CN104292497A - 一种重组人源胶原蛋白生物海绵的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胶原蛋白生物海绵的制备方法，其包括将含壳聚糖的酸性溶液加入到含胶原蛋白的酸性溶液中，混合均匀后，注入模具，低温冷冻成型，对冷冻成型产物进行冷冻干燥，再浸泡入含原花青素的溶液中交联，洗涤后进行冷冻干燥，获得胶原蛋白生物海绵。本发明的生物海绵具有成形可控、不含杂质、适宜微孔结构、理化性能良好、生物相容性良好，无动物胶原海绵病毒隐患，且本发明的生物海绵质量稳定，成本低廉。
Description
本申请是分案申请，其母案为：母案申请号:2013104033090母案申请日:2013年09月06日母案发明名称：一种重组人源胶原蛋白生物海绵的制备方法。
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种胶原蛋白生物海绵的制备方法及其所制备的生物海绵。
背景技术
目前常用的胶原蛋白是从猪皮、牛皮、牛骨、鱼皮、鱼鳞等动物组织中提取而得，分子量不确定、分布范围广，且存在动物病毒隐患、应用于人体时又会产生异体或异种的排异反应等缺点和不足。本发明人的前期研究克服了这一缺陷：利用基因重组技术生产的人源胶原蛋白取代天然胶原。重组人源胶原蛋白是基于人Ⅲ型胶原蛋白α1链胶原域Gly-X-Y(甘氨酸-X-Y)的三肽重复序列特征，设计并人工合成一段人源胶原蛋白基因单体，通过一系列体外酶切连接，构建含有同向六串联人源胶原蛋白基因单体的表达载体，转入巴氏毕赤酵母菌，通过高密度发酵和分离、纯化而得。
具备网状多孔结构的胶原生物海绵是组织工程中重要的基质材料，可以模拟细胞外基质，利于细胞粘附和渗透，指引细胞分化和增殖以形成功能性目标组织，且对所负载药物具有缓释作用，从而在模拟细胞体内生长环境、建立体外细胞培养模型或者促进创伤的填充、修复、再生方面具有重要应用价值。
利用原花青素作为交联剂，有助于提高胶原蛋白与壳聚糖共聚海绵(或支架、膜)的机械性能，即将胶原蛋白和壳聚糖共溶于酸性溶液中，加入原花青素进行交联反应，然后装入模具中成型，但是一般只能形成薄膜形状(参见：林旭明，等.原花青素交联的支架材料的生物相容性研究.眼科新进展.27(4):262；党美珠.天然多酚改性鱼鳞胶原蛋白-壳聚糖膜复合材料的制备及其应用研究.华中农业大学学位论文集，等)。
现有技术在生物海绵成型后，要么直接使用，要么于室温或高温干燥，如果其中需要去除利用制备生物海绵时引入的酸，加入氢氧化钠、氨等碱性物质来中和。然而，前者只能临时制备使用，不利于生物海绵的产业化推广应用；而经本发明研究发现，后者需要严格控制加入的原花青素的量，否则不利于生物海绵的机械性能。另外，通过加入碱性物质来中和，尽管pH值能达到生理要求，但是会使得生物海绵中残留有铵盐、钠盐等盐，影响其使用范围，在体内或者直接接触伤口的使用中受到了极大的限制。
本发明人经过长期研究，偶然发现了一种制备流程，先将胶原蛋白和壳聚糖冷冻干燥成型，再使用含乙醇的原花青素溶液来交联，水洗后再冷冻干燥。整个过程都可以使用目前的成熟设备，制备过程对原花青素浓度不敏感，成本投入少，而且能够提高生物海绵的机械性能(如能支撑起蓬松的块状而不溃缩)，尤其是产品成型性好，完全依据模具成型，形成大小、尺寸、形状可控的海绵，尤其是能够形成非薄膜状，另外在此流程中能够去除酸性物质，不留有铵盐、钠盐等盐残留，且易于保存，便于更广泛的产业化推广。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种新的重组人源胶原蛋白生物海绵的制备方法。另外，本发明还提供了由该方法制备的生物海绵。
具体而言，在第一方面，本发明提供了一种胶原蛋白生物海绵的制备方法，其包括：
(1)将含壳聚糖的酸性溶液加入到含胶原蛋白的酸性溶液中，混合均匀后，注入模具，低温冷冻成型；
(2)对步骤(1)的冷冻成型产物进行冷冻干燥，获得初级生物海绵；
(3)将步骤(2)获得的初级生物海绵浸泡入含原花青素的溶液中交联，然后用水洗涤；
(4)对步骤(3)获得的洗涤产物进行冷冻干燥，获得胶原蛋白生物海绵；和，
(5)任选对胶原蛋白生物海绵进行剪裁。
