CN104293749B - 一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法 - Google Patents

Abstract

一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法，属于酶制剂、发酵技术领域。本发明将培养基优化和发酵过程控制组合优化，得出适合重组枯草芽孢杆菌培养方法；将重组枯草芽孢杆菌接入种子培养基后，摇床培养到对数生长期，接种一定量的种子液到调整后的发酵培养基中，用发酵罐进行发酵培养，每3h取样测定酶活力等参数。本发明采用组合优化的策略对重组枯草芽孢杆菌发酵产亮氨酸氨肽酶的条件进行了优化，将发酵培养基和发酵培养条件组合起来优化，使得重组枯草芽孢杆菌发酵产亮氨酸氨肽酶的能力得到了大幅度的提高，亮氨酸氨肽酶的酶活力达到605 U/mL。

Description

一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法

技术领域

本发明涉及一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法，属于酶制剂、发酵技术领域。

背景技术

氨肽酶是一类外肽酶，从蛋白质或肽链的N末端选择性切割氨基酸残基，作用范围较广。由氨肽酶的切割特性可知，氨肽酶的酶解产物为小肽和游离氨基酸。因此，氨肽酶具有非常重要的工业应用价值，能够既有效又环保地对蛋白质进行相关的水解反应，氨肽酶的应用广泛，可协助切掉肽链末端疏水性氨基酸，脱除蛋白水解物的苦味；与不同的内切酶复配，参与蛋白质的深度水解；制备多功能活性肽；还可以作为N端测序工具酶和医疗诊断用酶。蛋白序列测定的工具可以用到亮氨酰氨肽酶，作为融合产物或重组蛋白的固定剂。氨肽酶在医学研究中发现，其有助于许多疾病的治疗，可以用于从分子水平来研究许多生理现象。脯氨肽酶可以用于清除神经毒性的化学毒剂和有机磷农药，一方面可以用作解毒剂，另一方面可以用作环境的消毒剂。

微生物的发酵培养优化策略往往从培养基的优化和发酵过程控制两方面入手，目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某种微生物的培养基配方和发酵过程控制策略，且不同的微生物所适合的培养基和发酵过程控制策略都不尽相同，没有一种培养方法能够适合多种微生物的发酵培养，所以对某一特定微生物需要采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和试验方法将培养基组成和发酵过程控制等发酵策略组合优化才能选择出最适合的培养方法。

氨肽酶在食品、工业、医药等方面具有重要的研究价值和应用价值，但目前氨肽酶的发酵生产存在产量低的问题，如何提高产量成为迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的组合优化策略，解决现有发酵工艺中产量低，难以工业化应用的问题。

本发明的技术方案，一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法，步骤为：以重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600为出发菌株，将培养基优化和发酵过程控制组合优化，得出适合重组枯草芽孢杆菌培养方法；将重组枯草芽孢杆菌接入种子培养基后，摇床培养到对数生长期，接种一定量的种子液到调整后的发酵培养基中，用发酵罐进行发酵培养，每3h取样测定酶活力等参数。

发酵培养基的优化：

（1）种子液的制备：将-40℃甘油管保存的重组枯草芽孢杆菌菌种Bacillus subtilis WB600接入到种子培养基中，使用回转式恒温摇床进行培养，控制摇床转速为220rpm，培养温度为37℃，培养10h，得到种子液；

（2）摇床发酵培养：将产酶促进剂加入到发酵培养基中，再将种子液以5％的量接种到上述发酵培养基中，使用回转式恒温摇床进行培养，控制摇床转速为220rpm，培养温度为37℃，培养36h；

所述发酵培养基为：可溶性淀粉6g/L、豆粕20 g/L、酵母膏18 g/L、甘油2 mL/L、磷酸氢二钾6 g/L，氯化钴0.6 mmol/L、用去离子水配制；

所述产酶促进剂包括渗透压调节剂，有机酸盐，表面活性剂；

（3）将所得发酵液离心后取上清液，测定酶活力，确定产酶促进剂加入的种类和用量；

所述产酶促进剂包括渗透压调节剂（如氯化钾）、表面活活性剂（如吐温80）、有机酸盐（如谷氨酸钠、酒石酸钾）等。

发酵罐发酵工艺具体步骤为：

（1）种子液的制备：将-40℃甘油管保存的重组枯草芽孢杆菌菌种Bacillus subtilis WB600接入到种子培养基中，使用回转式恒温摇床进行培养，控制摇床转速为220rpm，培养温度为37℃，培养10h，得到种子液；

