CN104272111B - 检测结核的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种用于检测个体是否有结核感染的方法,包括获得来自个体的样品,将样品与对结核分枝杆菌(Mtb)具有特异性的抗体接触,并研究样品与Mtb抗体之间的相互作用,其中样品与Mtb抗体之间存在相互作用表示个体有结核感染。该方法可进一步包括检测个体是否接种过抗结核感染疫苗,通过将来自个体的样品与对BCG疫苗有特异性的抗体接触,并研究样品与BCG抗体的相互作用,其中样品与BCG抗体之间存在相互作用表示个体已经接种过抗结核感染疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及检测个体内结核感染的方法和检测个体是否已接种了抗结核疫苗的方法。
发明背景
结核(TB)是一种由结核分枝杆菌(Mtb)引起的传染疾病1,2。目前,它是全世界死于传染疾病的其中一个主要原因,因此形成了一个重要公共卫生难题2。尽管TB病例的数量自2006年起在下降,但是800万至1000万感染者中每年估计报告300万死亡病例1,3。大约20亿人潜伏感染Mtb,并且根据WHO,它在全世界每年引起980万新的病例以及大约180万死亡数1,3。这个问题随着耐多药(MDR)和广泛耐药(XDR)菌株的出现而更加复杂2,4。全世界用于诊断TB的最常用方法是痰涂片镜检5,但是在一些发达国家可以通过培养法或快速分子试验诊断6。考虑到TB的全球流行速度正在增加以及现有疫苗-牛结核杆菌卡介苗-的有限保护,非常需要能够阻止这个公共卫生问题的候选疫苗7,8。因此,许多研究者正努力开发新的抗Mtb的改进疫苗4,7。
结核分枝杆菌(Mtb)是由Robert Koch在1881年通过培养碎肉芽肿鉴定的。Mtb是一种耐酸、革兰氏阳性并且生长缓慢的芽孢杆菌,直径和长度分别为0.5μm和1-4μm,使它小于许多细菌9。它的蜡质细胞壁由长链脂肪酸组成,其中大多数是分枝菌酸和糖脂例如脂***甘露糖(LAM)、酚醛树脂和磷酸糖脂(phosphoglycoloipid)和硫脂。其他细胞壁组份包括肽聚糖和***半乳糖10。细胞壁的特性增强结核分枝杆菌在巨噬细胞内的复制和存留,并且也对在吞噬体内预适应有作用9,11。Mtb调节抗原递呈和巨噬细胞的杀菌活性的能力使得它成为最成功的人类病原体11。
Mtb是一种需氧病原体,生长于宿主的细胞内区域,因此在氧气供应完全充足的肺组织生长地更好3。它通常感染肺部(肺TB),但有时也感染其他位置(肺外TB)。该疾病仅仅当肺TB患者通过喷嚏、咳嗽或讲话排出杆菌时在空气中传播6。从空气中吸入它们后,传染性结核杆菌通过呼吸道机动进入机体组织。被血液或淋巴液携带至肺尖和***后,它们接着在这些位置定居3。TB感染的特性和后果主要由宿主和病原体在感染发病时的相互作用决定7。在感染的2-6周内淋巴细胞和噬菌体被募集到感染位置,导致肉芽肿的产生,TB感染的标志。所述杆菌存在于肉芽肿内,在那里它们能够在以后被重新激活或当它们的数量上升时被释放至气道3。
结核诊断;可用的方法
症状诊断
增加的死亡数量和TB不断爆发使人们认识提高。如果他们持续咳嗽(超过2周)、发冷、盗汗、厌食、体重减轻、疲劳、胸痛和气喘,他们寻求就诊。肺外TB可能具有像背痛、抽搐、颈部肿块、红眼、排尿困难、脚肿、头晕、不育、关节痛、吞咽困难、排便习惯改变和皮肤溃疡的症状。
培养分析
传统的培养分析方法被用于鉴定病原菌。痰、胃抽出物、来自肺部的液体通过具有清洗步骤的支气管镜检喷射出来,胸膜活检的来自肺部内膜的组织和胸液是用于TB病常见诊断的培养的最常用样品。进行抗酸染色鉴定涂片阳性菌株。通过培养来自可疑者的样品能够获得清晰可辨的Mtb克隆。培养试验灵敏(80%)并具有98%特异性,计有2%错误判读。
结核菌素试验/PPD
结核菌素试验或曼托试验或纯蛋白衍生物(PPD)或Priquette试验是用于TB的常见诊断手段。
在PPD试验中,衍生于结核分枝杆菌的蛋白质被消毒并从培养浓缩物中纯化,在前臂皮下注射。细菌发生史将导致免疫反应,其可通过注射结核菌素(结核杆菌的甘油提取物)后48-72小时内注射位置的膨胀鉴定。测量注射位置的硬化(包埋的坚硬区域)(5mm,10mm或15mm),如果有免疫反应表示阳性。
HIV阳性的人、器官移植、免疫抑制的患者、有结核分枝杆菌接触史或TB发病史的人和居住在卫生差/不干净区域的人更可能是阳性PPD结果。