在本文中，胶原蛋白优选为重组人源胶原蛋白。例如，本发明的重组人源胶原蛋白可以是中国专利200610098297.5所公开的方法获得的重组人源胶原蛋白，更优选的是，通过专利公开号CN102443057A提供的高密度发酵和纯化方法，利用通过不同重复数同向串联基因重组质粒所构建的巴氏毕赤酵母基因工程菌(菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.5021)而生产的重组人源胶原蛋白。人源胶原蛋白比起动物(尤其是非哺乳动物)胶原蛋白而言，对人体的使用安全性更为可靠，尽管机械强度会差一些。
在本文中，低温是低于-10℃。通常利用液氮、干冰能够形成稳定的低温，当然市售的冰箱中有能够稳定维持-80℃的冰箱，也可以采用。所以，优选在本发明的第一方面的制备方法中，步骤(1)中的低温是-20～-195℃，优选是-20～-80℃，如-80℃。
优选在本发明的第一方面的制备方法中，步骤(1)中混合均匀后的胶原蛋白和壳聚糖的质量比例为0.05～10:1，优选是0.1～9:1，更加优选是本发明实施例中机械强度高的所对应的质量比例。一些优选的实施例，在块状的情况下，已经相当于现有技术制备的密度更高的薄膜状的机械强度了。
优选在本发明的第一方面的制备方法中，步骤(1)中的含壳聚糖的酸性溶液中壳聚糖的含量为0.05～7％(w/w)，优选为0.1～5％(w/w)，更加优选是本发明实施例中机械强度高的所对应的含量。壳聚糖可以通过市售渠道方便地获得。
优选在本发明的第一方面的制备方法中，步骤(1)中的含胶原蛋白的酸性溶液中胶原蛋白的含量为0.05～7％(w/w)，优选为0.1～5％(w/w)，更加优选是本发明实施例中机械强度高的所对应的含量。
本发明人研究发现，如果不添加乙醇，即使经过冷冻步骤，机械强度也会有约一个数量级的下降。所以，优选在本发明的第一方面的制备方法中，步骤(3)中的溶液含无水乙醇，其中无水乙醇的含量为5～60％(V/V)，优选为10～50％(V/V)，更加优选是本发明实施例中机械强度高的所对应的含量。
在本文中，酸性溶液优选是乙酸溶液，如0.3～7％(w/w)乙酸溶液，优选是0.5～5％(w/w)乙酸溶液，更加优选是本发明实施例中机械强度高的所对应的乙酸溶液。优选在本发明的第一方面的制备方法中，步骤(3)中的溶液的pH值为5～9.5，优选为6～9，更加优选是本发明实施例中机械强度高的所对应的pH。
在本文中，浸泡入含原花青素的溶液中是浸泡入过量含原花青素的溶液中，即浸泡前后溶液中原花青素的含量基本不变，如前后浓度仅仅下降不超过10％，或仅仅下降不超过5％。这通过较大的盛装溶液的容器并大量注入溶液即可实现。本发明人发现，原花青素浓度对于生物海绵的机械强度有一定影响。优选在本发明的第一方面的制备方法中，步骤(3)中的溶液的原花青素的含量为0.01～5％(w/w)，优选为0.05～4％(w/w)，更优选为0.08～3％(w/w)，最优选为0.1～2％(w/w)，如本发明实施例中机械强度高的所对应的含量。
在本文中，洗涤是为了除去不反应物，如盐和酸碱。实践中，洗涤后的pH是洗涤的可操作指标，将生物海绵洗涤至pH中性或接近中性，可以表示洗涤的完成。优选在本发明的第一方面的制备方法中，步骤(3)中的洗涤是洗涤至pH6.5～7.5，优选是6.8～7.2。
在本文中，本发明的生物海绵可以根据模具的形状进行定形。通过模具的大小和形状，可以根据实际需求制成任意形状和大小，如长方体、立方体、圆柱体、圆台形，等等。而现有技术制备的基本上是薄膜状(或者称“膜”)的，厚度一般不超过0.1cm，甚至能够透光。优选在本发明的第一方面的制备方法中，胶原蛋白生物海绵不是薄膜状的，优选是不透光的，更优选是块状的，如优选块状的(小于长和/或宽的)高度大于0.1cm，优选不小于0.2cm，更不小于0.5cm，更加优选不小于1cm，如不小于2cm、3cm或5cm。
在第二方面，本发明提供了本发明的第一方面的制备方法制备的胶原蛋白生物海绵。优选胶原蛋白生物海绵不是薄膜状的，优选是不透光的，更优选是块状的，如优选块状的(小于长和/或宽的)高度大于0.1cm，优选不小于0.2cm，更不小于0.5cm，更加优选不小于1cm，如不小于2cm、3cm或5cm。在本发明实施例中提供了大量不同方法制备的胶原蛋白生物海绵，更加优选其中机械强度高的。
