CN104273176B - 一种植物有机物-枯草芽孢杆菌混合菌剂、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物有机物‑枯草芽孢杆菌混合菌剂制备方法和应用。该菌剂以植物有机物印楝渣、茶枯和棕榈仁粕中一种或多种作为枯草芽孢杆菌HN09的培养基主要原料及其菌剂的吸附载体，经过二次发酵腐熟制备成，其活性成分包括上述植物有机物、枯草芽孢杆菌HN09和它发酵代谢物。该菌株于2013年4月26日保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC7524。该菌株及其菌剂可用于防治植物病害和土壤害虫，也可促进植物生长和对氮吸收，对扩大病虫害防治范围和促进农业废物循环利用具有重要意义，在生产实践中具有广泛应用前景。

Description

一种植物有机物-枯草芽孢杆菌混合菌剂、制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物农药和植物保护领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌菌株HN09和它的植物有机物-生防菌混合菌剂的制备方法，及其在植物病虫害防治中的应用。

背景技术

植物有机物印楝渣、茶枯和棕榈仁粕是印楝种子、茶籽和棕榈仁加工过程的农副产品下脚料，由于利用率低，通常作为废弃物丢弃。这显然不符合农业可持续发展的目的，因此需要寻找一种有效再利用这些农副产品下脚料的方法。鉴于这些植物有机物仍然含有大量的有机物质和植物蛋白等营养成分，可以用作微生物的培养基原料，将生防菌添加到这些植物有机物中，不仅可以加快植物有机物腐熟进程，同时这些植物有机物中的养分可以保证生防菌菌株大量生长繁殖，两者辅助作用既可以发挥生防菌防治病害作用又可以利用植物有机物提供的养分促进植物生长；而且印楝渣和茶枯等这些植物有机物本身仍然含有少量具有杀虫、抗菌作用的活性成分，和生防菌配合使用起到增效作用，可以扩大病虫害防治范围；此外，这些植物有机物纤维含量高，还可以代替蛭石、珍珠岩等不可再生资源作为生物菌剂的新型植物性吸附载体。

现有技术中，植物有机物印楝渣、茶枯和棕榈仁粕如果直接使用，会造成植物伤苗现象，因此通过合适方法使这些植物有机物完成腐熟过程是有必要的。虽然已有报道将生防菌与农药或植物药剂复配例子，但不同于以上述植物有机物作为主要培养基生长发酵腐熟进而制备菌剂，筛选到既能耐受上述植物有机物中所含不利成分又能以其作为主要培养基基质生长繁殖的菌株尤为重要。除此，不同菌株之间的抑菌作用有较大差异，不同菌株之间的培养条件和菌剂制备工艺也有很大不同，需要有合适的工艺技术将其 制成适用于工业化生产和应用的制剂。

基于以上思路和技术要求，本发明采用不同于传统生物菌剂的吸附载体以及制作工艺，使用印楝渣、茶枯和棕榈仁粕等植物有机物作为生防菌的培养基原料及其菌剂的吸附载体，经过二次发酵腐熟，制备成具有防治植物病虫害的植物有机物-枯草芽孢杆菌混合菌剂(简称植物有机物菌剂)，这在生物农药菌剂研究方面未见相关报道。

中国专利申请号200810062559.1(公开号CN101606520A)公开了一种新型的生物治蝗药剂，以阿维菌素和生物杀虫剂印楝素为主原料，加专门针对蝗虫特性添加特殊植物中间剂茶枯进行复配。中国专利申请号201010572445.9(公开号CN102038001A)公开了一种印楝素与枯草芽孢杆菌混配水分散粒剂， 含有以下重量百分比的物质：0.1％～50％印楝素，0.1％～50％枯草芽孢杆菌，1％～30％润湿剂，5～30％粘结 剂，0.1％～30％崩解剂，10％～60％载体，利用印楝素活性成分与枯草芽孢杆菌间的增效作用关系，达到克服害虫的抗药性，提高药剂施用效果，并且能够防治多种农林病害，扩大药剂的适用范围。而上述两项专利所使用的印楝素不同于印楝渣，印楝渣是经提取印楝素后的副产品，两者本质不同。