所述种子培养基为氯化钠10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L；

（2）发酵培养：将培养好的种子液以5％的量接种到7L发酵罐中，发酵罐的装液量为4L，通入无菌空气，搅拌转速250-450rpm，通气比为1.2﹕1，溶氧与搅拌转速偶联，维持最低溶氧在30％，发酵培养30h；

发酵培养过程的前12h的发酵培养温度为37℃，12h后发酵培养温度调整为30℃；发酵培养到15h时，一次性补加500g/L的葡萄糖补料液，使得发酵液中还原糖浓度为5g/L；

所述发酵培养基为可溶性淀粉20g/L、豆粕20 g/L、酵母膏18 g/L、甘油2 mL/L、磷酸氢二钾6 g/L、氯化钴0.6 mmol/L、氯化钾0.1 mol/L、谷氨酸钠0.6％、酒石酸钾0.7％、吐温-80 2.4 mL/L、用去离子水配制；

（3）参数测定：发酵过程中，每隔3h取样，测定亮氨酸氨肽酶酶活力、生物量。

亮氨酸氨肽酶酶活力测定方法为采用紫外分光光度法（LNA法）：

于2mL 50mmol/L pH8.5的Tris-HCl缓冲液中加入1mL稀释一定倍数的酶液，然后加入1mL的L-亮氨酸-对硝基苯胺，混合均匀，50℃水浴反应10min，于波长405 nm处测定吸光值。计算公式为：

式中：

X—样品的酶活力U/mL；

N—于波长405 nm处测定的吸光值；

Y—粗酶液的稀释倍数。

生物材料样品：菌种：重组枯草芽孢杆菌（含连接了来源于枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶基因全序列的PMA5质粒，宿主菌Bacillus subtilis WB600），详见中国专利CN102492645A。

本发明的有益效果：本发明采用组合优化的策略对重组枯草芽孢杆菌发酵产氨肽酶的条件进行了优化，将发酵培养基和发酵培养条件组合起来优化，使得重组枯草芽孢杆菌发酵产亮氨酸氨肽酶的能力得到了大幅度的提高，亮氨酸氨肽酶的酶活力达到605 U/mL。

附图说明

图1氯化钾对产酶和生物量的影响；

图2吐温-80对产酶和生物量的影响；

图3 酒石酸钾对产酶和生物量的影响；

图4 L-谷氨酸钠对产酶和生物量的影响；

图5初糖浓度为20 g/L发酵；

图6变温发酵；

图7补料发酵。

具体实施方式

实施例1

菌种：重组枯草芽孢杆菌（含连接了来源于枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶基因全序列的PMA5质粒，宿主菌Bacillus subtilis WB600）。

种子培养基：氯化钠10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L。

种子培养：将-40℃甘油管保存的重组枯草芽孢杆菌菌种接入到种子培养基中，使用回转式恒温摇床进行培养，控制摇床转速为220rpm，培养温度为37℃，培养10h。

将产酶促进剂（渗透压调节剂、表面活性剂、有机酸盐）分别以一定的量加入到装有未调整的发酵培养基（可溶性淀粉6 g/L、豆粕20 g/L、酵母膏18 g/L、甘油2mL/L、磷酸氢二钾6 g/L、氯化钴0.6 mmol/L、氯化钾0.1 mmol/L）的三角瓶中，接种5％的种子液后，使用回转式恒温摇床进行培养，控制摇床转速为220rpm，培养温度37℃，培养36h。培养结束后，发酵液离心取上清液测定亮氨酸氨肽酶酶活力。

结果表明：渗透压调节剂中氯化钾对产酶有较大促进作用，酶活力达到110U/mL，相对于对照，每毫升提高了40U；表面活性剂中吐温80对产酶有较大的促进作用，酶活力达到152U/mL，相对于对照，每毫升提高了82U；有机酸盐中谷氨酸钠和酒石酸钾对产酶有较大的促进作用，酶活力分别达到122U/mL、157U/mL，相对于对照每毫升分别提高了52U、87U。