假阳性常见于BCG接种人群、TB感染暴露史和具有非常弱的免疫***的人,而假阴性发现于低CD4 T细胞或HIV患者,因为有可能对这些测试有弱免疫应答。
QuantiFERON-TB(QFT)测试
QFT-Gold TB测试是更具有特异性(98-99%)和灵敏度(85-91%)的测试,用于最近的TB临床诊断。
这种测试基于对分枝杆菌分泌肽例如ESAT-6和CFP-10的分泌IFN-γ(伽玛干扰素)的宿主免疫应答。收集可疑者血液并与提取自Mtb的分泌肽混合。测量(450nm处OD)由宿主免疫细胞在对检测Mtb抗原的应答中产生的IFN-γ,诊断TB感染。
胸部X射线
X射线测试用于诊断TB感染的严重性。在该病发病初始阶段期间该测试似乎是正常的。有时X射线结果有可能被错误解释,这缘于许多其他肺部并发症的类似症状,如肺炎、淋巴瘤、魏格纳氏肉芽肿、结节病、间皮瘤、骨关节炎、支气管瘤、脓胸症以及右心衰竭。
Mtb与巨噬细胞的相互作用以及募集免疫细胞至感染位置和T细胞抗原递呈是感染进程的一些最重要决定因素12。相对少部分的感染Mtb的个体继续发展为TB病,其大多数是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染人群6。
BCG疫苗由法国里尔巴斯德研究所的Albert Calmette和Camille Guerin于1921年制备。由牛结核分枝杆菌的减毒活菌株组成13,14。从那以来它是仅有的TB疫苗,关于它的效率、安全性和对TB的整体影响出现了众多争议7。这提出了一个关于需要开发新的具有提高的效率和安全性、在防止TB感染和阻止疾病进程上提供可靠性的TB疫苗的全球性公共卫生问题。
试验已经证实BCG疫苗对患TB风险仅提供50%的保护。在成年人,它提供不完全的和差异的保护,取决于其他感染和地理位置4,14。然而,已经显示它对小于5岁的儿童提供抗肺外形式TB的保护15。BCG在预防肺TB方面几乎没有效率,并且也禁忌用于免疫功能低下的患者和携带HIV的新生儿5,16。几位研究者已经评估了BCG疫苗的生物特性的差异并将它们与检测到的保护程度差异的解释联系起来。这些差异中的一些与个体的环境结核杆菌暴露史和TB发病机制如外源性再次感染有关14。
由于在全球许多区域的大量个体使用BCG疫苗对TB的流行病学没有许多积极影响已经变得很明显了,因此普遍接受应该制造一种新的候选疫苗以消除TB的全球负担5。TB是可治愈的,但是带有这种疾病的活性形式的个体传播它的速度使得它极难根除。据估计,一个带有活动性TB的人在接受诊断和治疗前能传染至少3个健康个体15。已经预计如果没有新的疫苗产生,从2015年至2050年仅在南亚将有1.017亿新的病例和1790万TB相关死亡。该研究证实群体免疫能够预防这些病例中的8590万(84%)和这些死亡中的1450万(81%)1,2,5,6,15。
正在用多功能方式设计新的TB疫苗;在所有年龄组和在HIV人群中不仅安全而且有效并预防所有形式的TB2。这样,接触前疫苗将保护没有TB感染的个体,接触后疫苗终止已感染个体内的疾病。目前,大多数处于临床阶段的候选疫苗属于前者。
疫苗的首要作用是引起抗感染病原体的保护性体液免疫应答17。因此接种涉及刺激免疫***产生抗体,抗体水平和活性是根除感染的决定因素。针对细胞内病原体例如Mtb接种需要诱导强大的细胞免疫应答17,18。因此,B细胞生物学在阐明抗Mtb的保护和接种的免疫机制中至关重要14,18。B细胞和体液免疫应答在抗Mtb保护中的功能因为其细胞内定位而复杂。然而,已知它们与细胞免疫成分相互作用并形成宿主对Mtb的防御。除了在抗原递呈和产生抗体中的作用外,B细胞还调节T细胞的分化和细胞介导免疫的形成17。激活的B细胞也分泌大量细胞因子,尤其是IFNγ和许多白介素(ILs),其对T细胞介导免疫是重要的14,17,18。
当代免疫学的进展已显示天然免疫在疾病治疗中的重要性。为了在疫苗开发中获得重大进展,必须充分了解从感染发病到病程恶化期间获得性细胞免疫应答与细菌之间的相互作用19。免疫力防止Mtb恶化20。Mtb感染的树突细胞(DCs)和巨噬细胞将Mtb-抗原通过主要组织相容性复合体(MHC)I类递呈到T淋巴细胞,通过MHC II类递呈到CD8+细胞毒T细胞和CD4+T辅助(Th)细胞,导致淋巴细胞激活和增殖21。Mtb感染后T细胞通过产生进而激活DCs和巨噬细胞的抗菌功能的细胞因子以及表达它们的细胞毒活性引起免疫应答11。对于细胞因子环境,CD4+T细胞能够引起Th1和Th2应答。Th1细胞通过细胞毒T细胞和巨噬细胞增强细胞介导的免疫力,而Th2细胞促进B细胞产生抗体22。最近已发现CD8 T细胞包含直接攻击分枝杆菌的颗粒溶素。小鼠体内研究显示当CD4或MHC II类分子阴性小鼠感染时不能控制Mtb复制。此外,在Mtb感染前体内单克隆抗体耗竭表达CD4的T细胞致使小鼠易于感染12。为了增加有效抗菌保护需要所有T细胞亚类,因为它们具有不同生物学功能,因此在抗Mtb免疫力中很重要20。
