CN104263744B - 一种人工改造的葡萄糖氧化酶基因及其表达应用 - Google Patents

Abstract

一种人工改造的葡萄糖氧化酶基因及其表达应用，属于蛋白或酶制剂改造工程以及葡萄糖氧化酶生产领域。所要解决的问题是在现有葡萄糖氧化酶的基础上进一步提高其酶的活性。本发明通过蛋白或酶制剂改造工程中的非理性手段DNA shuffling技术改造来自于黑曲霉Z‑25的葡萄糖氧化酶基因，挑选DNaseI随机切割后的基因片段利用DNA shuffling技术将片段重组成为完整变异基因，与穿梭表达质粒连接之后整合入酵母的基因组中。从突变库中筛选得到酶活显著提高的菌株，其变异序列如SEQ ID NO.2所示。在酵母的3L放大试验当中葡萄糖氧化酶的最终酶活达到了较高的水平。最后在酶活与基因层面，验证得到的高酶活表达菌株有着良好的遗传性。

Description

一种人工改造的葡萄糖氧化酶基因及其表达应用

技术领域

本发明涉及非理性蛋白改造手段，尤其涉及利用DNA shuffling技术对黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因进行改造，本发明还涉及变异之后的葡萄糖氧化酶基因在分泌生产葡萄糖氧化酶中的应用，属于蛋白或酶制剂改造工程以及葡萄糖氧化酶生产领域。

背景技术

葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，E.C.1.1.3.4，简称GOD)能够在有氧气的条件下专一性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，广泛地分布于动物、植物和微生物体内(Pluschkell S,Hellmuth K,Rinas U.Kinetics of glucose oxidase excretion byrecombinant Aspergillus niger.Biotechnol Bioeng 1996；51:215-20.)。

但由于微生物具有生长繁殖速度快，来源广等特点，所以微生物成为葡萄糖氧化酶的主要来源，微生物中的主要生产菌株为黑曲霉和青霉。

葡萄糖氧化酶在食品、医药及生物等领域有着广泛的应用。

在食品工业中，用于去除食品中的葡萄糖，防止褐变；还可用于食品脱氧，改善食品和饮料的品质；同时还用于面粉的改良工艺等方面(Rasiah IA,Sutton KH,Low FL,LinHM,Gerrard JA.Crosslinking of wheat dough proteins by glucose oxidase andtheresulting effects on bread and croissants.Food Chem 2005；89:325–32.；Crueger A,Crueger W.Glucose transforming enzymes.In:Fogarty WM,Kelly CT,editors.Microbial enzymes and biotechnology.New York:Elsevier；1990.p.177–226.)。在医药工业中，用于血糖的测定及尿糖、尿酮体的检测，可制成糖尿试纸或试剂盒用于临床诊断；还可防治口腔疾病和牙病(Wilson R,Turner APF.Glucose oxidase:andideal enzyme.Biosens Bioelectron1992；7:165-85；Etemadzadeh H,Ainamo J,MurtomaaH.Plaque growth-inhibiting effects of an abrasive fluoride–chlorhexidinetoothpaste and a fluoride toothpaste containing oxidative enzymes.J ClinPeriodontol 1985；7:607-16.)。在制酒工业中，葡萄糖氧化酶可以通过去除葡萄糖降低酒精的浓度，从而降低酒的酒精度而生产低度酒(Malherbe DF,du Toit M,Cordero RR,vanRensburg P,Pretorius IS.Expression of the Aspergillus niger glucose oxidasegene in Saccharomyces cerevisiae and its potential applications in wineproduction.Appl Microbiol Biotechnol 2003；5-6:502-11[My paper].；Pickering GJ,Heatherbell DA,BarnesMF.Optimising glucose conversion in the production ofreduced alcohol wine using glucose oxidase.Food Res Int 1998；31(10):685-92.)。