中国专利申请号95100402.6(公开号CN1117080A)和中国专利申请号200610122958.3(公开号CN101168730)公开了一种细菌培养基，用于发酵生产苏云金芽孢杆菌，其有效成分主要为碳源物质、氮源物质和矿质元素，由至少一种原料组成的氮源物质中具有茶枯粉，所说茶枯粉在培养基中含量仅为0.5～2.5％(专利200610122958.3为0.4～2.7％)。不同菌株之间的培养条件和菌剂制备工艺有很大不同，上述中国专利申请仅是关于提供一种用于发酵生产苏云金芽孢杆菌的含微量茶枯粉的培养基，主要起调节作用，并没有作为苏云金芽孢杆菌培养基主要成分、菌剂吸附载体和增效成分，这与本发明主题有本质区别。

中国专利申请号200510050575.5(公开号CN1718003A)公开了一种阿维·苏云金杆菌粉剂，由阿维菌素原药、苏云金杆菌以及作为填料的茶枯复配而成，是杀虫、杀螨生物农药。该专利中茶枯作为填料，主要起到表面活性剂作用，不涉及本发明主题。

中国专利申请号200810030925.5(公开号CN101248835A)公开了一种用酶(甘露聚糖酶)降解棕榈粕、棕榈仁粕的方法，制得产品作为动物饲料。中国专利申请号200910049520.0(公开号CN10186910A)公开了一种利用发酵法去除棕榈仁粕中抗营养因子的方法，其特征在于，采用芽孢杆菌和酵母菌发酵来降解棕榈仁粕中的抗营养因子，提高棕榈仁粕作为饲料的营养价值的方法。

本发明人公布了一株枯草芽孢杆菌HN09，将其与植物有机物二次发酵，并以植物有机物作为菌剂制备过程中的吸附载体，开发成了具有强拮抗真菌活性、防治香蕉枯萎病等植物病害以及土壤害虫、促进植物生长和对氮吸收的新型植物有机物菌剂。经检索，所有已申请的专利申请和文献报道均不涉及本发明主题。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中的上述不足，提供了一种的新型植物有机物-枯草芽孢杆菌混合菌剂的制备方法。

本发明的另一目的是提供上述枯草芽孢杆菌菌株HN09及其菌剂的应用，其可以产生具有抑菌活性的挥发性气体，对香蕉枯萎病等植物病害以及跳甲等土壤害虫具有防治作用，对香蕉等植物具有促进生长作用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明所述枯草芽孢杆菌HN09与植物有机物制成的植物有机物菌剂，该菌剂以印楝渣、茶枯和棕榈仁粕中一种或多种作为生防菌HN09的培养基主要原料及其菌剂的吸附载体，经过二次发酵腐熟，制备成的植物有机物-枯草芽孢杆菌混合菌剂(本发明中简称为植物有机物菌剂)。

本发明中所述植物有机物是指印楝渣、茶枯和棕榈仁粕中一种或多种，多种组合时比例为重量任意比，作为枯草芽孢杆菌菌株HN09的基质培养基，也充当菌剂的吸附剂，均属于本发明的保护范围。

上述菌剂活性成分包括枯草芽孢杆菌HN09和它产生的挥发性气体、发酵培养代谢产物，以及植物有机物，活性成分间对病虫害防治具有协同增效作用，扩大了病虫害防治范围。

上述植物有机物菌剂的具体制备方法步骤如下：

(1)一级种子液制备

种子液培养基为营养肉汤液体培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，其余为蒸馏水，pH6.5～7.3。培养基121℃灭菌20min，接入活化的芽孢杆菌HN09，摇瓶培养。培养条件：转速180rpm，30℃，培养时间24h。

(2)二级种子液制备

二级种子培养基配方为玉米粉1～3％，黄豆粉0.5～2％，酵母粉0.1～0.3％，K₂HPO₄0.05～0.15％， MgSO₄0.01～0.03％，CaCO₃0.1～0.2％，其余为水，pH6.5～7.3。培养基经121℃灭菌20min，待温度降至30℃左右，将一级种子液按5～15％体积比接入种子罐培养。通气量1∶1，搅拌速度100～250转/分，培养温度28～32℃，灌压保持在0.02～0.03MPa。培养期间进行质量和菌量检测。