抗体在抵抗Mtb感染中的作用长时间来被忽视,源于它们在处理细胞内病原体中不太有效的观念23。然而,最近已用试验方法证实,在多种抵抗Mtb的方式中TB抗体提供许多保护性作用,并且不同研究者已经使用mAbs显示抗体具有调节分枝杆菌感染的各种不同方面成为宿主优势的能力23。De Valliere和同事17披露了存在特异性抗体时中性粒细胞和巨噬细胞的活性是增强的。他们进一步证实当包被有特异性抗体时,Mtb被DCs有效地处理并递呈至CD4+和CD8+T细胞。抗体在激活T细胞抵抗细胞内病原体的免疫力中的作用也通过使用在抗体缺陷小鼠中生殖衣原体感染得以阐明21。总之,抗体通过附着到细菌细胞并刺激防止细菌生长的免疫进程而起作用。他们也能够通过细胞因子信号和抑制细菌复制、中和毒素、激活补体***以及通过促进抗体依赖性细胞毒性对细胞免疫力产生免疫调节效应17-23。
记忆B细胞通过产生抗原-特异性抗体对特异抗原二次感染应答24。B细胞刺激期间的激活和分化以及随后的抗体产生是免疫学研究的两个主要领域25。抗原特异性抗体由抗体形成细胞(AFC)产生,其在免疫激活的第一周内形成。AFC在初次应答期间分泌IgM,在随后的应答期间产生IgG。由AFCs产生的抗体比那些由记忆细胞在抗原二次暴露期间产生的具有低亲和性。然而,由前者产生的抗体存在亲和力成熟。高亲和性记忆B细胞群体的产生通常出现在生发中心(GC)。在免疫的前两周内GC内的抗原特异性B细胞数量存在显著增加,之后开始下降25-27。在一项Oshiba等人进行的关于血清Ig亲和力成熟的研究中,在免疫的第7天和第14天内高亲和力IgG1有极大增加,并开始下降直到第21天之后观察不到亲和力26。
Biacore SPR使得不用标记物测量抗原与固定化抗体的结合成为可能28,29。它可以直接并快速测定结合过程的结合和解离速率29。它已应用于大量相互作用配对分子的研究中,例如受体、酶、药物、生长因子、抗原、抗体以及更多28。GE Healthcare的Biacore***采用表面等离子共振现象实时定量分子间的相互作用30-33。相互作用分子中的一个(抗体)被牢固固定于传感器芯片的表面,其包被有粘附至羧甲基葡聚糖的表面基质的金膜,另一相互作用配对物(抗体)通过其上32。当抗体和其特异性抗原之间有相互作用时,由于质量的变化产生一个光信号,从而折射率变化。所述相互作用可以以响应单元(RU)测量。Biacore已被用于许多检测病原体的研究中。其中一些研究包括使用固定化抗体与沙门氏菌A、B、D和E群反应检测沙门氏菌28,检测肠炎沙门氏菌和大肠杆菌34,使用沙门氏菌检测血清抗体35。
模拟宿主多肽一种生存机制
微生物病原体用于操控细胞功能的策略的一种重要机制是功能化模拟宿主活性。在一些情况中,通过毒力因子达到模拟,那些毒力因子是宿主蛋白的直接同源物。在其他情况中,趋同进化已经产生了新的效应物,尽管没有明显的类似于宿主因子的氨基酸序列,通过结构研究显示其展现分子水平模拟(Stebbins&Galan,2001,Nature)。
免疫***有效区分自我与非我,然而自身免疫疾病的出现表明这种区分可能是不准确的。类似暴露于病原菌、病毒、异常表达的自身蛋白质和暴露于隐藏抗原的免疫侵害可能引发免疫反应,导致自身免疫疾病。存在于病原微生物的抗原性表位与宿主蛋白质类似,能够激活免疫***的细胞的导致自身免疫,称为分子模拟(Chodisetti et al 2012,BMCImmunology)。分子模拟已在T细胞特异性自体免疫疾病例如多发性硬化、心肌炎和糖尿病中得到证实。Tb与许多不同自身免疫疾病相关,如SLE和风湿性关节炎,表明T细胞可潜在识别自身抗原。与分枝杆菌和自体抗体交叉反应的T细胞被激活导致自身免疫应答。
