CN104293785A

CN104293785A - microRNA302s在制备抗肿瘤药物中的用途

Info

Publication number: CN104293785A
Application number: CN201410304621.9A
Authority: CN
Inventors: 李园; 王奕; 李艺波; 陈珂玲; 周斌; 周总光
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2014-06-30
Publication date: 2015-01-21

Abstract

本发明公开了SEQ ID NO.1～5所示的核苷酸序列，包含该序列的质粒和重组慢病毒，以及前述序列、质粒、慢病毒制备抗肿瘤药物的用途。本发明还公开了一种肿瘤筛查试剂盒，它包括检测细胞microRNA302a表达水平的试剂。本发明microRNA302s可以有效诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤增长，有较强的实际应用价值。

Description

microRNA302s在制备抗肿瘤药物中的用途

技术领域

本发明涉及microRNA302s的新用途。

背景技术

microRNAs(miRNAs)是人类新发现的一类非编码小分子RNA，广泛分布于真核细胞内。miRNAs通过与靶基因互补位点配对结合，在转录后水平负性调控靶基因的表达，参与生长发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等生命过程。成熟的miRNAs长17～24bp，一个miRNA分子能够调控多种基因。因而有研究发现，相对于编码蛋白质的mRNA分子来说，一些基因的表达更依赖于miRNAs的调控水平。

microRNA302s，即miR-302家族microRNA，包括miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d，成簇聚集在人类4号染色体上，是胚胎干细胞特异性表达的miRNAs。目前，关于miR-302家族microRNA，研究均集中在于胚胎发育相关的基因上，比如，研究发现，miR-302家族的每个成员都能同时调节大约445个基因，并且他们所调节的大部分基因都是相同的，这些基因的大多涉及早期胚胎发育相关的信号分子或影响细胞分化的细胞因子，转入miR-302s后可以抑制这些基因的作用，进而抑制组织细胞的分化，有可能把细胞重编程为胚胎干细胞样的状态。

发明内容

本发明提供了miR-302家族microRNA在制备抗肿瘤药物中的新用途。

首先，本发明提供了SEQ ID NO.1～5所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.1～4所示的核苷酸序列分别为miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d，SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列为miR-302a、miR-302b、miR-302c和miR-302d串联后的基因序列：miR-302s。

miR-302a:CCACCACUUAAACGUGGAUGUACUUGCUUUGAAACUAAAGAAGUAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGAUGG；

miR-302b:GCUCCCUUCAACUUUAACAUGGAAGUGCUUUCUGUGACUUUAAAAGUAAGUGCUUCCAUGUUUUAGUAGGAGU；

miR-302c:CCUUUGCUUUAACAUGGGGGUACCUGCUGUGUGAAACAAAAGUAAGUGCUUCCAUGUUUCAGUGGAGG；

miR-302d:CCUCUACUUUAACAUGGAGGCACUUGCUGUGACAUGACAAAAAUAAGUGCUUCCAUGUUUGAGUGUGG。

miR-302s(SEQ ID NO.5):

CCACCACTTAAACGTGGATGTACTTGCTTTGAAACTAAAGAAGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGATGGAGATCTGCTCCCTTCAACTTTAACATGGAAGTGCTTTCTGTGACTTTAAAAGTAAGTGCTTCCATGTTTTAGTAGGAGTCATATGCCTTTGCTTTAACATGGGGGTACCTGCTGTGTGAAACAAAAGTAAGTGCTTCCATGTTTCAGTGGAGGTCTAGACCTCTACTTTAACATGGAGGCACTTGCTGTGACATGACAAAAATAAGTGCTTCCATGTTTGAGTGTGG

本发明还提供了SEQ ID NO.1～5所示的核苷酸序列中的任意一个或任意多个序列在制备抗肿瘤药物中的用途。所述抗肿瘤药物是抗神经瘤药物。所述抗神经瘤药物是抗神经母细胞瘤药物。

本发明还提供了一种重组质粒，它包括SEQ ID NO.1～5任意一项所示的核苷酸序列。优选地，所述重组质粒是重组GV266质粒。

本发明还提供了所述重组质粒在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。优选地，所述抗肿瘤药物是抗神经瘤药物。进一步优选地，所述抗神经瘤药物是抗神经母细胞瘤药物。

本发明重组慢病毒，它包括SEQ ID NO.1～5任意一项所示的核苷酸序列。

本发明重组慢病毒，它包括前述重组质粒。

本发明还提供了所述重组慢病毒在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。优选地，所述抗肿瘤药物是抗神经瘤药物。进一步优选地，所述抗神经瘤药物是抗神经母细胞瘤药物。

本发明肿瘤细胞筛查试剂盒，它包括检测细胞microRNA302a表达水平的试剂。

优选地，所述抗肿瘤药物是抗神经瘤药物。进一步优选地，所述抗神经瘤药物是抗神经母细胞瘤药物。

本发明提供的SEQ ID NO.1～5所示的核苷酸序列，可以诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的生长，可用于制备抗肿瘤药物，本发明肿瘤细胞筛查试剂盒可以有效筛查待检细胞是否为肿瘤细胞，具有良好的临床应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1miR-302a在293细胞和SK细胞中的表达情况比较

图2目的基因真核表达载体构建流程图

图3载体图谱

图4Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp，2#：酶切的目的基因质粒；

图5电泳图说明：1#：阴性对照(ddH2O)；2#：阴性对照(空载自连对照组)；3#：阳性对照(GAPDH)；4#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp；5#-12#：hsa-mir-302,a,b,c,d串联1-8号转化子。

图6测序图谱，图6-1为第1～295bp的测序图谱；图6-2为第296～601bp的测序图谱；图6-3为第602～807bp的测序图谱；图6-4为第808～1081bp的测度图谱；图6-5为第1081～1159bp的测序谱图。