(3)发酵罐培养

发酵罐培养基配方同二级种子液培养基配方。培养基温度降至30℃左右，将二级种子液按5～15％体积比接入发酵罐扩大培养，同时在培养基中加入0.005～0.015g/LMnSO4诱导产孢。培养条件、质量和菌量检测同步骤二级种子液制备。

(4)二次发酵与菌剂制作

将步骤(3)所得发酵液加入粉碎过200目的植物有机物中，进行二次发酵腐熟，温度为20～37℃，发酵时间为1～60天。

按每1L发酵液加入2～5Kg植物有机物的比例混合，加入1～2％羧甲基纤维素辅助剂，搅拌均匀，制成的植物有机物-生防菌混合菌剂。上述植物有机物是印楝渣、茶枯和棕榈仁粕中一种或多种，多种组合时比例为重量任意比。菌剂为可湿性粉剂。

(5)菌剂的包装和贮存

称取菌剂分装与铝质袋中，密封，存放于通风干燥处。

本发明所提供的植物有机物-枯草芽孢杆菌混合菌剂具体可用于防治香蕉枯萎病、番茄枯萎病等植物病害，尤其对香蕉枯萎病更有效；同时也可用于防治跳甲等土壤害虫，也可在促进植物对氮吸收、促 进植物生长中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公布了一种植物有机物菌剂的制备方法，该方法以可再生资源——印楝渣、茶枯和棕榈 仁粕等植物有机物作为枯草芽孢杆菌HN09的培养基，同时将以上述植物有机物作为菌剂的吸附载体，经过二次发酵腐熟制备成菌剂。利用植物有机物成分与枯草芽孢杆菌间的增效作用关系，加快植物有机物腐 熟进程，保证生防菌菌株大量生长繁殖，并且能够防治多种植物病害，扩大病虫害防治范围。此外，具有节约资源、变废为宝和促进农业副产品的循环利用等优点，并且制备工艺简单，效果好，成本低，这也是本发明的特点之一。

经过实验证实，本发明的枯草芽孢杆菌菌株HN09及其植物有机物菌剂对香蕉枯萎病、番茄枯萎病均具有良好的防治效果，尤其对香蕉枯萎病表现出很好的防治效果，对香蕉枯萎病的田间防效达到94.7％，同时该菌剂对土壤害虫跳甲和金龟子具有良好防治效果。由此可见，该生防菌HN09菌株在防治香蕉枯萎病和土壤害虫方面具有巨大的应用前景，其混合菌剂可以进行规模化推广应用，具有广阔的市场前景，将带来巨大的经济效益和生态效益。

本发明所采用的枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HN09，筛选自广东省广州市华南农业大学杀虫植物标本园的土壤，经实验证明，该菌株与植物有机物有很好的兼容性，可产生的挥发性气体能有效抑制香蕉枯萎病菌和番茄枯萎病菌的生长，这在以往的文献中未见报道，这为维管束病害提 供了一种新的防治措施。该菌株已于2013年4月26日保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC7524，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

该菌株为革兰氏阳性菌，菌体为杆状，产芽孢，有运动性。在营养琼脂(NA)培养基上呈微黄不透明，表面干燥，有皱褶突起，边缘不整齐。可产生挥发性气体，气体具有抑菌活性。