α-2巨球蛋白(A2M)是广谱抑制因子,在保护宿主细胞不受寄生或细菌攻击中起重要作用。基于诱饵区断裂的A2M重排将攻击蛋白酶捕获于一个笼样结构中,这样使由感染微生物分泌的蛋白酶失效。因此A2M是天然免疫***的重要元素(Neves et al 2011)。A2M是与补体***的成分例如因子C3相同的蛋白超家族的成员。A2M超家族的分子一经激活必然进行构象改变,这些事件对于它们的生物活性至关重要。许多细菌基因组的序列分析在几种细菌中发现了A2M样基因,这些细菌大多数是病原体种类和/或定植于高等真核细胞。该发现加强了一种观点,即细菌很像它们的真核对手,能够运用A2M样分子抑制靶蛋白酶,从而促进感染和定植进程。
发明概述
现有诊断结核的方法有诸多问题。例如,培养来自患者的样品需要4-8周,并且如果不是取自感染区域则不会产生结核分枝杆菌的生长。其他用于检测结核的可用的方法基于PCR,或集中在T细胞介导的反应上,例如PPD和Quantiferon,不能将需要治疗的结核感染患者从具有高度敏感性的疫苗免疫的个体中区分出来。据我们所知,没有用于追踪结核治疗的有效性或用于评估已进行的疫苗免疫的效力的已知方法。
本发明描述一种制备抗不同结核分枝杆菌种类的特异性抗体的方法。本发明进一步披露一种用于检测个体是否有结核感染的方法,包括:
-获得来自个体的样品,
-将样品与对结核分枝杆菌(Mtb)具有特异性的抗体接触,和
-研究样品与对Mtb具有特异性的抗体(即Mtb抗体)之间的相互作用,
其中样品与Mtb抗体之间存在相互作用表示个体有结核感染。
在一个实施方式中,所述方法进一步包括检测所述个体是否接种了抗结核感染疫苗,通过:
-将来自个体的样品与对卡介苗(Bacille-Calmette-Guerin,BCG)疫苗具有特异性的抗体接触,和
-研究样品与对BCG疫苗具有特异性的抗体(即BCG抗体)之间的相互作用,
其中样品与BCG抗体之间存在相互作用表示个体接种了抗结核感染疫苗。
本发明还涉及一种检测抗结核感染疫苗接种在个体中的效力或功效的方法,包括:
-获得来自个体的样品,
-将所述样品与对BCG疫苗具有特异性的抗体接触,和
-研究样品与BCG抗体之间的相互作用,
其中样品与BCG抗体之间存在相互作用表示疫苗在个体内的效力或功效。
在一个实施方式中,所述方法进一步包括:
-将样品与具有结核分枝杆菌(Mtb)特异性的抗体接触,和
-研究样品与Mtb抗体之间的相互作用,
其中样品与Mtb抗体之间不存在相互作用表示疫苗在个体内的效力或功效。
在本发明的一个实施方式中,上述方法分别涉及检测潜伏性结核感染或检测抗潜伏结核感染疫苗接种的效力或功效。
根据本发明的一个优选实施方式,所述获得自个体的样品是血清或血浆样品。
在一个实施方式中,Mtb抗体和/或BCG抗体固定于固体表面,并采用表面等离子体共振(SPR)研究样品和抗体之间的相互作用。但是,样品与抗体之间的相互作用可通过任何可实施技术进行分析,例如ELISA、侧流技术等。
这是首次报道抗体介导的测试测定结核感染的发生。我们的研究进一步显示感染或接种疫苗很久后分别在血液中存在抗原性颗粒,其颗粒特异性结合本文制备的抗体。
附图说明
图1 A-C:图示制备的抗Mtb和BCG抗体与阴性和阳性对照结合的特异性。
图2:图示TB患者(n=5)对不同通道的应答。P*=患者。BCG1=BCG通道1(蓝色),BCG2=BCG通道2(红色)和Mtb=Mtb通道(绿色)。
图3A-D:图示阳性和阴性培养物数量以及biacore结果。
图4:柱状图显示固定有特异性抗体的流动室的结合信号。
图5:通过SDS-PAGE鉴定TB患者和健康个体的白蛋白/IgG耗竭的血清样品中的蛋白质抗原。(a)泳道1-5是加入了Mtb抗体并孵育了1小时的TB患者样品,泳道6-9是没有抗体的TB样品,M代表分子标准参照。(b)泳道1-3是没有抗体的TB样品,泳道4-9是加入了Mtb抗体并孵育了1小时的TB样品,M代表分子标准参照。(c)泳道1-4是两例TB患者的样品,5-9是健康个体的样品,M是分子标准参照。所有样品以每泳道20μl加入孔中,将凝胶设置于200V电泳大约1-2小时。
发明详述
我们体外研制了抗分枝杆菌种类(PPD,BCG和MTB)的特异性抗体。所述抗体固定于生物传感器表面等离子体共振(SPR)***,能够以高灵敏度和特异性识别TB患者血清/血浆中的颗粒。
该发现可以作为基础用于研制诊断测试以
-诊断患者内TB感染
-区分不同的结核分枝杆菌感染(结核分枝杆菌,牛结核分枝杆菌,非结核分枝杆菌感染,等)
-监测TB患者的治疗以及用作BCG疫苗的效力测试。
-鉴定患者或接种过疫苗个体血液中发现的颗粒,可能用作抗结核的安全疫苗生产的未来候选物。
材料和方法
样品收集