葡萄糖氧化酶也被用在工业生产葡萄糖酸上，通过还原葡萄糖酸内酯而产生葡萄糖酸。葡萄糖酸可以作为调节食品酸值是添加剂，也可制成补充人体所需各种微量元素的葡萄糖酸盐而生产销售(Nakao K,Kiefner A,Furumoto K,Harada T.Production ofgluconic acid with immobilized glucose oxidase in airlift reactors.Chem EngSci 1997；52:4127–33.；Klein J,Rosenberg M,Markos J,Dolgos O,KroslakM,Kristofikova L.Biotransformation of glucose to gluconic acid by Aspergillusniger—study of mass transfer in an airlift bioreactor.Biochem Eng J 2002；3568:1–9.)。

葡萄糖氧化酶也被应用在纺织行业中，因为葡萄糖氧化酶在作用过程中会产生过氧化氢，可以起到漂白作用。这种方式产生的过氧化氢已经经过验证，表现出标准漂白过程同样的效果。更加值得一提的是，在这个漂白过程中不需要额外添加稳定剂，因为过程中产生的葡萄糖酸可以充当稳定剂的角色(Tzanov T,Silgia A,Gubitz GM,Cavaco-PaulμloA.Hydrogen peroxide generation with immobilized glucose oxidase for textilebleaching.J Biotechnol 2002；93:87–94.)。

目前最常见的葡萄糖氧化酶来源是通过黑曲霉、青霉以及酵母菌属的发酵得来。多数商业化的葡萄糖氧化酶是从黑曲霉的菌丝体中分离得到的。有中国的研究者通过有机溶剂沉淀、聚乙二醇二次沉淀、羟基磷灰石柱色谱分离，得到比活性超过190U/ml蛋白的产品(Chinese Journal of Pharmaceutical 1997,28(7))。

但是由于黑曲霉的发酵主要是用作生产葡萄糖酸或者葡萄糖酸盐的，比如葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙，因此葡萄糖氧化酶主要是作为一种副产物出现，而这导致葡萄糖氧化酶的生产酶活并不高，很多都是只有个位数的酶活(S.B.Bankar et al./BiotechnologyAdvances27(2009)489-501)。

随着分子生物学技术的发展，研究者试图通过微生物表达***来表达外源基因，以此来达到对某一种蛋白高效表达的目的。目前已经开发出的外源基因表达***包括大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、曲霉、酵母、昆虫、哺乳类细胞等等。通常情况下，使用原核细胞作为外源基因的表达体系操作简便，各种技术已经趋于成熟，但是受原核***本身的限制，真核来源的蛋白在表达的时候不能正确地折叠或者缺少转录翻译之后的必要修饰，从而导致表达出了蛋白，可是蛋白却没有生物活性，没有进一步的利用价值，而且原核***中的有毒蛋白质或者有抗原作用的蛋白很可能会混杂在终产物中，使结果受到干扰。

但是，原核表达仍然具有重要意义，可以作为真核***表达之前验证一种蛋白可以脱离自身来源***而通过另一种***而表达的手段。

而对于真核哺乳动物细胞作为宿主，可以较为理想地进行蛋白表达后的修饰，但是由于操作困难，而且后期培养细胞会有病毒感染的可能，因此这种方法并没有成为广泛使用的方法。

所以目前主流的蛋白表达体系是酵母体系。

酵母***通过几十年的发展目前已经成为一种模式操作平台，各项操作已经趋于完善。在蛋白表达方面，有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境，尤其是可以对蛋白的一些关键糖基化位点进行修饰，使一些对糖基化有要求的蛋白能够表达出活性。

另外，酵母***还有着其他***不可比拟的优势。

首先酵母***具有分泌表达的能力，也就是说，可以将表达出的蛋白分泌到培养基当中。这在实验过程以及工业生产中都有着极大的优势。基因改造的过程中省去了破碎细胞的程序，可以直接由培养基发酵液中得到目的蛋白进行进一步的研究。在工业生产中，蛋白与菌体的分离技术很成熟，因此如果蛋白产品被分泌至发酵液中，将会节省很大的成本。