经过序列测定，该枯草芽孢杆菌HN09的16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

菌种名称：枯草芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus subtilis

菌株编号：HN09

保藏机构：中国科学院微生物研究所菌种保藏中心

保藏机构简称：CGMCC

保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏中心登记入册编号：CGMCC7524

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌HN09对香蕉枯萎病菌4号小种的拮抗作用。

图2为枯草芽孢杆菌HN09挥发性气体对香蕉枯萎病菌4号小种的抑制作用。

图3为植物有机物菌剂对香蕉造成伤害的盆栽试验效果。左到右处理分别为对照、植物有机物菌剂和未经腐熟的植物有机物。

图4为植物有机物菌剂防治香蕉枯萎病菌和促生长的田间试验效果。左为对照，右为处理。

具体实施方式

实施例1枯草芽孢杆菌HN09的富集筛选和鉴定

1、枯草芽孢杆菌HN09的富集筛选

以广东省广州市华南农业大学杀虫植物标本园中采集的土壤为土样。称取10g土壤放入装有灭菌植物有机物培养基(印楝渣30g，茶枯30g，棕榈仁粕30g，蛋白胨5g，酵母粉3g，pH自然)的三角瓶中富集培养一星期。然后，称取10g富集培养物放入装有90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡后静置10min。取1mL上清液按10倍梯度浓度稀释至10^-4、10^-5、10^-6浓度，分别取0.1mL稀释液，涂布于LB培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水1L，pH自然，121℃灭菌30min)平板上，28℃倒置培养2～3d，根据菌落形态、颜色等特征挑取不同的单菌落进一步利用平板划线法纯化。

采用平板对峙培养法，以香蕉枯萎病菌4号小种(以FOC4表示)和番茄枯萎病菌(以FROL表示)等病原菌为指示菌，在PDA平板中央接入直径为5mm的病原菌菌饼后，在距菌饼2.5cm处接种纯化后的菌株，28℃继续培养，连续观察记录各菌株抑菌带，根据抑制率筛选出抑菌活性最强的菌株。最终获得一株对香蕉枯萎病和番茄枯萎病均具有很强抑制作用的菌株HN09，抑菌带分别达到1.3cm和1.1cm；该菌株HN09在平板拮抗培养可以完全抑菌香蕉枯萎病菌FOC4生长(如图1)，经后续鉴定为枯草芽孢杆 菌(Bacillus subtilis)，并命名为枯草芽孢杆菌HN09。

2、枯草芽孢杆菌HN09的鉴定

(1)形态学鉴定：该菌株HN09属于革兰氏阳性菌，菌体为杆状，产芽孢，有运动性。在营养琼脂培养基上形成的菌落为圆形，呈微黄色不透明，表面干燥，有皱褶突起，边缘不整齐。

(2)分子生物学鉴定：以菌株HN09的基因组DNA为模板，采用通用引物扩增16SrDNA， 经测序得到该菌株的16SrDNA全序列含有如序列SEQ ID NO：1所示核苷酸碱基，长度为1464bp。将该序列在GenBank数据库进行Blast比对，扩增的序列与枯草芽孢杆菌的16SrDNA序列的同源性达99％以上。

通过形态学观察和分子生物学鉴定，确定该菌株HN09属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌HN09。

实施例2枯草芽孢杆菌HN09产生具有抑菌活性挥发性气体实验

将活化的枯草芽孢杆菌HN09接种于营养肉汤培养基，30℃，180rpm/min摇床培养24h。取200μ1菌株HN09菌液均匀涂布于预先准备好的产气培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏3g，葡萄糖15g，K₂HPO₄2g，FeSO₄0.2g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH6.8～7.2)平板上；在另一平板PDA培养基中央接入直径5mm的FOC4菌饼，然后倒扣在含菌株HN09的产气培养基平板上(处理组)，以不含菌液的平板为对照，用密封膜将上下平板间缝隙密封，置于28℃黑暗培养。设置3个重复。待对照FOC4菌丝生长至距平板边缘1cm后，测量菌丝生长距离，计算平均抑菌率。结果表明，菌株HN09可产生抑制香蕉枯萎病菌的挥发性气体，如图2所示。

实施例3枯草芽孢杆菌HN09的植物有机物菌剂的制备

(1)一级种子液制备

种子液培养基为营养肉汤液体培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，其余为蒸馏水，pH6.5～7.3。培养基121℃灭菌20min，接入活化的芽孢杆菌HN09，摇瓶培养。培养条件：转速180rpm，30℃，培养时间24h。

(2)二级种子液制备

二级种子培养基配方为玉米粉1～3％，黄豆粉0.5～2％，酵母粉0.1～0.3％，K₂HPO₄0.05～0.15％，MgSO₄0.01～0.03％，CaCO₃0.1～0.2％，其余为水，pH6.5～7.3。培养基经121℃灭菌20min，待温度降至30℃左右，将一级种子液按5～15％体积比接入种子罐培养。通气量1∶1，搅拌速度100～250转/分，培养温度28～32℃，灌压保持在0.02～0.03MPa。培养期间进行质量和菌量检测。