本研究中共采用了36例个体;23例男性和13例女性,年龄在18-85岁之间。肺炎样品(n=11)取自1997年至1999年在林雪平大学医院传染病科诊断为肺炎并治疗的患者。健康对照样品(n=20)和TB样品(n=5)也获得自在同一医院诊断为TB的患者。抗体制备自一例在2011年5月患MDR TB并在那时接受治疗的患者的血液。当他于2011年9月重访医院时取了他的血液样品用于此研究。每一实例都得到林雪平大学医院当地伦理学委员会提供的伦理学许可。
抗细菌抗体的制备
收集来自TB患者的血液至EDTA管中,使用EDTA作为抗凝剂。收集之后,在15ml离心管中将5ml血液用等体积生理(0.9%)NaCl稀释,并小心层置于50ml离心管中(小心不要混层)的10ml淋巴细胞分离液上(Fresenius Kabi Norge AS,Norway)。得到的梯度在800g、20℃离心20分钟。获得3条带。在不混层的情况下用巴斯德吸管小心吸出含有单核淋巴细胞的中间条带。淋巴细胞培养于含10%FBS的Leibovitz L-15培养基中。孵育24小时后(37℃),加入5μl加热灭活(在80℃水浴保持20分钟)的BCG疫苗(Statens Serum Institute,Denmark)或Mtb至培养基中。每天使用光学显微镜观察培养基中淋巴细胞的形态变化,贯穿孵育过程,并用连接至显微镜和PC的1.3M像素数字相机(Microstone Infotech INC.)获取细胞的图片。在Minisee软件(ScopeTech,China)帮助下收集PC上的图片。孵育2周后,培养基于400g离心10分钟,沉淀细胞,接着用0.45μm醋酸纤维素无菌滤器(Whatman,Schleicher&Schuell,Germany)过滤。滤出液于100kDa Amicon超级离心过滤装置中400g再次离心70分钟。抗体具有大分子量,被留在滤器上,而其他物质作为滤出液流出。从滤器收集抗体并加入5μl生理(0.9%)NaCl保存在-20℃。
SDS-PAGE
用MINI-PROTEAN预制胶(BIO-RAD,Sweden)进行SDS-PAGE测定抗体的分子量。用PBS(pH 7.4,Apoteket AB)稀释抗体样品并加入等体积上样染料。按1:1的比例用Laemmli样品缓冲液稀释样品并在98℃水浴加热5分钟使蛋白在加样至孔内前变性。200kDaPrecision Plus蛋白质标准品(BIO-RAD,Sweden)用作参照。每孔加样20μl样品和标准品,凝胶设置于200V电泳大约1小时。
液相层析-串联质谱(LC-MS/MS)
-胶内消化蛋白质
切割目的蛋白条带并放置于1.5ml带盖离心管中。加入150μl溶剂A(25mM NH4HCO3水溶液混合等体积丙酮,pH 8.0)至管内每一凝胶片段,并间或涡旋10分钟。弃去溶液,重复该步骤3次,直到凝胶颜色消失。在真空离心机(Savant Instrument Inc.Speed VacSC100)内干燥凝胶片段30分钟。加入60μl 25mM NH4HCO3中的10mM DTT以分解蛋白质,接着在56℃孵育1小时。冷却凝胶片段至室温,并用70μl 25mM NH4HCO3中的55mM碘乙酰胺替代DTT溶液,室温黑暗孵育45分钟。用100μl 25mM NH4HCO3清洗凝胶片段10分钟,用100μl溶剂A脱水两次,接着在真空离心机内完全干燥。用60μl 25mM NH4HCO3中的0.005mg/ml胰蛋白酶(Sequence Grade Modified,Promega)溶液使凝胶颗粒复水,并在37℃孵育24小时。加入50μl水,20分钟后转移所得溶液(多肽提取物)至新的1.5ml离心管中。用50μl50/50水/乙腈中的5%TFA对凝胶片段再做另外两次提取,每次20分钟。多肽提取物在真空离心机内完全干燥并保存于-20℃直到LC-MS/MS分析。
-LC-MS/MS分析
通过LC-MS/MS分析多肽。使用纳米流HPLC***(EASY-nLC from BrukerDaltonics,Bremen,Germany)完成分离。采用在线电喷雾离子化离子阱,HCT-ultra PTMDiscovery***(Bruker Daltonics,Bremen,Germany),检索数据。在20mm×100μm(颗粒尺寸5μm)C18预装柱接100 mm×75μm C18柱(颗粒尺寸5μm,Nanoseparations,Netherlands)上以300nL/min的流速反相层析分离多肽。