其次酵母表达体系采取的是甲醇诱导机制，也就是利用醇氧化酶启动子进行诱导，在摇瓶水平，利用甲醇进行诱导可以有效地降低染菌的几率。

第三，利用酵母操作的载体，可以将外源基因整合入酵母的基因组中，这样可以保证 引入的外源基因稳定地在酵母体系中存在，而不需要像游离载体需要提供外部的生存压力来保证载体在酵母中的存在。这样就一定程度上避免了菌种退化的问题。

第四，酵母发酵的产物的积累并不会酵母自身产生毒害作用，而且酵母的表达菌株很容易从摇瓶扩大到高密度发酵，同时不影响外源基因的表达水平。这两点注定使酵母具有高密度发酵进而高水平表达外源蛋白的潜质(letter in biotechnology,Vol.16No.2Mar.,2005)。

在选定了表达***之后，想要进一步提高外源葡萄糖氧化酶的酶活只有在基因水平对葡萄糖氧化酶基因序列进行改造。

通常提高酶的活性的方法有密码子优化、mRNA结构改造、GC含量调整、随机突变、蛋白定向进化等策略。有些方法已经取得了非常好的效果。比如西南大学的郜赵伟等人在对葡萄糖氧化酶基因的密码子进行了优化之后，3L发酵120h后酶活达到了365U/ml。

但是密码子优化的结果仍然具有局限性。因为这种方法将基因中的所有密码子都依照酵母的密码子偏好性进行了改造，这样虽然可以利用酵母的偏好性提高酶蛋白的表达，但是无形中加重了酵母的负担，很可能并不能达到最好的表达效果。因此考虑通过别的手段来提高酶活。

在自然界上亿年的发展过程中，蛋白质形成了多种多样的形态，在各自的自然环境中发挥着各自的作用。酶作为一种具有生物活性的蛋白，在自然界与人类的生产生活中发挥着巨大的作用。这就促使着人们想要进一步提高对酶的利用。也就是想要对酶进行改造。对于酶的人工改造手段有很多种，最理想的方法是对酶分子中某些关键的氨基酸位点进行调整使其产生理想的宏观性质。但是这种方法的瓶颈在于目前对于酶分子结构及催化机理的研究还不够全面，因此想要有目的性、理性地改造蛋白还有一定的难度。

针对于这种矛盾，产生了酶分子体外定向进化技术，根据达尔文进化论，在试管内模拟进化机制，在实验室中模拟自然进化的条件，人工筛选出新的或者性状得到提高的蛋白。

酶分子的定向进化基本思路分为两个步骤：突变文库的建立与优质突变体的筛选。

最早出现的基因随机突变的方法是易错PCR，这种原理简单操作方便的方法迅速得到广泛运用。只需要在PCR的方法之上，适当改变PCR体系中的反应条件，使聚合酶的保真性下降，产生错配即可(Chen K,Arnold FH.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:5618～22.)。

之后在1994年提出了DNA重排技术，即DNA shuffling技术。理论上讲，这个技术可以造成基因内部大规模的变动，从而引入突变，构建突变文库(Stemmer WP.Nature,1994,370:389～91.)。在DNA shuffling技术的基础上，后来又出现了StEP、RPR等新技术，但原理类似，都是基因片段的重组。

高效的突变手段必须与高效的筛选手段相互搭配。在文库的筛选手段中，最为常见的为高通量筛选。高通量筛选通常在96孔板上进行，采用自动化的技术对流体进行分配与测定。高通量筛选具有微量分析的优势，即测定参数所需的样品不需要很多，因此可以对实验室范围内多样本但是样品容量较小的样品进行检测。