图7病毒感染图片(1E1uL100x b)

图8病毒感染图片(1E1uL100x g)

图9病毒感染图片(1E1uL100x r)

图10病毒感染图片(1E1uL200x b)

图11病毒感染图片(1E1uL400x b)

图12定量PCR实验结果

图13Real-time PCR检测慢病毒转染后miR-302s表达情况

图14miR-302a在SK-目的病毒转染细胞和SK-目对照细胞的表达情况

图15miR-302b在SK-目的病毒转染细胞和SK-目对照细胞的表达情况

图16miR-302c在SK-目的病毒转染细胞和SK-目对照细胞的表达情况

图17miR-302d在SK-目的病毒转染细胞和SK-目对照细胞的表达情况

图18SK-N-SH细胞感染后48hHoechst33342染色实验结果

图19SK-N-SH细胞感染后48hHoechst33342染色检测凋亡结果

图20流失细胞技术检测miR-302s过表达慢病毒转染后48h时间点SK-N-SH细胞凋亡率的变化情况

图21流失细胞技术检测miR-302s过表达慢病毒转染后72h时间点SK-N-SH细胞凋亡率的变化情况

图22SK-N-SH细胞感染后48h TUNEL染色实验结果

图23SK-N-SH细胞感染后48h TUNEL染色检测凋亡结果

图24CASP-3在SK正常细胞和miR-302s转染细胞中的表达情况

图25Bax在SK正常细胞和miR-302s转染细胞中的表达情况

图26MCL-1在SK正常细胞和miR-302s转染细胞中的表达情况

图27CCND-1在SK正常细胞和miR-302s转染细胞中的表达情况

图28BMI-1在SK正常细胞核miR-302s转染细胞中的表达比较

图29p16Ink4a在SK正常细胞核miR-302s转染细胞中的表达比较

图30p53在SK正常细胞核miR-302s转染细胞中的表达比较

图31Western Blotting检测BMI-1的表达情况

图32Western Blotting检测p16Ink4a，p53，Bax的表达情况

图33干扰前两组裸鼠的体重

图34干扰前两组裸鼠肿瘤体积

图35处死前称重图

图36处死前测得两组肿瘤体积图

图37处死前移植瘤活体比较图

图38处死前移植瘤活体比较图

图39处死后取得两组移植瘤瘤重比较图

图40处死后取得两组移植瘤比较图

图41移植瘤生长曲线图

图42移植瘤生长曲线图

图43移植瘤增长倍数图

具体实施方式

实施例1 肿瘤细胞的microR-302a表达情况

1、实验方法

(1)细胞复苏，培养，传代(293细胞和SK细胞)；293细胞：转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系；SK细胞：人类神经母细胞瘤细胞株；

(2)细胞种板(六孔板，每孔3×10⁵个)；

(3)细胞株总RNA提取(Trizol法)；

(4)逆转录反应(茎环逆转录stem-loop)，引物为

5’-GTCGTATCCAGTGCTGGGTCCGAGTGATTCGCACTGGATACGACTCACCA-3’；

(5)实时荧光定量PCR(Taqman)探针PCR技术，检测miR-302a的表达量，正常细胞计为1，使用的探针序列为：

5'-FAM-TCGTATCCAGTGCGAATCACTC-TAMRA-3'

(6)数据统计和分析。

2、实验结果

实验结果如图1和表1所示：

表1 miR-302a在293细胞和SK细胞中的表达情况

从实验结果可以看出，肿瘤细胞中miR-302a的表达水平显著低于正常细胞。实验说明，通过检测miR-302a的表达情况，可以筛查细胞是否为肿瘤细胞。

实施例2 构建包含本发明核苷酸序列的重组慢病毒

一、实验材料描述

细胞株：293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10％FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

菌株：大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

病毒载体：a)pGC-LV重组载体；b)pHelper1.0；c)pHelper2.0

DNA溶液的制备：以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装***中三种质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。

主要试剂：

主要仪器：

二、质粒构建

如图2所示，从含有目的基因的质粒中，利用PCR方法钓取目的基因，将目的载体进行酶切，酶切产物电泳回收后进行交换，其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的即为构建成功的目的质粒。

1、基因信息

化学合成的目的基因序列microR-302s(miR-302s)：

ACCGGTCCACCACTTAAACGTGGATGTACTTGCTTTGAAACTAAAGAAGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGATGGAGATCTGCTCCCTTCAACTTTAACATGGAAGTGCTTTCTGTGACTTTAAAAGTAAGTGCTTCCATGTTTT AGTAGGAGTCATATGCCTTTGCTTTAACATGGGGGTACCTGCTGTGTGAAACAAAAGTAAGTGCTTCCATGTTTCAGTGGAGGTCTAGACCTCTACTTTAACATGGAGGCACTTGCTGTGACATGACAAAAATAAGTGCTTCCATGTTTGAGTGTGGGCTAGC

说明：5’端下划线为Age I酶切位点，3’端下划线为NheI酶切位点。

2、工具载体:

载体名称：GV266

元件顺序：Ubi-MCS-IRES-puromycin

克隆位点：AgeI/NheI

载体图谱如图3所示：http://www.genechem.com.cn/Zaiti.aspx？zt＝GV266可下载载体说明书。

3、重组质粒的构建

3.1PCR产物交换入线性化表达载体

反应条件：

25℃30分钟→42℃15分钟

反应体系：

说明：

a)加入的线性化载体DNA和纯化的PCR产物的摩尔数比例为：1：3～1：9之间

b)阳性对照加入的纯化的PCR产物为GAPDH基因(同样带有交换臂)

3.2制备感受态细胞：

配置下述溶液：

1)0.1M CaCl₂溶液，以0.22μm过滤除菌。

2)250mM KCl溶液。

3)2M MgCl₂溶液，高压灭菌。

4)SOB:1ml250mM KCl溶液加入100ml LB，以5M NaOH调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml2M MgCl₂溶液。