通过使用多肽离子的交互碰撞诱导解离(CID)进行自动化在线串联MS分析。用Bruker Daltonics Data Analysis 3.4(Bruker Daltonics,Bremen,Germany)从原始数据创建峰列表,产生的Mascot Generic Format(MGF)文件用于在公共Mascot服务器(www.matrixscience.com)上的Swiss-Prot(UniProtKB/Swiss-Prot Release 2011_03)中搜寻蛋白质(表IX)。
对于MS数据搜寻参数允许达0.6Da的质量误差,在肽离子CID的情况中,对于MS/MS数据允许达0.6Da的质量误差。肽带电状态是不同的;允许3个错误断裂位点。选择半胱氨酸脲甲基化作为固定化修饰。选择N-末端蛋白质乙酰化和蛋氨酸氧化作为可变修饰。如果MS/MS谱具有高于25的Mascot值,则认为肽的鉴定是可靠的。
抗体固定化
Biacore 1000 SPR生物传感器仪器(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)被用于检测抗原-抗体相互作用。使用氨基偶联方法将制备的抗体固定于CM5传感器芯片的流动室上36。包被有羧甲基葡聚糖层的芯片的传感器表面用等体积N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)混合物激活。基于芯片激活产生的NHS酯与含有伯氨基的配体反应。用乙醇胺失活未反应的NHS酯。芯片的每一通道都固定化有pH4.5醋酸盐稀释的抗体(20μl)34。
表I:CM5传感器芯片固定化过程中用于样品注射的稀释说明
测试抗体特异性
在运行血清和血浆样品之前,测试每一通道上固定的抗体的特异性。体外制备的抗Mtb和BCG疫苗的抗体每次各自固定化于Biacore1000仪器内的一个通道。抗-人IgG和细菌(其抗体固定在那一特定通道)作为阳性对照。阴性对照是抗-豚鼠IgG和其他细菌。
运行样品并检测细菌
200μl的每一TB血清/血浆样品在100kDa Amicon Ultra离心过滤器中400g离心10分钟。用PBS(pH 7.4,Apoteket AB)按1:20的比例稀释沉淀团块,并以5μl/min的流速注射3分钟。传感器芯片的表面用再生缓冲液(等体积1M氢氧化钠和甘氨酸(pH 2.0))以5μl/min的流速清洗1分钟。未结合分子在运行过程中用HEPES缓冲的盐(HBS)缓冲液(10mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,3.4mM EDTA,0.005%Biacore表面活性剂P20)去除。使用SPR信号的角度偏移确定细菌(抗原)与包被在通道上的抗体的相互作用,以反应单元(RU)测量反应。
表II:Biacore单一运行中的稀释说明
结果
B细胞培养
用加热灭活的细菌刺激前和后在L-15/FBS培养基中发现了不同尺寸的B细胞。在有细菌的培养基中还见到细胞聚集,而在没有细菌的培养基中看到细胞为具有清晰细胞核的单个细胞(图片未示)。这些发现对所有培养都是这样。
SDS PAGE
通过进行SDS-PAGE测定了制备的抗体的分子量。对于用PBS(pH 7.4)进行不同稀释的抗体(1:25,1:50,1:75,和1:100),在50kDa(重链)和25kDa(轻链)得到了条带(数据未显示)。
抗体固定化于芯片上
用BCG疫苗(两个通道)和Mtb(一个通道)刺激B细胞制备的抗体固定于CM5传感器芯片。(表III-V)。
表III:固定化BCG1抗体得到的反应。
表IV:固定化BCG2抗体得到的反应。
表V:固定化Mtb抗体得到的反应。
芯片特异性测试
在固定步骤后对每一通道进行了特异性测试。抗豚鼠IgG和其他细菌用作阴性对照,抗-人IgG、Mtb和BCG疫苗作为阳性对照。
运行样品
在Biacore 1000仪器运行来自健康受试者和TB患者的血浆和血清,得到的结果显示于图1A-C,以说明制备的抗Mtb和BCG的抗体结合至阴性和阳性对照的特异性。图1A显示Mtb抗体的特异性测试的结果:对BCG的反应非常微弱,对Mtb和抗-人IgG的反应强烈;对阴性对照(即其他类型的细菌和抗豚鼠IgG)没有反应。图1B和图1C显示BCG抗体特异性测试的结果(两个通道):对BCG和Mtb的反应微弱,对抗-人IgG的反应强烈;对阴性对照没有反应。所有健康样品显示阴性反应。
表VI:血浆和血清TB样品对不同通道的反应。
图2:图示TB患者(n=5)对不同通道的反应。P*=患者。BCG1=BCG通道1(蓝色),BCG2=BCG通道2(红色)和Mtb=Mtb通道(绿色)。