发明内容

本发明所要解决的问题是在葡萄糖氧化酶现有的酶活基础上进一步提高酶活。通过非理性的DNA shuffling技术改造来自于黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因，之后从构建的突变库中筛选得到酶活显著提高的菌株。

本发明所要解决的问题是通过以下实验方案来实现的：

一种通过非理性突变得到的新的人工改造的葡萄糖氧化酶基因，其特征在于：具体核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种通过非理性突变得到的新的人工改造的葡萄糖氧化酶，其特征在于：具体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明将克隆获得的黑曲霉Z-25中的葡萄糖氧化酶基因通过DNaseI随机切割为基因片段，挑选其中50-60bp大小的片段利用DNA shuffling技术将片段重组成为完整的片段，得到葡萄糖氧化酶基因的突变库。

含有上述非理性突变得到的葡萄糖氧化酶基因的穿梭表达质粒以及含有该穿梭表达质粒的宿主细胞也在本发明的保护范畴之列；其中，所述的穿梭表达质粒是大肠杆菌与酵母菌之间的穿梭表达质粒，优选为大肠杆菌BMTOP10与毕赤酵母GS115。

一种葡萄糖氧化酶基因突变库的高通量筛选方法，包括：将上述得到的葡萄糖氧化酶基因的突变库与所述的穿梭表达质粒连接，直接转化酵母细胞；从平板培养基中挑出菌株在48孔板中诱导重组蛋白表达，在96孔板中进行酶活测定，直接用最终宿主酵母来做高通量筛选而省去了大肠杆菌的筛选步骤。

本发明利用黑曲霉Z-25(Aspergillus.niger Z-25)来源的葡萄糖氧化酶基因进行DNA shuffling改造，得到葡萄糖氧化酶突变基因库，再将突变基因库与穿梭表达质粒连接转化如毕赤酵母GS115中表达，从中筛选酶活显著提高的菌株，之后在对其序列进行测序分析。实验结果表明，筛选得到的菌株在表达葡萄糖氧化酶的水平上达到了较高的水平。另外，由于使用的穿梭表达质粒可以将得到的基因整合入酵母菌的基因组染色体中，因此得到的高酶活菌株具有稳定的遗传性。

附图说明

图1黑曲霉Z-25葡萄糖氧化酶扩增电泳图

图2 DNaseI酶切黑曲霉Z-25葡萄糖氧化酶电泳图

图3葡萄糖氧化酶基因片段重聚电泳图

图4葡萄糖氧化酶基因突变库与穿梭表达质粒连接示意图

图5 48深孔板诱导葡萄糖氧化酶突变基因转化子示意图

图6 96孔板高通量筛选葡萄糖氧化酶突变基因转化子示意图

图7高酶活突变基因转化子3升发酵葡萄糖氧化酶酶活曲线图

图8高酶活突变基因转化子3升发酵液上清蛋白含量曲线图

图9高酶活突变基因转化子3升发酵比酶活曲线图

图10高酶活突变基因转化子3升发酵生物量曲线图

图11高酶活突变基因转化子3升发酵细胞干重曲线图

图12高酶活突变基因转化子遗传稳定性电泳图

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明的细节。但是实施例均为示范性质，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域内技术人员应该理解为，在本发明的精神和范围中可以对发明的技术方案细节和形式进行修改或替换，但是这些修改与替换均在本发明的保护范围之内。

说明：以下具体实施例中所涉及到的基因操作技术均为本领域内现阶段成熟的常规技术。除去未做详细介绍的技术，均按照下列实验手册或文献中的相关章节进行：以下实施例中没有特别说明浓度均为体积浓度。

EasySelect^TM Pichia Expression Kit A Manual of Methods for Expressionof Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZαin Pichia pastoris Catalogno.K1740-01；Molecμlar(单词正确)Cloning:a laboratory manual on the web。