用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞

1)从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml LB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转/分)。

2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。

3)于4℃以4000转/分离心10分钟，回收细胞。

4)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

5)以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。

6)于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。

7)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

8)每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份细胞沉淀。

9)将细胞分装成小份，放于-70℃冻存。

(感受态细胞制备参考：分子克隆实验指南第二版55页)

3.3转化：

1)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μL转移到无菌的微量离心管中，每管加10μL连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。

2)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的EP管架上，恰恰放置90秒，不要摇动EP管架。

3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l—2分钟。

4)每管加800μL LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏。

5)将150μL已转化的感受态细胞转移到AMP抗性(100ug/ml)的LB琼脂培养基上。

6)将平板置于室温直至液体被吸收。

7)倒置平皿，于37℃培养，16小时。

8)长出的克隆进行后续PCR鉴定。

(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)

3.4阳性克隆的PCR鉴定

载体酶切

用AgeI/NheI酶切化学合成的含有目的基因的质粒：

酶切反应体系：

ddH₂O	40.5μl
		10X buffer	5μl
100×BSA	0.5μl
		纯化的DNA质粒(1ug/μl)	2μl
EcoR I(20U/μl)	1μl
		NheI(5U/μl)	1μl
Total	50μl

将上述混合的反应物置于37℃，2h。

酶切片段大小：296bp，片段酶切电泳结果如图4所示。

3.5PCR鉴定重组克隆

PCR反应体系：

PCR反应条件：

94℃3min

94℃30sec

60℃30sec

72℃30sec

72℃5min

4℃∞

PCR结果如图5所示，阳性转化子PCR产物大小：503bp，阴性转化子PCR产物大小：282bp。

阳性克隆测序图谱如图6所示，测序结果如下：

AATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGACGAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGGTCCACCACTTAAACGTGGATGTACTTGCTTTGAAACTAAAGAAGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGATGGAGATCTGCTCCCTTCAACTTTAACATGGAAGTGCTTTCTGTGACTTTAAAAGTAAGTGCTTCCATGTTTTAGTAGGAGTCATATGCCTTTGCTTTAACATGGGGGTACCTGCTGTGTGAAACAAAAGTAAGTGCTTCCATGTTTCAGTGGAGGTCTAGACCTCTACTTTAACATGGAGGCACTTGCTGTGACATGACAAAAATAAGTGCTTCCATGTTTGAGTGTGGGCTAGCTAAGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGATGATGCCCAGAAAGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTACACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCCCGAACCACGGGACGTGCTTTCCTTTGAAAAACACGATGATATATGGCACAGTTACATGACCGAGTACAGCCACGGTGCGCCTCGCACCCGCGACGACATCCCAAGGGCGTAGCACCCTCGCGCCGCGTTGCCGACATACCCGCCCAGCCCAACGTCGATCGAACGCCCAATAAGTACCTGACTGCGAATCTTTCACGCTCGCTCGACTCGCAAGTGTTCGACCACGTCACGTGCACTGGTACTCGCAG

上述黑体部分即目的基因，实验结果说明，本发明成功地构建了包含目的基因microR-302s的重组GV266载体，其是一种pGC-LV重组载体，可用于慢病毒包装。

三、慢病毒包装

(一)、病毒包装细胞293T的培养

活细胞计数

用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/ml(一般稀释倍数为100倍)，在0.1ml的细胞悬液中加入0.1ml的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

细胞株的冻存

1.取培养2～3天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×10⁶～2×10⁷/ml。

2.在1ml细胞冻存管中加入0.5ml细胞悬液，0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亚砜(或甘油)，混匀后密封。置4℃1小时，-20℃2小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。

细胞复苏

1.从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。

2.迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。

3.用70％酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml含10％FBS的DMEM培养基，置温箱培养。

4.次日更换一次培养液后再继续培养。

细胞传代

1.弃去旧培养液，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。

2.加入2ml胰酶消化液，消化1-2min直到细胞完全消化下来。

3.加入含10％胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM培养基5ml，用刻度吸管吹打数次，将瓶壁上的细胞冲洗下来。

4.混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。

(二)、慢病毒包装

细胞转染

1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度为1.2x10⁷细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃、5％CO₂培养箱内培养。24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。

2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。

3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(重组pGC-LV载体(即步骤二制备的重组GV266载体)20μg，pHelper1.0载体15μg，pHelper2.0载体10μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟。

4)将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取100μl Lipofectamine2000试剂在另一管中与2.4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。

5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。

6)混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物。

7)将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃,5％CO₂细胞培养箱中培养。

8)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，10)轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。

9)每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基25ml，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48小时。

感染图片如图7～11所示。

(三)病毒的收获及浓缩

1.收集转染后48小时(转染即可为0小时计起)的293T细胞上清液。

2.于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。

3.以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。

4.把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19ml)，盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中。

5.组合好后，做好平衡，放在转头上。

6.在4000×g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。

7.离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。

8.将过滤杯倒扣在样品收集杯上。

9.离心力不超过1000g，时间为2分钟。过高转速会导致样品损失。把过滤杯从样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。

10.将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80度长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。

(四)滴度测定

样品制备

1.检测前一天，对293T细胞传代，每个24孔中加1×10⁵个细胞，体积为500μl；

2.次日，准备7～10个无菌的Ep管，在每个管中加入90μl的培养基(DMEM+10％FBS)；

3.取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管；

4.选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基。加入稀释好的病毒溶液。放入37℃，5％CO₂培养箱中培养；