(3)发酵罐培养

发酵罐培养基配方同二级种子液培养基配方。培养基温度降至30℃左右，将二级种子液按5～15％体积比接入发酵罐扩大培养，同时在培养基中加入0.005～0.015g/LMnSO4诱导产孢。培养条件、质量和菌量检测同步骤二级种子液制备。

(4)二次发酵与菌剂制作

将步骤(3)所得发酵液加入粉碎过200目的植物有机物中，进行二次发酵腐熟，温度为20～37℃，发酵时间为1～60天。

按每1L发酵液加入2～5Kg植物有机物的比例混合，加入1～2％羧甲基纤维素辅助剂，搅拌均匀，制成的植物有机物-生防菌混合菌剂。上述植物有机物是印楝渣、茶枯和棕榈仁粕中一种或多种，多种组合时比例为重量任意比。菌剂为可湿性粉剂。

(5)菌剂的包装和贮存

称取菌剂分装与铝质袋中，密封，存放于通风干燥处。

实施例4枯草芽孢杆菌HN09以植物有机物为培养基的生长特性及兼容性

将实施例3步骤(3)所得发酵液按10％接种量分别转接于装有2Kg印楝渣、茶枯、棕榈仁粕培养基以及三者间组合(组合1为印楝渣∶茶枯∶棕榈仁粕＝1∶1∶1；组合2为印楝渣∶茶枯＝2∶1；组合3为印楝渣∶棕榈仁粕＝1∶2；组合4为茶枯∶棕榈仁粕＝1∶1)培养基的容器中，室温条件下进行二次发酵。分别于第7d用平板菌落计数法测定不同植物有机物培养基的活菌数。

兼容性测定：称取印楝渣、茶枯和棕榈仁粕各10g，分别加入甲醇和无菌水10mL，混匀，黑暗中浸提2天，离心取上清液，经0.22μm无菌过滤器过滤除菌后，用牛津杯法测定提取液对生防菌枯草芽孢杆菌菌剂HN09是否有抑菌活性，结果表明印楝渣、茶枯和棕榈仁粕的甲醇和水提取液对枯草芽孢杆菌 菌剂HN09没有抑菌活性，说明该菌株HN09与植物有机物有很好的兼容性。

表1菌株HN09在不同植物有机物培养基的活菌数

由表1结果可见，菌株HN09能在印楝渣、茶枯、棕榈仁粕植物有机物中一种或多种为基质培养基中生长繁殖，以印楝渣和组合1(印楝渣∶茶枯∶棕榈仁粕＝1∶1∶1)为培养基生长最好，培养7d后每克培养物活菌数分别达到2.29×10¹⁰和2.02×10¹⁰个，茶枯和棕榈仁粕培养物活菌数分别为1.87×10¹⁰和1.73×10¹⁰个，其他组合分别为1.95×10¹⁰、1.81×10¹⁰和1.78×10¹⁰个。

实施例5菌株HN09以不同载体为吸附剂的菌剂特性

将1L实施例3步骤(3)所得发酵液和2Kg植物有机物(印楝渣、茶枯、棕榈仁粕以及它们间组合，比例与实施例4相同)吸附载体混合均匀，制备成可湿性粉剂，室温保存。分别于第7、15、30、45、60d称取10g菌剂，加入至装有90mL无菌水的三角瓶中(带无菌玻璃珠)，充分振荡，静置10min。用平板菌落计数法测定不同植物有机物吸附剂在不同时间的活菌数。

表2以不同植物有机物为吸附剂的菌剂的活菌数

表2结果表明，以印楝渣、茶枯和棕榈仁粕，以及它们间多种组合等不同植物有机物作为枯草芽孢杆菌菌剂的吸附载体，枯草芽孢杆菌HN09的活菌数均比较理想，其中以印楝渣最、茶枯、组合1(印楝渣∶茶枯∶棕榈仁粕＝1∶1∶1)和组合2(印楝渣∶茶枯＝2∶1)最为理想。以印楝渣作和组合1为菌剂 吸附载体的活菌数在第30d时为2.25×10¹⁰和2.17×10¹⁰个，在第60d时为2.06×10¹⁰和1.99×10¹⁰个； 在第60d时，茶枯、棕榈仁粕、组合3和组合4作为吸附载体的活菌数分别为1.85×10¹⁰、1.59×10¹⁰、1.64×10¹⁰和1.58×10¹⁰个。