在第三方面，本发明提供了本发明的第二方面的胶原蛋白生物海绵在制备非即时使用的药物载体中的应用。其中，优选药物载体是药物释放载体、组织和/或创伤的填充物和/或修复物、或组织工程支架。由于本发明的生物海绵成形性好，方便了直接使用或剪裁的余地，所以使用的适应性好；加之不含杂质，引起的副作用或不良反应将极大程度被避免。这些优势是现有技术所无法企及的。
本发明的有益效果在于，本发明的重组人源胶原蛋白生物海绵，成形性好，可以制成任意大小和形状(不限于薄膜状)，而且不含杂质，另外具有适宜微孔结构、理化性能良好、生物相容性良好，可以用于外科手术，构建细胞体外三维培养模型，制备药物释放器械、组织和创伤的填充和修复器械、组织工程支架；另外，其制备方法质量可控而稳定，成本低廉。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。
附图说明
图1和图2显示了本发明的生物海绵，其形状完全可以根据模具而确定，可以制备得很厚(至少不能透光)，不限于薄膜状。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，其中所用的试剂、原料都是现有产品，如胶原蛋白是根据本发明人早期中国专利ZL200610098297.5所制备的重组人源胶原蛋白，壳聚糖可购自生工生物工程(上海)股份有限公司，原花青素可购自天津市尖峰天然产物研究开发有限公司。
实施例1重组人源胶原蛋白生物海绵的制备1
将重组人源胶原蛋白溶于3％(w/w)乙酸水溶液中，配制成5％(w/w)重组人源胶原蛋白溶液；将壳聚糖溶于3％(w/w)乙酸水溶液中，配制成5％(w/w)壳聚糖溶液；另外，将原花青素溶于含10％(v/v)无水乙醇的磷酸盐缓冲液(pH6)中，配制成0.5％(w/w)原花青素溶液。
在冰浴条件下，将壳聚糖溶液滴入重组人源胶原蛋白溶液，期间搅拌，直至重组人源胶原蛋白与壳聚糖的质量比例为0.1:1时，继续搅拌240分钟，用真空脱泡机真空脱泡，然后将混合溶液注入模具中，在-80℃温度下冷冻成型，再置于真空冷冻干燥机(日本东京理化器械公司的FDU-1200型号，参照其厂商说明条件来冷冻干燥)中冷冻干燥，形成初级生物海绵。然后，将初级生物海绵于室温(25℃)浸泡于原花青素溶液中交联48小时，而后用去离子水浸泡，期间换水多次(如，3次)，直至洗脱的水的pH达到6.8或以上，再次置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得重组人源胶原蛋白生物海绵。
实施例2重组人源胶原蛋白生物海绵的制备2
将重组人源胶原蛋白溶于3％(w/w)乙酸水溶液中，配制成4％(w/w)重组人源胶原蛋白溶液；将壳聚糖溶于3％(w/w)乙酸水溶液中，配制成4％(w/w)壳聚糖溶液；另外，将原花青素溶于含20％(v/v)无水乙醇的磷酸盐缓冲液(pH6)中，配制成2％(w/w)原花青素溶液。
在冰浴条件下，将壳聚糖溶液滴入重组人源胶原蛋白溶液，期间搅拌，直至重组人源胶原蛋白与壳聚糖的质量比例为0.25:1时，继续搅拌180分钟，用真空脱泡机真空脱泡，然后将混合溶液注入模具中，在-80℃温度下冷冻成型，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，形成初级生物海绵。然后，将初级生物海绵于室温(25℃)浸泡于原花青素溶液中交联48小时，而后用去离子水浸泡，期间换水多次(如，3次)，直至洗脱的水的pH达到6.8或以上，再次置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得重组人源胶原蛋白生物海绵。
实施例3重组人源胶原蛋白生物海绵的制备3
将重组人源胶原蛋白溶于2％(w/w)乙酸水溶液中，配制成2％(w/w)重组人源胶原蛋白溶液；将壳聚糖溶于2％(w/w)乙酸水溶液中，配制成2％(w/w)壳聚糖溶液；另外，将原花青素溶于含20％(v/v)无水乙醇的磷酸盐缓冲液(pH6.8)中，配制成1％(w/w)原花青素溶液。