5.24小时后，加入新鲜培养基500μl。小心操作，不要吹起细胞，维持细胞正常生长；

6.4天后，抽提RNA准备做RT-qPCR。

说明：

第一个Ep管中加入10μl病毒原液，记为1E+1μl；

第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep管中的1/10，记为1E+0μl；

第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep管中的1/10，记为1E-1μl；

依次类推…

第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep管中的1/10，记为1E-5μl；

总RNA抽提

说明：根据Invitrogen公司的TRIZOL操作说明书进行，均为RNase-free操作。

1.去细胞上清，每孔加入1mlTRIZOL吹打，室温静置5min，后转移至另一新的1.5ml eppendorf管中。

2.每管加入200μl氯仿，用力震荡15s，室温静置15min。

3.4℃，12000rpm，离心15min。

4.从每管中吸取上清至另一新的1.5ml eppendorf管。加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀后-20℃沉淀10min。

5.4℃，12000rpm离心10min后，去上清。

6.加入至少1ml4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。

7.4℃，10000rpm离心5min，弃上清。

8.4℃，10000rpm再次离心5min，吸去残液，室温干燥(不需完全干燥)。

9.加入20μlRNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。

RNA逆转录获cDNA

M-MLV逆转录酶和dNTP购自PROMEGA公司。Oligo dT购自上海生工。RNase-free的物品都购自Axygen。

说明：根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行,均为RNase－free操作。

Protocol:

1.将1μl Oligo dT(0.5μg/μl)和2.0μg Total RNA加入到PCR小管中，补充DEPC-H2O至9μl。混匀后离心，70℃温浴10min。之后立即***到0℃冰水浴中，使Oligo dT和模板退火。

2.按下表的比例，根据反应管数算出所需的试剂量。将M-MLV酶等在冰上混匀，得到RT反应液。

3.在每个反应管中加入的11μl的RT反应液,混匀后离心。

在每个反应管中加入的11μl的RT反应液,混匀后离心。

Real-time PCR检测

Real-time PCR在TAKARA的TP800上完成。SYBR Master Mixture来自TAKARA.

1.按下列比例配置反应体系：

2.设定程序为两步法Real-Time定量。预变性95℃，15S，之后每一步变性95℃，5S,退火延伸60℃，30S,共进行40个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。

Cycle1:(1X)

Step1:95.0℃for00:15.

Cycle2:(40X)

Step1:95.0℃for00:05.

Step2:60.0℃for00:30.

Data collection and real-time analysis enabled.

3.制作熔解曲线。PCR结束后，在95℃变性1min。然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30S,同时读取吸光值。

Cycle3:(1X)

Step1:95.0℃for01:00.

Cycle4:(1X)

Step1:55.0℃for01:00.

Cycle5:(81X)

Step1:55.0℃-95.0℃for00:30.

Increase set point temperature after cycle2by0.5℃

病毒滴度检测结果如表2所示：

表2 不同浓度病毒感染后样品组的Ct值及表达量分析

在本次滴度检测中，1.00E-04ul组样品和control组样品的Ct值存在3个左右差异，因此1.00E-04ul组样品中存在病毒颗粒。

假定该组样品含有至少有1个病毒颗粒，则病毒的滴度为：

1/(1.00E-04)*20＝2.00E+5TU/ul＝2.00E+8TU/ml。

实验结果说明，本发明成功地构建了慢病毒颗粒，其包含了目的基因microR-302s。

(五)包含microR-302s的质粒qPCR表达检测

1、总RNA抽提(根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行)

1)收集细胞，1000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1ml Trizol，迅速吹打后室温静置5min，然后转移至新的1.5ml eppendorf管中

2)每管加入200μl氯仿，用手上下颠倒eppendorf管15s，室温静置10min

3)4℃，12000rpm，离心15min

4)吸取上清移至新的1.5ml eppendorf管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃沉淀10min

5)4℃，12000rpm离心10min后，去上清

6)加入至少1ml75％乙醇(用DEPC处理过的水新鲜配制)，洗涤沉淀

7)4℃，10000rpm离心5min，弃去大部分上清

8)4℃，10000rpm再次离心5min，吸去上清

9)室温干燥

10)待RNA基本透明时，加入20μl RNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。

2、RNA逆转录获得cDNA

(根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行)M-MLV逆转录酶和dNTPs购自Promega公司，Oligo dT购自上海生工，RNase-free的物品都购自Axygen，具体步骤如下：

1)将1μl Oligo dT(0.5μg/μl)和2.0μg Total RNA加入到PCR小管中，补充DEPC-H₂O至9ul；混匀后离心，70℃温浴10min；之后立即置于0℃冰水混合物中冰浴，使OligodT和模板退火

2)按下表的比例配制反应体系(冰上进行)，混匀，短暂离心

注：dNTPs是dATP,dCTP,dGTP,dTTP的混合，浓度为10mM

3)上述体系在42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使RT酶失活

4)将得到的RT产物--cDNA置于-80℃保存备用

3、Real-time PCR检测

1)按下列比例配置反应体系：

2)设定程序为两步法Real-Time PCR：预变性95℃，15S；之后每一步变性95℃，5S；

退火延伸60℃，30S；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值

Cycle1:(1X)

Step1:95.0℃for00:15.

Cycle2:(45X)

Step1:95.0℃for00:05.

Step2:60.0℃for00:30.

Data collection and real-time analysis enabled

3)制作熔解曲线：PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4S,同时读取吸光值

Cycle3:(1X)

Step1:95.0℃for01:00.

Cycle4:(1X)

Step1:55.0℃for01:00.

Cycle5:(81X)

Step1:55.0℃-95.0℃for00:04.