实施例6植物有机物菌剂的贮存特性

将实施例3和4制备的植物有机物菌剂包装封口后，置于室温贮存，分别于30、60、90d取出菌剂，用平板菌落计数法测定植物有机物菌剂在不同贮存时间的活菌数。

表3结果显示，以印楝渣、茶枯和棕榈仁粕，以及它们多种组合等不同植物有机物为吸附载体的植物有机物菌剂的贮存稳定性良好，枯草芽孢杆菌HN09的活菌数均比较理想，均大于140亿个/g。其中以印楝渣、茶枯、组合1(印楝渣∶茶枯∶棕榈仁粕＝1∶1∶1)以及组合2(印楝渣∶茶枯＝2∶1)最好，活菌数在第90d时，分别为1.99×10¹⁰、1.84×10¹⁰、1.82×10¹⁰和1.85×10¹⁰个。

表3以不同植物有机物为吸附剂的菌剂的活菌数

实施例7植物有机物菌剂对香蕉枯萎病的盆栽防效试验

测定实施例4制备得到的菌剂防效，试验均设置3个处理：处理1：不作任何处理作为阳性对照，不加FOC4；处理2：经过灭菌处理的植物有机物菌剂作为阴性对照，加FOC4；处理3：植物有机物菌剂，加FOC4；处理4：菌株HN09菌液，加FOC4。

将FOC4病原菌接种到PDA液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～4天后，将培养液用四层无菌纱布过滤，得FOC4孢子悬浮液，用无菌水稀释浓度至107cfu/mL。

每盆装移栽土壤3Kg(经灭菌处理)，将菌剂与土壤混匀，每个处理30盆。将长出5至6片真叶的经过炼苗的香蕉组培苗移栽至苗盆中，每盆种1株香蕉幼苗。然后将制备好的FOC4孢子悬浮液浇灌在种有香蕉幼苗的土壤中，每盆浇灌量均为15mL。常规肥水管理，观察记录发病情况，45天后调查病情等级，计算病情指数和防治效果。

病情分级：0级为无发病症状；1级为1～25％叶片变黄；2级为26～50％叶片萎蔫；3级为51～75％叶片萎蔫；4级为全株叶片萎蔫或植株死亡。

病情指数＝∑(病情等级×发病植株数)/(调查总株数×4)

防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100

表4结果显示，印楝渣、茶枯、棕榈仁粕以及它们多种组合的植物有机物菌剂对香蕉枯萎病防治效果显著，其中印楝渣、组合1(印楝渣∶茶枯∶棕榈仁粕＝1∶1∶1)和组合2(印楝渣∶茶枯＝2∶1)菌剂的防效最好，分别高达96.8％、95.0％和97.6％；茶枯菌剂的防效达到了90.0％；棕榈仁粕菌剂的防效达到了88.2％；组合3和组合4的防效也达到了87.0％和87.5％。

表4植物有机物菌剂对香蕉枯萎病盆栽防治效果

实施例8植物有机物与枯草芽孢杆菌HN09混合菌剂对香蕉枯萎病防治的增效作用试验

分别测定印楝渣、茶枯、棕榈仁粕与枯草芽孢杆菌HN09混合菌剂对香蕉枯萎病防治的增效作用。采用实施例7室内盆栽试验方法，每处理30盆，每盆灭菌土壤3Kg。

各单体印楝渣、茶枯、棕榈仁粕和枯草芽孢杆菌HN09菌液的室内毒力测定：印楝渣和茶枯试验浓度为5、10、20、40、80g/Kg土壤；棕榈仁粕试验浓度为7、14、28、56、112g/Kg土壤；枯草芽孢杆菌HN09菌液试验浓度(孢子数1×105cfu/mL记为1)为0.1、1、10、100、1000。采用实施例7试验方法对香蕉枯萎病进行毒力测定。根据各处理的病情分级，按2-4级即记为发病，计算各处理抑制率和校正抑制率，求出毒力回归方程、EC₅₀和95％置信限。