在冰浴条件下，将壳聚糖溶液滴入重组人源胶原蛋白溶液，期间搅拌，直至重组人源胶原蛋白与壳聚糖的质量比例为0.5:1时，继续搅拌120分钟，用真空脱泡机真空脱泡，然后将混合溶液注入模具中，在-80℃温度下冷冻成型，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，形成初级生物海绵。然后，将初级生物海绵于室温(25℃)浸泡于原花青素溶液中交联48小时，而后用去离子水浸泡，期间换水多次(如，3次)，直至洗脱的水的pH达到7.0，再次置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得重组人源胶原蛋白生物海绵。
实施例4重组人源胶原蛋白生物海绵的制备4
将重组人源胶原蛋白溶于4％(w/w)乙酸水溶液中，配制成1.5％(w/w)重组人源胶原蛋白溶液；将壳聚糖溶于4％(w/w)乙酸水溶液中，配制成1.5％(w/w)壳聚糖溶液；另外，将原花青素溶于含30％(v/v)无水乙醇的磷酸盐缓冲液(pH7)中，配制成1.5％(w/w)原花青素溶液。
在冰浴条件下，将壳聚糖溶液滴入重组人源胶原蛋白溶液，期间搅拌，直至重组人源胶原蛋白与壳聚糖的质量比例为1:1时，继续搅拌120分钟，用真空脱泡机真空脱泡，然后将混合溶液注入模具中，在-80℃温度下冷冻成型，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，形成初级生物海绵。然后，将初级生物海绵于室温(25℃)浸泡于原花青素溶液中交联48小时，而后用去离子水浸泡，期间换水多次(如，3次)，再次置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得重组人源胶原蛋白生物海绵。
实施例5重组人源胶原蛋白生物海绵的制备5
将重组人源胶原蛋白溶于1％(w/w)乙酸水溶液中，配制成1％(w/w)重组人源胶原蛋白溶液；将壳聚糖溶于1％(w/w)乙酸水溶液中，配制成1％(w/w)壳聚糖溶液；另外，将原花青素溶于含40％(v/v)无水乙醇的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，配制成0.5％(w/w)原花青素溶液。
在冰浴条件下，将壳聚糖溶液滴入重组人源胶原蛋白溶液，期间搅拌，直至重组人源胶原蛋白与壳聚糖的质量比例为1:1时，继续搅拌60分钟，用真空脱泡机真空脱泡，然后将混合溶液注入模具中，在-80℃温度下冷冻成型，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，形成初级生物海绵。然后，将初级生物海绵于室温(25℃)浸泡于原花青素溶液中交联48小时，而后用去离子水浸泡，期间换水多次(如，3次)，直至洗脱的水的pH达到7.2或以下，再次置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得重组人源胶原蛋白生物海绵。
实施例6重组人源胶原蛋白生物海绵的制备6
将重组人源胶原蛋白溶于1％(w/w)乙酸水溶液中，配制成1％(w/w)重组人源胶原蛋白溶液；将壳聚糖溶于1％(w/w)乙酸水溶液中，配制成1％(w/w)壳聚糖溶液；另外，将原花青素溶于含40％(v/v)无水乙醇的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，配制成1％(w/w)原花青素溶液。
在冰浴条件下，将壳聚糖溶液滴入重组人源胶原蛋白溶液，期间搅拌，直至重组人源胶原蛋白与壳聚糖的质量比例为2:1时，继续搅拌60分钟，用真空脱泡机真空脱泡，然后将混合溶液注入模具中，在-80℃温度下冷冻成型，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，形成初级生物海绵。然后，将初级生物海绵于室温(25℃)浸泡于原花青素溶液中交联48小时，而后用去离子水浸泡，期间换水多次(如，3次)，直至洗脱的水的pH达到7.2或以下，再次置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得重组人源胶原蛋白生物海绵。
实施例7重组人源胶原蛋白生物海绵的制备7
将重组人源胶原蛋白溶于0.5％(w/w)乙酸水溶液中，配制成0.5％(w/w)重组人源胶原蛋白溶液；将壳聚糖溶于0.5％(w/w)乙酸水溶液中，配制成0.5％(w/w)壳聚糖溶液；另外，将原花青素溶于含50％(v/v)无水乙醇的磷酸盐缓冲液(pH8)中，配制成0.2％(w/w)原花青素溶液。