氯化钾对产酶和生物量的影响如图1所示，吐温-80对产酶和生物量的影响如图2所示，酒石酸钾对产酶和生物量的影响如图3所示，L-谷氨酸钠对产酶和生物量的影响如图4所示。

对产酶有促进作用的4种产酶促进剂进行4因素3水平的正交实验，结果如表1所示。

确定4种产酶促进剂的用量及组合为氯化钾0.1 mol/L、谷氨酸钠0.6％、酒石酸钾0.7％、吐温-80 2.4 mL/L。在此组合下发酵液酶活达到207.6 U/mL。

表1正交实验设计与结果

实施例2

菌种、种子培养条件及种子培养基同实施例1。

发酵培养基：可溶性淀粉20 g/L、豆粕20 g/L、酵母膏18 g/L、甘油2mL/L、磷酸氢二钾6 g/L、氯化钴0.6 mmol/L、氯化钾0.1 mol/L、谷氨酸钠0.6％、酒石酸钾0.7％、吐温-80 2.4 mL/L。

（1）初糖浓度对发酵培养的影响

培养方法：将培养好的种子培养液以5％的量接种到7L发酵罐中进行发酵培养（装液量为4L），发酵温度37℃,在发酵过程中通入无菌空气，通气量为1.2﹕1，最低溶氧维持在30％，溶氧与转速相偶联，搅拌转速控制在250-450rpm，发酵培养时间为30h。发酵过程中，每隔3h取样，测定亮氨酸氨肽酶酶活力，生物量等参数。

结果表明：将发酵培养基中的可溶性淀粉浓度从6 g/L调整到20 g/L后，亮氨酸氨肽酶酶活力达到205 U/mL。

（2）分阶段控温对发酵培养的影响

培养方法：除温度控制外，其他发酵培养条件同实施例2（1），仅仅改变发酵培养温度，发酵过程0～12h中，发酵培养温度维持在37℃，当发酵进行到12h时，逐渐将发酵培养温度调整到30℃，并维持到发酵结束，发酵过程中，每隔3h取样，测定亮氨酸氨肽酶酶活力，生物量等参数。

结果表明，对发酵培养进行分阶段控温，使得重组枯草芽孢杆菌产酶能力有所提高，发酵所得酶活达到567 U/mL。

（3）补料对发酵培养的影响

培养方法：培养方法同实施例2（2），在发酵进行到15h时向发酵罐内一次性补加500g/L的葡萄糖补料液，使得发酵液中还原糖浓度为5 g/L。发酵过程中，每隔3h取样，测定亮氨酸氨肽酶酶活力，生物量等参数。

结果表明：发酵过程中进行补料，使得发酵所得的亮氨酸氨肽酶的酶活力到达605 U/mL，且发酵培养周期缩短了6h。

Claims (1)

1.一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法，其特征在于发酵罐发酵工艺具体步骤为：

（1）种子液的制备：将-40℃甘油管保存的重组枯草芽孢杆菌菌种Bacillus subtilis WB600接入到种子培养基中，使用回转式恒温摇床进行培养，控制摇床转速为220rpm，培养温度为37℃，培养10h，得到种子液；

所述种子培养基为氯化钠10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L；

重组枯草芽孢杆菌，含连接了来源于枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶基因全序列的PMA5质粒，宿主菌Bacillus subtilis WB600；

（2）发酵培养：将培养好的种子液以5％的量接种到7L发酵罐中，发酵罐的装液量为4L，通入无菌空气，搅拌转速250-450rpm，通气比为1.2︰1，溶氧与搅拌转速偶联，维持最低溶氧在30％，发酵培养30h；

发酵培养过程的前12h的发酵培养温度为37℃，12h后发酵培养温度调整为30℃；发酵培养到15h时，一次性补加500g/L的葡萄糖补料液，使得发酵液中还原糖浓度为5g/L；

所述发酵培养基为可溶性淀粉20 g/L、豆粕20 g/L、酵母膏18 g/L、甘油2 mL/L、磷酸氢二钾6 g/L，氯化钴0.6 mmol/L、用去离子水配制；产酶促进剂为：氯化钾0.1 mol/L、谷氨酸钠0.6％、酒石酸钾0.7％、吐温-80 2.4 mL/L；

（3）参数测定：发酵过程中，每隔3h取样，测定亮氨酸氨肽酶酶活力、生物量。