混合菌剂的共毒因子测定：参照Mansour(1966)的方法，将各单体药剂抑制香蕉枯萎病25％(EC₂₅)的剂量以1∶1混合后处理，处理方法与单体的毒力测定相同。计算各处理抑制率和校正抑制率，按下式计算共毒因子，作为判断混合菌剂增效作用的标准。

共毒因子＝[(实测抑制率％-理论抑制率％)/理论抑制率％]×100

共毒因子≥+20表示有增效作用，≤-20表示有拮抗作用，-20～+20表示为相加作用

表5各单体药剂对香蕉枯萎病的毒力测定

由表5结果可知，印楝渣、茶枯、棕榈仁粕和枯草芽孢杆菌HN09单体对香蕉枯萎病的毒力回归方程、EC₅₀和EC₂₅。

表6各植物有机物与枯草芽孢杆菌HN09混合菌剂对香蕉枯萎病的共毒因子

表6结果可知，印楝渣+枯草芽孢杆菌HN09、茶枯+枯草芽孢杆菌HN09、棕榈仁粕+枯草芽孢杆菌HN09等3个混合菌剂的共毒因子均大于20，表现出增效作用。

实施例9植物有机物菌剂不对植物造成伤害盆栽试验

为了表明本发明制备的植物有机物菌剂过程中添加的枯草芽孢杆菌HN09通过对植物有机物腐熟，避免植物有机物(未腐熟)对植物造成伤害，本试验设置3个处理：处理1：不作任何处理作为阳性对照；处理2：实施例3和4中制备的植物有机物菌剂；处理3：未经腐熟的植物有机物印楝渣、茶枯和棕榈仁粕。

每盆装移栽土壤3Kg(经灭菌处理)，按上述设置处理与土壤混匀，使用量为5％(150g)，每个处理30盆。将长出5至6片真叶的经过炼苗的香蕉组培苗移栽至苗盆中，每盆种1株。常规肥水管理，观察记录香蕉生长情况。图3结果表明，植物有机物菌剂可以防止未经腐熟的植物有机物对香蕉造成伤害。

实施例10植物有机物菌剂对黄曲条跳甲的盆栽防效试验

每种菌剂防效试验均设置2个处理：处理1：不作任何处理作为对照；处理2：植物有机物菌剂。

每盆装移栽土壤3Kg(经灭菌处理)，将植物有机物菌剂50g与土壤混匀，每个处理3盆。将3叶期芥菜移栽苗盆中，每盆3苗。待芥菜长至4叶期后，将虫体生长一致的黄曲条跳甲成虫接到芥菜叶上，每盆20头。7d后调查各处理黄曲条跳甲成虫密度，根据以下公式计算防治效果：

防治效果(％)＝[(处理虫口减退率-对照虫口减退率)/(1-对照虫口减退率)]×100

结果表明，植物有机物菌剂对黄曲条跳甲有良好的防治效果，其中印楝渣菌剂的防效最好，高达86.3％；茶枯菌剂的防效达到了79.8％；棕榈仁粕菌剂的防效为60.4％。

实施例11植物有机物菌剂对铜绿丽金龟的防治试验

每种菌剂防治试验均设置2个处理：处理1：不作任何处理作为对照；处理2：植物有机物菌剂。

将植物有机物菌剂50g与1Kg加有均匀粗细土豆丝的灭菌细土混匀，保持土壤含水量为20％左右。各接入虫体生长一致的铜绿丽金龟一龄幼虫20头，每个处理3个重复。28℃饲养7d后调查各处理铜绿丽金龟幼虫密度，根据以下公式计算防治效果：

防治效果(％)＝[(处理虫口减退率-对照虫口减退率)/(1-对照虫口减退率)]×100

结果表明，植物有机物菌剂对铜绿丽金龟有良好的防治效果，其中印楝渣菌剂的防效高达87.6％；茶枯菌剂的防效达到了90.5％；棕榈仁粕菌剂的防效为76.7％。

实施例12植物有机物菌剂促进植物生长的盆栽试验

每种菌剂防效试验均设置5个处理：处理1：不加菌剂作为对照；处理2：2.5％植物有机物菌剂；处理3：5％植物有机物菌剂；处理4：10％植物有机物菌剂；处理5：20％植物有机物菌剂。