在冰浴条件下，将壳聚糖溶液滴入重组人源胶原蛋白溶液，期间搅拌，直至重组人源胶原蛋白与壳聚糖的质量比例为4:1时，继续搅拌30分钟，用真空脱泡机真空脱泡，然后将混合溶液注入模具中，在-80℃温度下冷冻成型，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，形成初级生物海绵。然后，将初级生物海绵于室温(25℃)浸泡于原花青素溶液中交联48小时，而后用去离子水浸泡，期间换水多次(如，3次)，直至洗脱的水的pH达到7.2或以下，再次置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得重组人源胶原蛋白生物海绵。
实施例8重组人源胶原蛋白生物海绵的制备8
将重组人源胶原蛋白溶于0.5％(w/w)乙酸水溶液中，配制成0.1％(w/w)重组人源胶原蛋白溶液；将壳聚糖溶于0.5％(w/w)乙酸水溶液中，配制成0.1％(w/w)壳聚糖溶液；另外，将原花青素溶于含10％(v/v)无水乙醇的磷酸盐缓冲液(pH9)中，配制成0.1％(w/w)原花青素溶液。
在冰浴条件下，将壳聚糖溶液滴入重组人源胶原蛋白溶液，期间搅拌，直至重组人源胶原蛋白与壳聚糖的质量比例为9:1时，继续搅拌30分钟，用真空脱泡机真空脱泡，然后将混合溶液注入模具中，在-80℃温度下冷冻成型，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，形成初级生物海绵。然后，将初级生物海绵于室温(25℃)浸泡于原花青素溶液中交联48小时，而后用去离子水浸泡，期间换水多次(如，3次)，直至洗脱的水的pH达到7.2或以下，再次置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得重组人源胶原蛋白生物海绵。
实施例9比较例
重复以上实施例的过程制备对照生物海绵，所不同的是不经过冷冻干燥，而是都在室温下晾干。室温下晾干的对照都会在干燥过程中溃缩，只能够形成薄膜状，无法维持蓬松的块状结构。
将上述实施例制备的生物海绵切成小块(对照的测量厚度取相当于本发明实施例的厚度用上述方法制备后溃缩而得到的厚度，约1cm厚度经非本发明优化的方法制备，会溃缩成约0.08cm)，受压固定后以100mm/min的速率匀速拉伸至材料断裂，测定上述实施例和对照生物海绵的拉伸强度，结果如表1所示。结果表明，采用本发明的原花青素的浸泡交联，能够提高生物海绵的机械强度，尤其是对于胶原蛋白和壳聚糖比例大的情况，提高幅度更大，其更为蓬松的块状结构的机械强度已经能够相当于现有技术制备的密度更高的薄膜状体了。
表1生物海绵的拉伸强度(MPa)
| 生物海绵 | 初级生物海绵 | 对照生物海绵 | 对照初级生物海绵 | |
| 实施例1 | 58.6 | 28.4 | 37.6 | 27.8 |
| 实施例2 | 61.7 | 27.2 | 42.2 | 28.1 |
| 实施例3 | 59.3 | 26.3 | 40.7 | 26.4 |
| 实施例4 | 56.9 | 26.1 | 37.1 | 24.7 |
| 实施例5 | 57.2 | 14.3 | 36.8 | 15.2 |
| 实施例6 | 56.0 | 14.1 | 35.7 | 12.9 |
| 实施例7 | 58.2 | 12.9 | 37.3 | 11.5 |
| 实施例8 | 55.3 | 13.7 | 34.5 | 13.6 |
实施例10毒性试验
体外皮肤刺激测试：将4只健康(皮肤无红肿、水肿、破损的)兔背部脊柱两侧毛发除去约10cm2面积，取实施例1制备的生物海绵贴敷在左侧区域，右侧区域不贴敷作为对照，观察贴敷1、12、24、48、72小时后的皮肤状况。在以上时段，所有兔的贴敷区域均无红肿、水肿、破损、色素沉着、皮肤***糙或变薄等现象产生，而其中有一只兔的不贴敷区域产生了破损现象，预计这是由于皮肤暴露在外而受到机械损伤所致。结果表明，本发明的生物海绵体外使用安全无毒，尤其是透气性能佳，即使长达三天贴敷，也没有对皮肤造成不良反应。
