分析常用的方法，通常以2倍差异为阈值来判断基因是否差异表达。识别两个条件下表达差异显著的基因，在排除各种偏差后，其差异具有统计学意义。常用T检验（T-test）方法来寻找差异表达基因。根据t分布计算显著性P值来衡量这种差异的显著性，所以我们选择FC≥2，P<0.05为差异基因。 
优选地，进一步包括：S4，通过RT-PCR分析步骤S3中找出的表达有差异的基因的表达模式，验证基因芯片结果可靠性，这样可以更加确保实验的准确性。 
在本发明一种典型的实施方式中，进一步包括：通过与已知数据库进行比对，对步骤S3中找出的表达有差异的基因注释，进行功能分类。分析其在光合作用中的生物学功能，所处染色***置，从而探讨核基因组在光合调控中的作用。 
优选地，步骤S1中测量F1代杂交群体的目标表型性状每个个体测量次数大于3次，这样可以更加准确地确定目标表型性的稳定性。 
根据有本发明一种典型的实施方式，检测材料为杨树。 
下面将结合实施例进一步说明应用BSA及芯片技术快速检测杨树核基因组中净光合速率相关基因。其中，图2示出了根据本发明实施1的具体流程图。 
实施例1 
1）测量北京小汤山（40°2′北纬，115°50′东经）“YX01”（P.alba×P.glandulossa）与“LM50”（P.tomentosa）杂交的1200株F2代群体的净光合速率，并从中选择净光合速率的极端个体，统一重复测量，筛选30株稳定的极端净光合速率个体。其中高净光合速率和低净光合速率个体各15株。 
其中，光合效率的测量是在植物生长旺盛阳光充足的上午9点至11点，这个时间对于光合的测量比较准确。为了确保用于建池的个体的净光合速率测定的准确，发明人将测量中表现为高或低光合的植株在同一天重复测量一次。 
2）利用Plant Qiagen RNAeasy kit提取每个个体的RNA，依据BSA法，分组构建基因池。 按RNA量（2mg），分别在高净光合速率和低净光合速率组中，每5个极端个体的RNA混合为一个基因池，并设立3个生物学重复，共计6个基因池。 
3）应用Affymetrix基因芯片杂交，通过图像处理与数据标准化，对基因芯片进行数据分析，选择FC≥2（fold change），P<0.05的为差异基因。共检测出了515个杨树核基因组中净光合速率相关基因。 
图5的火山图是以log2（Fold change）为横坐标，-log10（P值）为纵坐标，利用GeneSpring11.0绘制的火山图，红色部分即显示的是FC≥2，P<0.05的差异基因，它是基因芯片结果的直观显示。 
4）随机选择10基因芯片结果显示为差异基因的基因（CF936190，AF515607，CK089075，CV273041，CV260219，AJ780277，CX183751，CX185631，CV260015和DN487027）进行RT-PCR（Realtime-PCR，实时荧光定量聚合酶链式反应）检测。 
将探针和cDNA杂交信号的荧光值通过背景校正，缺失值处理，数据过滤和标记以及归一化，对原始数据进行预处理。之后，在此基础上，通过差异倍数（Fold change）的方法筛选差异基因，筛选的标准为Fold change≥2，T检验为P＜0.05。基因芯片数据如表1所示。 
表1 
  CF936190 AF515607 CK089075 CV273041 CV260219 AJ780277 CX183751 CX185631 CV260015 DN487027
ZDQA 8.311082 10.170125 8.857685 9.081508 8.840073 4.4816384 4.971479 9.194249 8.180905 7.6629415
ZDQB 8.454083 11.413731 10.5650015 9.761157 9.662142 2.25791 3.7364507 10.158843 7.7902803 8.242191
ZDQC 11.6194 11.730373 10.882008 10.885706 9.724763 4.7363305 1.6266171 7.7883177 7.66008 8.0043545
ZDQD 4.8435144 6.684779 7.2061605 6.969824 7.233054 8.248645 7.9945583 13.21604 9.752658 9.485123
ZDQE 5.724157 8.603548 6.468014 8.452156 8.680998 10.177267 7.565715 13.748351 9.364586 8.752794
ZDQF 4.8324594 7.4884553 7.605359 8.265067 7.7554703 8.42329 7.4283037 11.564322 9.375401 9.237968
实时荧光定量RT-PCR分析 
将用于构建基因池的个体RNA，以及混合后用于芯片的混合RNA分别反转录合成第一链cDNA，以此为模板，采用TaKaRA公司的Premix Ex TagTMPerfect Real Time试剂盒，应用Opticon Monitor Analysis Software3.1软件分析进行RT-PCR。选择Actin为内参基因，定量检测6个用于基因芯片分析的混合基因池以及其相应的个体的表达量。 
其中，RT-PCR反应体系如表2所示。 
表2 
用于RT-PCR的引物如表3所示。 
表3 
实时荧光定量PCR（RT-PCR）是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化。实验中所用的为相对定量，利用比较Ct法计算的数值。比较CT指的是通过与内参基因CT值之间的相差来计算基因表达差异，也称之是2-△△CT。用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：△CT（试验）=CT(试验样本)-CT（试验参考），△CT（对照）=CT(对照样本)-CT（对照参考）；用对照样本的△CT值归一试验样本的△CT值：△△CT=△CT（试验）-△CT（对照）；计算表达水平比率：2-△△CT=表达量倍数变化（Fold change）。表4中所示即为Fold change。 
表4 
  CF936190 AF515607 CK089075 CV273041 CV260219 AJ780277 CX183751 CX185631 CV260015 DN487027
ZDQA 0.6983 0.948 0.4506 0.3074 0.5198 0.01364 0.06106 0.2993 0.1422 0.124
ZDQB 0.4009 1.054 0.8221 0.5987 0.1921 0.03954 0.05418 0.3756 0.1035 0.142