每盆装移栽土壤3Kg(经灭菌处理)，按土重质量比将菌剂与土壤混匀，每个处理30盆。将经过简单炼苗的大小一致的香蕉组培幼苗移栽至苗盆中，每盆种1株香蕉幼苗。60天后调查香蕉苗生长状况，测量株高。

结果表明(表7)，植物有机物菌剂可以促进香蕉苗的生长，对照组平均株高为21.4cm，印楝渣、茶枯和棕榈仁粕植物有机物菌剂处理组的平均株高分别为25.6，24.8和23.5cm，其中印楝渣植物有机物菌剂促生效果最好。

表7植物有机物菌剂促进香蕉生长盆栽试验效果

实施例13植物有机物菌剂促进植物对氮吸收的实验

收集实施例8试验中的香蕉苗叶片，利用凯氏蒸馏法分别测定香蕉苗全氮的含量，计算对氮吸 收的增加量。表8结果表明，植物有机物菌剂均可促进香蕉对氮的吸收，对氮吸收增加量分别为36.3％、15.5％和16.7％。

表8植物有机物菌剂促进香蕉对氮吸收的试验

实施例14印楝渣植物有机物菌剂防治香蕉枯萎病和促进香蕉生长的田间效果试验

为了表明本发明菌株HN09的植物有机物菌剂，对香蕉枯萎病的防治效果以及对香蕉促进生长效果，在室内盆栽试验的基础上，进行了田间药效试验。2012年初在广州番禺区香蕉地进行印楝渣植物有机物菌剂的田间试验，设置两组处理：处理1：垄1和垄2不施药作为对照；处理2：垄3～5施加印楝渣植物有机物菌剂。选择香蕉苗生长一致的香蕉地，采用香蕉苗基肥施药方式，每亩使用量为60Kg，处理后连续观察至2012年10月，调查发病情况，按照实施例7方法计算田间防效，并测量株高，记录试验结果。

试验结果表明，印楝渣植物有机物菌剂处理组的枯黄叶片数量明显少于空白对照(图4)，能有效降低香蕉枯萎病发病率，田间防效达到94.7％(表9)；同时，印楝渣植物有机物菌剂可以促进香蕉苗的生长，如表10所示，对照统计了119株，处理组统计了179株，对照平均株高为1.42～1.46m，处理组平均株高达到了1.58～1.70m。

表9印楝渣植物有机物菌剂对香蕉枯萎病的田间防效

表10植物有机物菌剂促进香蕉生长田间试验效果

Claims (5)

1.一种植物有机物-枯草芽孢杆菌HN09混合菌剂，其特征在于：由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HN09和植物有机物组成，

所述枯草芽孢杆菌HN09以所述植物有机物为主要培养基进行生长繁殖，同时完成植物有机物腐熟；

所述枯草芽孢杆菌HN09菌株属于枯草芽孢杆菌，分离于华南农业大学杀虫植物标本园的土壤，由中国科学院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC7524，

所述的植物有机物选自印楝渣、茶枯、棕榈仁粕。

2.根据权利要求1所述的植物有机物-枯草芽孢杆菌HN09混合菌剂，其特征在于：植物有机物为印楝渣、茶枯和棕榈仁粕中一种或多种，多种组合时比例为重量任意比，经粉碎过100或200目筛后所得的小颗粒细粉，作为枯草芽孢杆菌HN09的培养基基质，并充当菌剂的吸附载体。

3.根据权利要求1~2任一项所述的植物有机物-枯草芽孢杆菌HN09混合菌剂在植物病害防治中的应用，其特征在于：所述植物病害为：香蕉枯萎病和番茄枯萎病。

4.根据权利要求1~2任一项所述的植物有机物-枯草芽孢杆菌HN09混合菌剂在土壤害虫防治中的应用，其特征在于：所述土壤害虫为：跳甲和金龟子。

5.根据权利要求1~2任一项所述的植物有机物-枯草芽孢杆菌HN09混合菌剂在促进植物生长和对氮吸收中的应用。