Increase set point temperature after cycle2by0.5℃

定量PCR结果如表3～4和图12所示：

表3 定量PCR结果

说明：ΔCt＝hsa-miR-302aCt值-U6Ct值

-ΔΔCt＝NC组ΔCt平均值-各样品ΔCt

2-ΔΔCt反映各样品相对CON组样品hsa-miR-302a的相对表达水平

“—”代表由于目的基因在细胞中表达丰度太低，仪器没有读值

由于目的基因的低表达(Ct>31)导致复孔重复性不好是正常的

表4 定量PCR统计结果

从定量PCR结果可以看出，与对照组相比，本发明构建的含有慢病毒的细胞中，miR-302a基因的表达水平是前者的23倍以上(P<0.05)，

从定量PCR结果可以看出，人293T细胞中，相对于对照组，本发明重组质粒的hsa-miR-302a,hsa-miR-302b,hsa-miR-302c,hsa-miR-302d基因的表达水平可以达到NC的23倍以上(P<0.05)。

(六)转染过表达microR-302s后SK-N-SH细胞中microR302s的表达检测

1、实验方法

取步骤(三)构建的慢病毒感染SK-N-SH细胞，检测miR-302a在SK-目的病毒转染细胞和SK-目对照细胞的表达情况。

转染：

预实验提示在最佳条件下(Eni.S Enhanced Infection Solution中(pH7.4))，达到80％的感染效率需要的MOI＝10。

转染步骤：

1.实验前保证细胞的良好生长状态；

2.实验前一天接种2～3×10⁵个细胞/孔于6孔培养板中，所加培养基体积为2ml，经24h培养，细胞进入对数生长期，贴壁生长良好，开始转染；

3.实验当天，将细胞用温和PBS轻轻清洗2遍，加入转染增强液(Enhancement Solution吉凯公司提供)，按照MOI＝10的设计要求，稀释目的病毒，加入转染液，轻轻混匀；对照组加入空载病毒或空白转染液(病毒感染时细胞的融合率约为30～50％，密度为20～40％)；

4.转染8-12h后，弃含病毒转染液，温和PBS轻轻清洗细胞2遍，换正常培养液；

5.培养至转染后24h，再次清洗细胞，更换新鲜正常培养液；

6；培养至转染后48h，72h，时间点，收取细胞，开展下游实验。一次实验需要32个孔(12个对照孔，20个目的孔，再各自分为两种感染条件)。病毒感染时细胞的融合率约为30～50％，密度为20～40％。

2、实验结果

实验结果如图13～17以及表5～8所示：

表5 qPCR检测转染48h后microRNA-302a表达情况

SK-N-SH正常对照组	含miR-302s慢病毒转染组
		相对表达量	1	166.95
1	156.3

[0332]

	1	152.73

平均数	1	158.66

标准差	0	7.397925385

表6 qPCR检测转染48h后microRNA-302b表达情况

SK-N-SH正常对照组	含miR-302s慢病毒转染组
		相对表达量	1	23.97
1	22.62
			1	26.11

		平均数	1	24.23333333

		标准差	0	1.759839008

表7 qPCR检测转染48h后microRNA-302c表达情况

SK-N-SH正常对照组	含miR-302s慢病毒转染组
		相对表达量	1	36.75
1	37.22
			1	40.78

		平均数	1	38.25

		标准差	0	2.203610673

表8 qPCR检测转染48h后microRNA-302d表达情况

SK-N-SH正常对照组	含miR-302s慢病毒转染组
		相对表达量	1	14.25
1	12.22
			1	15.24

		平均数	1	13.90333333

		标准差	0	1.539556213

实验结果说明，转染本发明慢病毒后，细胞中microRNA-302a、microRNA-302b、microRNA-302c、microRNA-302d表达水平提高，说明本发明构建得到含有目的基因microR-302s的重组慢病毒。

实施例3 microR-302s对肿瘤细胞的影响实验

1、实验方法

取实施例2构建的含有目的基因microR-302s的重组慢病毒感染SK-N-SH细胞(人神经母细胞瘤细胞株)

(1)转染

转染步骤：

1.实验前保证细胞的良好生长状态；

5.培养至转染后24h，再次清洗细胞，更换新鲜正常培养液；

(2)Hoechst33342染色

加入适当量Hoechst33342染色液，必须充分覆盖住待染色的样品；

在适宜于细胞培养的温度培养20-30分钟；

弃染色液，用PBS或培养液洗涤2-3次即可进行荧光检测。

(3)流式细胞仪检测

本实验采用BD公司ANNEXIN V-FITC凋亡试剂盒，包括(ANNEXIN V-FITC和PI10X Binding Buffer缓冲液)，本实验可以将早期凋亡，晚期凋亡和死亡细胞区分开来。

1.消化细胞后用温和的PBS清洗两遍后将细胞悬浮在1X的结合缓冲液中，浓度调整为1×10⁶/ml；

2.取100ul，1×10⁵细胞数充分混合均匀的细胞悬液至流式试剂管标记待用；

3.加入5ul Annexin V-FITC和5ul PI，轻轻混匀；

4.加入400ul Binding Buffer，室温避光孵育15min，立即上机检测。

(4)Tunel染色检测

1.新鲜固定液固定风干细胞样本1h15-25℃；

2.PBS漂洗2次；

3.蛋白记号笔画圈，封闭液孵育10min15-25℃；

4.PBS漂洗2次；

5.加细胞通透液孵育2min(冰上)；

6.PBS漂洗2次；

7.玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。

8.PBS漂洗3次；

9.可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450～550nm，检测波长为515～565nm。

用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200～500个细胞)并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断(未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体)

(5)转染过表达miR-302s后SK细胞凋亡过程中相关指标的变化情况

SK-N-SH细胞株持续转染24h，转染后48h时间点，qPCR检测Mcl-1，CCND-1，CASP3，BAX等表达情况。

SK-N-SH细胞株持续转染24h，转染后48h，72h时间点，qPCR检测BMI-1，p16Ink4a，p53等表达情况。

SK-N-SH细胞株持续转染24h，转染后48h，72h时间点，Western Blotting检测Mcl-1，Caspase3Cleaved，BMI-1，p16Ink4a，p53等表达情况。