ZDQC 1.635 1.46 1.126 1.004 0.2011 0.02604 0.03963 0.3612 0.1228 0.09805
[0057] 
ZDQD 0.08475 0.1185 0.4218 0.07107 0.1308 0.1844 0.6098 3.616 0.862 0.4876
ZDQE 0.07973 0.1546 0.1903 0.0817 0.1325 0.2272 0.1961 3.238 0.2664 0.2004
ZDQF 0.2703 0.4734 0.3646 0.2695 0.1598 0.2838 0.4016 1.806 1.139 0.4023
其中，图3示出了差异基因在基因芯片中的表达模式（与表1中的数据相对应）是，X轴表示10个差异表达基因，Y轴表示它们的表达量，Z轴表示不同的混合基因池。ZDQA，ZDQB和ZDQC是高光合速率基因池，ZDQD，ZDQE和ZDQF是低光合速率基因池。10个基因中CF936190，AF515607，CK089075，CV273041和CV260219A在基因芯片数据中是上调表达的；AJ780277，CX183751，CX185631，CV260015和DN487027在基因芯片数据中是下调表达的。显示了基因芯片数据的结果上调基因在高光合效率的基因池中高表达，相对的下调基因在低光合效率的基因池中高表达。 
图4示出了差异基因在RT-PCR中的表达模式（与表4中的数据相对应），即同一个差异基因在不同的基因池中，以及同一个基因池不同差异基因的表达模式在两种方法下都基本相同，RT-PCR的结果说明了基因芯片结果的可靠性，即利用基因芯片技术检测到的这些差异基因确实在不同光合速率基因池中存在表达差异。 
上述分析差异基因表达模式，发现芯片与RT-PCR结果基本一致，说明基因芯片结果可靠。 
5）对差异基因进行注释。 
应用本发明的技术方案，对预测出的基因进行高通量功能注释可以利用已知功能基因的注释信息为新基因注释，例如，如表5所示。 
表5 
基因 基因模型 拟南芥中的同源基因 GenBank号 功能注释 差异倍数
XET16A POPTR_0003s15800 AT5G13870.1 AF515607.1 木葡聚糖内糖基转移酶 11.412019
Dabb POPTR_0009s15030 AT5G22580.1 CK089075 逆境响应蛋白 8.046646
GASA POPTR_0014s02030.1 AT5G59845.1 CV273041 赤霉素调控蛋白 4.0383735
SAUR POPTR_0009s12890.1 AT1G75580.1 CV251026 小生长素上调RNA 2.9399543
CGS POPTR_0003s18610.1 AT1G64660.1 CK115458 胱硫醚伽马合酶 47.518612
PI POPTR_0010s08600 AT2G38870.1 AJ780277 PR-6蛋白酶抑制剂家族 34.88271
6）单标记连锁分析 
本实施例中，选择了6个差异基因进行单标记连锁分析以探讨这些基因在光合作用中的作用。即设计SNP（Single Nucleotide Polymorphism）引物（表5中所示），并与光合表型进行单标记连锁分析（利用SPSS中的ANOVA，一般线性模型（General Linear Model）进行计算），发现来自5个基因的8个SNP位点成功与光合性状连锁，且P值全部小于0.01。其中，8个SNP位点的具体信息如下表6： 
表6 
表7 
利用了SNP连锁技术进一步说明了这些差异基因确实与光合效率相关。 
综上，以上实验结果表明，联合BSA法与基因芯片技术能够快速准确的检测杨树核基因组中净光合速率相关基因。 
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果： 
1）本发明结合BSA法与基因芯片技术，突出了净光合速率差异，快速检测光合作用这一 复杂生理过程的相关基因，为其它复杂性状或生理过程的研究开拓了思路。 
2）与以往检测光合作用相关基因相比，本发明着眼于在核基因组上对光合作用相关基因进行检测，而并非是局限于光合作用某一特定位点、过程或影响因素，是对光合作用在整体水平上的基因检测。 
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 
。

Claims (9)

1.一种检测核基因组中与表型性状相关基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，测量F1代杂交群体的目标表型性状，选取极端的目标表型性状；
S2，提取所述极端的目标表型性状个体的RNA，采用BSA法分组后构建表达谱基因芯片；
S3，根据所述表达谱基因芯片的信息找出表达有差异的基因，该基因即为核基因组中与目标表型性状相关的基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标表型性状为净光合速率。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，极端的净光合速率个体包括净光合速率高的个体15株，净光合速率低的个体15株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，提取所述极端的净光合速率个体的RNA每株2mg，所述净光合速率高的个体5株的RNA混为一池，3个生物学重复；所述净光合速率低的个体5株的RNA混为一池，3个生物学重复。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，通过杂交、图像处理、数据标准化对基因芯片进行数据分析，筛选出FC≥2，P<0.05的基因为表达有差异的基因。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：
S4，通过RT-PCR分析所述步骤S3中找出的表达有差异的基因的表达模式，验证基因芯片结果可靠性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进一步包括：通过与已知数据库进行比对，对所述步骤S3中找出的表达有差异的基因注释，进行功能分类。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中测量F1代杂交群体的目标表型性状每个个体测量次数大于3次。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测材料为杨树。
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