细胞毒性测试：取人皮静脉内皮细胞(可购自中科院上海细胞库)，置于含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，将实施例1制备的生物海绵Co60灭菌后根据国家标准GB/T16886.12-2005所述的方法切成5mm×5mm×25mm的小块，按1.25cm2/mL的浸提比例浸泡于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃浸提24h，取浸提后的培养基，根据GB/T16886.5-2003所述的方法进行细胞培养，空白含没有浸泡过的10％胎牛血清的DMEM培养基作为对照。与对照组对比，试验组没有发现在贴壁细胞生长速度、数量以及形态上具有区别，表明本发明的生物海绵对体内细胞无毒。
Claims (10)
1.一种胶原蛋白生物海绵的制备方法，其由如下步骤组成：
(1)将含壳聚糖的酸性溶液加入到含胶原蛋白(优选为重组人源胶原蛋白)的酸性溶液中，混合均匀后，注入模具，低温冷冻成型；
(2)对步骤(1)的冷冻成型产物进行冷冻干燥，获得初级生物海绵；
(3)将步骤(2)获得的初级生物海绵浸泡入含原花青素的溶液中交联，然后用水洗涤；
(4)对步骤(3)获得的洗涤产物进行冷冻干燥，获得胶原蛋白生物海绵，其中胶原蛋白生物海绵是不透光且块状的，其中所述块状的小于长和/或宽的高度大于0.1cm，优选不小于0.2cm，更不小于0.5cm，更加优选不小于1cm，如不小于2cm、3cm或5cm；和，
(5)任选对胶原蛋白生物海绵进行剪裁。
2.权利要求1所述的制备方法，其中步骤(1)中的低温是-20～-195℃，优选是-20～-80℃，如-80℃。
3.权利要求1所述的制备方法，其中步骤(1)中混合均匀后的胶原蛋白和壳聚糖的质量比例为0.05～10:1，优选是0.1～9:1。
4.权利要求1所述的制备方法，其中步骤(1)中的含壳聚糖的酸性溶液中壳聚糖的含量为0.05～7％(w/w)，优选为0.1～5％(w/w)；和/或，步骤(1)中的含胶原蛋白的酸性溶液中胶原蛋白的含量为0.05～7％(w/w)，优选为0.1～5％(w/w)。
5.权利要求1所述的制备方法，其中步骤(3)中的溶液含无水乙醇，其中无水乙醇的含量为5～60％(V/V)，优选为10～50％(V/V)；和/或，步骤(3)中的溶液的pH值为5～9.5，优选为6～9。
6.权利要求1所述的制备方法，其中步骤(3)中的溶液的原花青素的含量为0.01～5％(w/w)，优选为0.05～4％(w/w)，更优选为0.08～3％(w/w)，最优选为0.1～2％(w/w)。
7.权利要求1所述的制备方法，其中步骤(3)中的洗涤是洗涤至pH6.5～7.5，优选是6.8～7.2。
8.权利要求1～7之任一所述的制备方法制备的胶原蛋白生物海绵；优选按照实施例1～8所述的方法制备的胶原蛋白生物海绵。
9.权利要求8所述的胶原蛋白生物海绵，其由如下方法制备：
将重组人源胶原蛋白溶于3％(w/w)乙酸水溶液中，配制成4％(w/w)重组人源胶原蛋白溶液；将壳聚糖溶于3％(w/w)乙酸水溶液中，配制成4％(w/w)壳聚糖溶液；另外，将原花青素溶于含20％(v/v)无水乙醇的pH6磷酸盐缓冲液中，配制成2％(w/w)原花青素溶液；
在冰浴条件下，将壳聚糖溶液滴入重组人源胶原蛋白溶液，期间搅拌，直至重组人源胶原蛋白与壳聚糖的质量比例为0.25:1时，继续搅拌180分钟，用真空脱泡机真空脱泡，然后将混合溶液注入模具中，在-80℃温度下冷冻成型，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，形成初级生物海绵；
然后，将初级生物海绵于25℃浸泡于原花青素溶液中交联48小时，而后用去离子水浸泡，期间换水多次，直至洗脱的水的pH达到6.8或以上，再次置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得重组人源胶原蛋白生物海绵。
10.权利要求8或9所述的胶原蛋白生物海绵在制备非即时使用的药物载体中的应用；优选药物载体是药物释放载体、组织和/或创伤的填充物和/或修复物、或组织工程支架。
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| CN104292497B (zh) | 2017-08-25 |
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