图3A-D:图示阳性和阴性培养物数量和biacore结果。A)所有11例肺炎样品在Mtb通道上反应阴性(红色),在两个BCG通道上,5例反应阳性(蓝色),6例反应阴性(红色)。B)所有20例健康样品对Mtb通道和BCG通道1反应阴性(红色),2例样品在BCG通道2上反应阳性(蓝色),18例反应阴性(红色)。C)所有5例TB样品对Mtb通道反应阳性(蓝色),但是3例(蓝色)和2例(红色)分别在各BCG通道显示阳性和阴性反应。D)11例肺炎患者中的4例培养阳性,所有健康样品培养阴性,所有TB患者培养阳性。
表VII:显示肺炎患者的临床信息、培养和Biacore结果的表。B1=BCG通道1,B2=BCG通道2,Mtb=Mtb通道
表VIII:健康对照的Biacore结果
表IX:鉴定的蛋白质肽的Mascot搜寻结果
特异性抗体加入至血清样品在SDS-PAGE、SPR和质谱中的影响
为了了解血液中哪种颗粒/肽与制备的抗体相互作用,我们对有和没有抗体的血液进行了分析。
SPR:在SPR的Mtb通道上运行加入了Mtb抗体或者BCG抗体并室温孵育1小时的或没有抗体的TB患者(n=2)、健康对照(n=1)和BCG接种的个体(n=1)的白蛋白和IgG耗竭血清样品。除了没有抗体和有BCG抗体的TB样品外,没有记录到任何样品的反应(图3)。相反,当有和没有BCG抗体的BCG血清样品(n=3)、健康(n=1)和TB(n=2)血清样品运行于SPR内BCG通道上时,只有没有抗体的BCG样品在SPR显示阳性反应(图4)。
SDS-PAGE
进行SDS-PAGE以鉴定TB患者血清内抗原性颗粒,其特异地结合至我们固定的IgG抗体。向TB患者的白蛋白/IgG耗竭血清样品加入Mtb抗体并室温孵育1小时,在凝胶上没有产生条带(图5A的1-5泳道,图5B的4-6和图5C的1-4),而那些没有抗体的样品则在38kD、65kD(分别为图5A的泳道6-9和图5B的泳道1-3)以及30kD和250kD之间产生条带(图5C)。来自健康个体的血清样品出现了一些条带(图5C的泳道5-9)。
质谱
选择获得自165kD、65kD、38kD和30kD TB样品的4个条带以及与健康对照条带不匹配的条带用于LC-MS/MS分析,以表征蛋白质。没有选择健康对照的条带(图5C的泳道5-9),因为其在SPR中没有与我们的Mtb抗体结合。在LC-MS/MS读取样品后生成的蛋白质片段的MGF文件用于在Mascot的Swiss-Prot搜寻蛋白质。如果MS/MS谱具有高于25的Mascot值并且预期值小于0.2则认为肽是可靠的(表IX)并被选择。在表IX可见肽的名称和它们的生物信息数据。α2巨球蛋白是与已发现的并与我们的特异性抗体相互作用的肽更精确匹配(95%)的人源肽。
用ELISA(人IgG亚类分析Invitrogen AB)和SPR测定制备的抗体的特性。所述抗体在SPR中对抗人IgG有高亲和力,并且主要由IgG亚类组成。
表X:制备的抗体具有所有亚类的IgG。
在SPR中分析患者和对照的血清样品
在SPR MTB(结核分枝杆菌)流动室和BCG流动室中分析患者(n=13)、接种个体(n=19)和健康血液供体(n=27)的血清样品能够高灵敏度区分BCG免疫与疾病,并且特异性>95%。
表XI:Monoman抗体区分BCG接种个体与健康瑞典血液供体和证实的结核或疑似/治疗的结核患者的灵敏度和特异性>95%。
疫苗接种选择
在我们的研究中鉴定的蛋白质中研究最多的是A2M。之前关于该四聚体糖蛋白在TB背景中的研究提供了进一步研究的大趋势。这种存在于几乎所有脊椎动物的740kD蛋白酶抑制剂已显示是免疫原性的。它是免疫***的进化保守臂。它们结合至它们的受体,APCs上的CD91(LRP/A2MR),并增加它们配对的多肽的吸收、处理和递呈。在用A2M肽复合物免疫的小鼠中,结合至CD91也导致产生多肽特异性CD8+T细胞应答。已知A2M也结合至几种细胞因子和蛋白酶。被APCs内在化后A2M抗原复合物产生强抗体应答和CD4+T细胞应答。BinderRJ(2003)表示纯化的A2M能够与来自用于疫苗生产的致病因子的肽缀合。同一作者也已描述了A2M多肽复合物用于肿瘤预防。在一项Chu等人(1994)进行的体外研究中,当A2M缀合至抗原时,与未缀合对照相比,IgG的产生增加10-500倍。这引导至他们论点,即A2M可以增加抗体产生和巨噬细胞对抗原的摄取。
讨论