2、实验结果

(1)Hoechst33342染色结果

Hoechst33342染色实验结果如图18所示，细胞凋亡结果如图19以及表9所示：

表9 SK-N-SH细胞感染后48hHoechst33342染色检测凋亡结果

由Hoechst33342染色结果可以看出，含microR-302s病毒组的SK-N-SH细胞凋亡情况显著高于正常对照组，说明在肿瘤细胞内转入microR-302s可以诱导肿瘤细胞凋亡。

(2)流式细胞仪检测结果

流式细胞仪检测结果如图20～21以及表10～11所示：

表10 流失细胞技术检测miR-302s过表达慢病毒转染后48h时间点SK-N-SH细胞凋亡率的变化情况

转染后48h细胞早期凋亡率(％)	正常对照组	空载病毒组	慢病毒转染组
				5.9	5.6	25.8
	5.3	6	24.4
				5.2	6.2	23
平均数	5.466666667	5.933333333	24.4
				0.37859389	0.305505046	1.4

表11流失细胞技术检测miR-302s过表达慢病毒转染后72h时间点SK-N-SH细胞凋亡率的变化情况

	2	5.6	30.7
					2.7	5.9	35.8
	2.5	6	34.9
				平均数	2.4	5.833333333	33.8
标准差	0.360555128	0.2081666	2.722131518

根据流式细胞检测结果可以看出，含microR-302s病毒组的SK-N-SH细胞凋亡情况显著高于正常对照组和空载体病毒组，说明在肿瘤细胞内转入microR-302s可以诱导肿瘤细胞凋亡。

(3)Tunel染色检测结果

Tunel染色实验结果如图22所示，细胞凋亡结果如图23以及表12所示：

表12 SK-N-SH细胞感染后48h Tunel染色检测凋亡结果

由Tunel染色结果可以看出，含microR-302s病毒组的SK-N-SH细胞凋亡情况显著高于正常对照组，说明在肿瘤细胞内转入microR-302s可以诱导肿瘤细胞凋亡。

(4)转染过表达miR-302s后SK细胞凋亡过程中相关指标的变化情况

转染过表达miR-302s后SK细胞凋亡过程中相关指标的变化情况如图24～32以及表13～15所示：

表13 BMI-1在SK正常细胞核miR-302s转染细胞中的表达比较

编号	正常组	miR302s组转染后48h	miR302s组转染后72h
				1	1	0.511686946	0.392292049
2	1	0.567752215	0.337587487
				3	1	0.466516496	0.370274388
4	1	0.515318552	0.366717975
				平均		0.050715472	0.02752514

表14 p16Ink4a在SK正常细胞核miR-302s转染细胞中的表达比较

编号	正常组	miR302s组转染后48h	miR302s组转染后72h
				1	1	2.143546925	4.924577653
2	1	2.094588246	3.563594873
				3	1	2.193649959	4.093495568
4	1	2.143928377	4.193889365
				平均		0.049531958	0.686023118

表15 p53在SK正常细胞核miR-302s转染细胞中的表达比较

编号	正常组	miR302s组转染后48h	miR302s组转染后72h
				1	1	1.721102874	2.795939868
2	1	1.977028041	2.351095813
				3	1	1.844632387	2.60870414
4	1	1.847587767	2.585246607
				平均		0.127988177	0.223347824

实验结果说明，含microR-302s病毒组的SK-N-SH细胞中，涉及细胞凋亡的指标显著高于正常对照组，说明在肿瘤细胞内转入microR-302s可以诱导肿瘤细胞凋亡。

上述各种检测结果说明，含microR-302s(SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列)病毒组的SK-N-SH细胞的凋亡情况显著高于正常对照组，说明在肿瘤细胞内转入microR-302s可以诱导肿瘤细胞凋亡，microR-302s可以用于制备抗肿瘤药物。

实施例4 体内抑瘤实验

1、材料与方法：

1.1实验动物

Balb/c裸鼠十只，雄性，同周龄，周龄都在4～6w，购自四川成都市达硕生物科技有限公司。饲养与四川大学华西医院动物实验中心，层流净化室内饲养，笼子、垫料、水和食物均经过灭菌处理，SPF级饲养一周，接种前体重均在16～20g之间。

1.2细胞株

人神经母细胞瘤株SK-N-MC购自中国协和医科大学基础医学研究所医学细胞中心，于5％CO2、37℃、饱和湿度，培养在10％胎牛血清、加双抗的MEM培养液中。细胞生长至约80％融合度时用0.25％胰酶消化，1:2或1:3传代。实验细胞均处于对数生长期。

2、主要实验试剂

microRNA320a、microRNA320b、microRNA320c、microRNA320d agomir(双链RNA)，Negative Control agomir(广州锐博生物科技有限公司)

Negative Control：名称为cel-miR-239b-5p，miRNA编号：

MIMAT0000295，序列：UUUGUACUACACAAAAGUACUG

HyClone MEM培养基(美国Thermo Scientific公司)

HyClone 胎牛血清(美国Thermo Scientific公司)

3、主要实验仪器

3.1、恒温细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)

3.2、研究生物显微镜(日本Olympus公司)

3.3、游标卡尺(上海申韩量具有限公司)

3.4、电子秤(德国Sartorius公司)

4、实验方法

4.1细胞培养

4.11、细胞培养用液

(1)10×PBS缓冲液(细胞培养，pH7.2～7.4)：KCl2.0g+KH2PO42.0g+NaCl80.0g+NaHPO₄.12H₂O20.8g，补充ddH₂O至1000ml，充分溶解，高温灭菌，-20℃保存。使用时稀释10倍。

(2)胰酶细胞消化液：胰酶0.5g+1×PBS缓冲液200ml+EDTA0.02g，溶解1～2h，调节pH值7.5，0.22μm滤器过滤，分装，-20℃保存。

(3)青链霉素(PS)液：100万U青霉素(1g)+100万U链霉素，溶于100ml ddH₂O，0.22μm滤器过滤，分装，-20℃保存。

(4)L-谷氨酰胺溶液：L-谷氨酰胺3.0g溶于100ml ddH2O，0.22μm滤器过滤，分装，-20℃保存。使用时稀释100倍。

(5)NaHCO₃溶液(5.6％)：5.6g NaHCO₃溶于100ml ddH2O，0.22μm滤器过滤或高温灭菌，分装，-20℃保存。

(6)HEPES溶液(储存液1500～2000mmol/L)：36～50g HEPES溶于100ml ddH＝O中，0.22μm滤器过滤，分装，-20℃保存。使用时稀释100倍(终浓度为15～20mmol/L)。

(7)MEM培养液：MEM85ml+胎牛血清(FBS)10ml+L-谷氨酰胺1ml+青链霉素1ml，用NaHCO₃调整pH为7.2，4℃保存。

4.12、细胞复苏

4.13、细胞传代

4.2、裸鼠人神经母细胞瘤SK-N-MC皮下移植瘤模型建立以及处理

4.2.1移植瘤模型

取对数生长期SK-N-MC细胞，胰蛋白酶消化后，配成PBS单细胞悬液，调整细胞密度配成5×10⁷/ml,分别接种于裸鼠右侧腋窝皮下，每次每点注射液体量为0.2ml，以皮下结节直径5mm左右为成瘤标准，进行药物注射。

4.2.2实验分组以及处理干预

观察移植瘤的生长情况，第10天移植瘤平均直径大于5mm，先于给药前称重，按体重从小到大编号，按随机数字表第8行前十个数字，23,68,35,26，00,99,53,93,61,28。把随机数字从1到10排列，1到5对应的裸鼠分到对照组，6到10对应的裸鼠分到实验组。然后测量各组肿瘤的大小，干扰前两组裸鼠生长状态良好，计算体重(如图33)和肿瘤体积(如图34)差异无统计学意义，各项指标均无统计学意义。两组分别进行如下处理：对照组：瘤内多点注射negative control agomir，4nmol/只，溶于30ul生理盐水中，每四天一次。实验组：瘤内多点注射microRNA320a、microRNA320b、microRNA320c、microRNA320d agomir各1nmol，共4nmol/只，溶于30ul生理盐水中，每四天一次。

4.2.3一般情况观察及瘤体测量

给药期间每日观察各组裸鼠的精神状态、行动、饮食变化以及灵活性等一般情况。检测肿瘤生长情况，每三天用游标卡尺测量皮下肿瘤长泾(L)和短径(W)，并计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。同时每三天称裸鼠体重。

肿瘤体积(V)＝(LW²)/2

4.2.4裸鼠处死

最后一次注射药物后四天称裸鼠体重，测量体积并计算肿瘤体积增长倍数，麻醉后处死两组裸鼠，用手术器械完整取出移植瘤，称瘤重记录，拍两组瘤体照片。计算抑瘤率。

抑瘤率＝(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％

4.4统计学分析

采用SPSS16.0软件进行统计分析。所有数据均以均数±标准差表示。两样本间的比较采用t检验。双侧α＝0.05为检验标准，P<0.05认为差异有统计学意义。

5、实验结果

1、干预过程中裸鼠生长情况以及毒副作用观察

干预期间两组荷瘤裸鼠生长状态良好，无一只死亡，干预过程中未发现毒性作用，饮食正常，精神状态良好，活动状态良好。

2、裸鼠成瘤情况

10只裸鼠接种细胞后，第五天见皮下结节形成，并逐渐长大，成瘤率100％。第10天开始给予药物注射，移植瘤成圆形或卵圆形，给药前瘤体表面光滑，随着注射药物，部分瘤体变得不规则，有结痂形成。最后一次注射药物四天后，处死所有裸鼠，取移植瘤，经解剖，未发现有***转移，各脏器未见异常。取瘤组织HE染色，证实为神经母细胞瘤(NB)。

3、分组处理前两组荷瘤裸鼠肿瘤体积和体重的均衡性

两组荷瘤裸鼠干预前肿瘤体积和体重(如图33,34)，经t检验差异均无统计学意义(体重：F＝0.502P＝0.775。肿瘤体积：F＝0.001P＝0.359)，两组荷瘤裸鼠生长状态均良好。表明两组荷瘤裸鼠在干预前具有均衡性。

4、裸鼠移植瘤生长状态

观察过程中，发现干预后实验组荷瘤裸鼠的肿瘤生长明显慢于对照组。移植瘤生长曲线图如图41和图42。

处死前称重如图35(对照组：23.38±1.06g，实验组：23.62±1.28g)，两组平均体重比较差异无统计学意义(F＝1.427P＝0.718)。

处死前移植瘤活体比较如图37和图38，实验组荷瘤裸鼠的肿瘤生长明显慢于对照组。处死前测得两组肿瘤体积比较如表图36(对照组：2520.37±738.94mm3，实验组：968.08±708.49mm3)，差异有统计学意义(F＝0.058P＝0.009)。

处死后取得两组移植瘤，如图40所示，实验组荷瘤裸鼠的肿瘤明显小于对照组；对两组移植瘤称重，瘤重比较如图39(对照组2.03±0.91g，实验组0.81±0.75g)，差异有统计学意义(F＝0.037P＝0.048)，抑瘤率＝1-0.81/2.03＝60.10％。