在此,介绍了由Mtb和BCG刺激的B细胞产生的特异性抗体在SPR***中的相互作用和结合亲和力。
在培养基中刺激B细胞产生抗Mtb抗体期间,显微镜下观察到细胞的形态学差异。见到细胞尺寸和数量显著增加后而聚集。当被诱导产生抗原特异性抗体时B细胞被激活并分化25。Smith等人26已报道在免疫的前两周内GC内抗原特异性B细胞的数量增加,但是第二周后数量开始下降,直到第21天后它们完全消失。因此在正好孵育两周后提取抗体26。
提取步骤后立即将抗体固定于biacore传感器芯片上。Mtb抗原产生的抗体的结合亲和力远大于BCG疫苗。芯片特异性测试表明研究期间制备的抗体非常特异,因为他们特异地结合于每一通道使用的阳性对照(图1A-C)。这是由于这一事实,即用来自相同患者的Mtb刺激B细胞。通过运行SDS-PAGE证实了产生的抗体的存在。我们在50kDa(重链)和25kDa(轻链)获得了条带。记忆B细胞通过产生抗原特异性IgG在二次感染中对特异抗原应答24,26,这里,如上所述,用之前在患者血液的培养物中发现的Mtb刺激培养基。
Biacore样品测定为应答单元(RU),其当稀释于HBS的不同浓度的样品被注射在固定有它们相应抗体的传感器表面时被记载。并且,将SPR分析的结果与TB和肺炎血清和血浆样品的培养结果比较。没有健康和肺炎样品对Mtb抗原产生的抗体阳性应答,表明他们没有Mtb感染,也被培养结果所证实(表VII和VIII)。相反,一例健康样品(图3B)和大多数肺炎样品(表VII和VIII,图3A)对BCG疫苗产生的抗体阳性应答。这可能是由于这些个体已经接种了抗Mtb疫苗的事实。
在培养结果中(图3D),所有TB样品都是阳性的,所有健康样品都是培养阴性,也被biacore结果所证实(表VIII)。肺炎样品分别有6例培养阳性和4例培养阴性结果,但是没有一例是Mtb阳性。并非所有TB样品对BCG通道上的抗体阳性应答(图2和3C),这可能与特异性有关。
结论
体外制备了特异于Mtb和BCG的抗体。它们能够用于检测个体是否有结核感染和/或个体是否接种了抗结核疫苗的方法中。所述方法可以例如用于检测潜伏性结核感染(LTBI)。
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Claims (6)
1.抗体在制备用于区分具有活动性结核分枝杆菌(Mtb)感染的个体、具有潜伏性Mtb感染的个体、和健康的或接种过抗结核感染疫苗的个体的方法的试剂中的用途,其中所述抗体通过将结核分枝杆菌抗原与分离自先前暴露于结核分枝杆菌的宿主的淋巴细胞接触而产生,其中所述抗体对Mtb蛋白质具有特异性并且与选自表IX所列的蛋白质显示交叉反应性,所述方法包括步骤:
将来自所述个体的血清或血浆样品与所述抗体接触;和
研究所述样品中蛋白质和所述抗体之间的相互作用,
其中与健康对照相比,高水平的蛋白质与所述抗体相互作用表示活动性Mtb感染,低水平的蛋白质与所述抗体相互作用表示潜伏性Mtb感染,没有蛋白质与所述抗体相互作用表示接种过疫苗的或健康的个体。
2.对结核分枝杆菌(Mtb)具有特异性的抗体在制备用于检测个体是否具有结核感染的方法的试剂中的用途,其中所述抗体通过将结核分枝杆菌抗原与分离自先前暴露于结核分枝杆菌的宿主的淋巴细胞接触而产生,其中所述抗体对Mtb蛋白质具有特异性并且与选自表IX所列的蛋白质显示交叉反应性,所述方法包括步骤:
获得来自所述个体的血清或血浆样品,
将所述样品与Mtb抗体接触,和
研究所述样品和Mtb抗体之间的相互作用,
其中所述样品和所述Mtb抗体之间存在相互作用表示所述个体具有结核感染。
3.权利要求2的用途,其中所述试剂进一步包括对卡介苗(BCG)疫苗具有特异性的抗体,用于检测所述个体是否接种了抗结核感染的疫苗,其中所述抗体通过将BCG抗原与分离自先前接种过BCG疫苗的宿主的淋巴细胞接触而产生,所述方法通过:
将来自所述个体的样品与对BCG疫苗具有特异性的抗体接触,和
研究所述样品和BCG抗体之间的相互作用,
其中所述样品与所述BCG抗体之间存在相互作用表示所述个体接种了抗结核感染疫苗。
4.权利要求2-3任一项的用途,其中所述感染为潜伏性结核感染。
5.权利要求2-3任一项的用途,其中所述抗体被固定于固体表面并且通过使用表面等离子体共振(SPR)研究所述样品与所述抗体之间的相互作用。
6.权利要求2-3任一项的用途,其中所述Mtb抗体特异性结合选自表IX给出的蛋白质。
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