移植瘤增长倍数如图43，实验组明显低于对照组(P＜0.05)。

本实验通过将人神经母细胞瘤细胞株SK-N-MC细胞悬液接种于裸鼠右侧腋窝皮下，成功构建了人神经母细胞瘤裸鼠移植瘤模型。以microRNA320a、microRNA320b、microRNA320c和microRNA320d作为药物干预，进行瘤内多点注射，并且以Negative Control作为阴性对照，用药四次后，两组裸鼠的平均体重无统计学差异。而实验组的移植瘤生长明显慢于对照组，甚至有移植瘤缩小的表现，用药结束后，实验组的移植瘤的体积明显小于对照组，差异有统计学意义。且称量移植瘤的重量显示，实验组的移植瘤重量明显小于对照组，差异有统计学意义，抑瘤率为60.1％。

实验结果说明，表明microRNA320a、microRNA320b、microRNA320c和microRNA320d(SEQ ID NO.1～4所示的核苷酸序列)有抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤药物，治疗神经母细胞瘤等肿瘤。

实施例5 本发明筛查试剂盒

1、本发明试剂盒(50人份)

(1)总RNA提取试剂

组分	浓度	体积
			Trizol	-	100ml
氯仿	-	20ml
			异丙醇	-	50ml
乙醇	75％	100ml
			DEPC水	-	50ml

(2)逆转录试剂

组分	浓度	体积
			Oligo dT	10mmol/L	100ul
5×RT buffer	5X	200ul
			Rnasin	5U/ul	50ul
M-MLV-RTase	5U/ul	50ul
			DEPC水	-	300ul
茎环引物	50mmol/L	50ul
			随机引物	0.05ug/ul	50ul

(3)Real-time PCR检测试剂

组分	浓度	体积
			PCR Buffer	10X	300ul
MgCl₂	25mM	300ul
			dNTP	2.5mM	360ul
上游引物	20uM	50ul
			下游通用引物	20uM	50ul
TaqMan探针	10uM	100ul
			Taq酶	5U/ul	30ul
ddH2O	-	2ml

上游引物：

MiR302a3PF:5’AAGTGCTTCCATGTTTTCCT3’Tm(JS)56

MiR302b3PF:5’AAGTGCTTCCATGTTTTAGT3’Tm(JS)54

MiR302c3PF:5’AAGTGCTTCCATGTTTCAGT3’Tm(JS)56

MiR302d3PF:5’GTGCTTCCATGTTTGAGTGT3’Tm(JS)58

下游通用引物：5'-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3'

TaqMan probe：5'-FAM-TCGTATCCAGTGCGAATCACTC-TAMRA-3'

2、本发明试剂盒使用方法

(1)细胞株总的RNA提取(Trizol法)；

(2)逆转录反应(茎环逆转录stem-loop两步法：RT1：70℃5min立即冰浴；RT2：16℃30min，42℃30min，85℃5min)；

(3)实时荧光定量PCR(Taqman)探针PCR技术(94℃3min预变性；两步法：94℃20S，60℃40S)；

(4)数据统计和分析。

实施例6 本发明筛查试剂盒

1、本发明试剂盒(50人份)

(1)总RNA提取试剂

(2)逆转录试剂

组分	浓度	体积
			Oligo dT	10mmol/L	200ul
5×RT buffer	5X	400ul
			Rnasin	5U/ul	100ul
M-MLV-RTase	5U/ul	100ul
			DEPC水	-	600ul
随机引物	0.05ug/ul	100ul

(3)Real-time PCR检测试剂

组分	浓度	体积
			PCR Buffer	10X	250ul
MgCl₂	25mM	250ul
			dNTP	2.5mM	300ul
BMI-1上游引物	20uM	40ul
			BMI-1下游引物	20uM	40ul
SYBGREEN染料	10uM	15ul
			甘油	-	125ul
Taq酶	5U/ul	40ul
			ddH₂O	-	2ml

BMI-1上游引物：

hBMI1F-1:5’GAAATCTAAGGAGGAGGTGA3’456Tm(P5)50.8,Tm(JS)58

BMI-1下游引物：

hBMI1R-1:5’catacatgacatcaatctgga3’

586Tm(P5)50.9,Tm(JS)56131bp。

2、本发明试剂盒使用方法

(1)细胞株总的RNA提取(Trizol法)，同上一RNA提取试剂盒；

(2)逆转录反应(普通逆转录反应，两步法：RT1：70℃5min立即冰浴；RT2：20℃10min，40℃60min，70℃10min)；

(3)实时荧光定量PCR技术(SYBGREEN荧光染料法94℃3min预变性；三步法40个循环：94℃30S，62℃40S，72℃1min；72℃5min)；

(4)数据统计和分析。

综上，microR-302a在肿瘤细胞中表达水平极显著低于正常细胞，可以通过检测microR-302a表达水平筛查待检细胞是否为肿瘤细胞。同时，本发明5种核苷酸序列可以有效诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤增生，可以***。

Claims

1.SEQ ID NO.1～5所示的核苷酸序列。

2.SEQ ID NO.1～5所示的核苷酸序列中的任意一个或任意多个序列在制备抗肿瘤药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述抗肿瘤药物是抗神经瘤药物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述抗神经瘤药物是抗神经母细胞瘤药物。

5.一种重组质粒，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1～5任意一项所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于：它是重组GV266质粒。

7.一种重组慢病毒，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1～5任意一项所示的核苷酸序列。

8.一种重组慢病毒，其特征在于：它包括权利要求5或6所述重组质粒。

9.权利要求5～8所述重组质粒或者重组慢病毒在制备抗肿瘤药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述抗肿瘤药物是抗神经瘤药物。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述抗神经瘤药物是抗神经母细胞瘤药物。

12.一种肿瘤筛查试剂盒，其特征在于：它包括检测细胞microRNA302a表达水平的试剂。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于：所述肿瘤是神经瘤。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于：所述神经瘤是神经母细胞瘤。