实施例1黑曲霉Z-25葡萄糖氧化酶基因的扩增

1.1 菌株与质粒

黑曲霉Z-25(Aspergillus.niger Z-25)；

大肠杆菌BWTOP10(Escherichia.coli BMTOP10)菌株由北京博迈德科技发展有限有限公司购得；

扩增引物的合成由华大基因完成；

测序载体pMD19-T购自Takara公司；

1.2 葡萄糖氧化酶基因的扩增

首先进行葡萄糖氧化酶发酵实验所使用的黑曲霉Z-25菌丝体中提取黑曲霉的基因组。

采用改进氯化苄法提取黑曲霉Z-25基因组。

(1)抽滤在查氏培养基中得到的菌丝球，尽量用滤纸将培养基中的水分吸干

(2)在液氮中将收集到的菌体研磨成粉末状，-20℃保存

(3)取0.2g菌体至1.5ml离心管中，加入500μl已经预热至50℃的提取液，振荡充分混合，静置2min，加入100μl 10％SDS，混匀，加入300μl氯化苄，剧烈振荡使管中呈乳状

(4)50℃水浴1h，每10min上下颠倒振荡混合一次，使反应完全

(5)取出离心管，加入300μlNaAc，混匀冰浴15min，每4-5min颠倒混合一次

(6)10℃6000rpm离心15min，收集上清至新离心管中

(7)加入体积比为23:1:1的氯仿：异戊醇：苯酚，混匀，10℃，10000rpm，15min，离心收集上清

(8)加入氯仿：异戊醇(24:1)抽提2-3次，收集终上清

(9)向上清中加入等体积的冷冻异戊醇，稍微颠倒，室温沉淀20min

(10)10℃，10000rpm，离心5min

(11)弃上清，留沉淀，用70％乙醇洗涤2次，每次10℃，10000rpm，离心10min，最后用无水乙醇洗一次

(12)4℃，10000rpm，离心15min，倒去乙醇，超净台吹干

(13)加入100μl水溶解，-20℃保存

由以下引物进行葡萄糖氧化酶基因的扩增：

上游	5-CTCCTAGGATGCAGACTCTCCTTGTGAGCT-3
		下游	5-ATGCGGCCGCTCACTGCATGGAAGCATAATCC-3

黑曲霉Z-25葡萄糖氧化酶基因除去信号肽之后，长度为1746bp，编码582个氨 基酸，该基因已经在GeneBank上注册，登录号为FJ979866.1(SEQ ID NO.1)。

实施例2葡萄糖氧化酶突变基因库的构建

2.1DNaseI随机切割葡萄糖氧化酶基因

首先利用DNaseI对扩增得到的葡萄糖氧化酶进行随机切割，DNaseI可以对任何基因进行非特异性切割，体系如下：

葡萄糖氧化酶基因	10μl
		DNaseI缓冲液	2μl
DNaseI	0.8μl
		ddH2O	7.2μl
条件	37℃恒温1h

2.2葡萄糖氧化酶片段重聚(DNA shuffling)

取一定量的葡萄糖氧化酶碎片作为底物，加入酶与dNTP进行无引物的PCR，此过程即为DNA shuffling的过程。

具体的体系如下：

Tag Mix	10μl
		ddH2O	3μl
基因碎片	7μl

Shuffling PCR程序为：

1	94℃	3min
			2	94℃	30s

3	56.5℃	30s
			4	72℃	30s
5	重复2-4步	55次
			6	72℃	10min

之后在以上shuffling产物中加入引物得到葡萄糖氧化酶的变异基团(GOD-Mtt)，具体体系如下：

Shuffling产物	20μμl
		上游引物	4μl
下游引物	4μl
		ddH2O	12μl
Tag Mix	40μlμl

在葡萄糖氧化酶片段的重聚的过程中会遇到整个实验流程中最大的困难，也就是如何能够从经过DNaseI消化之后的基因碎片中重新获得完整的基因片段，而影响重聚效果的因素有好多，其中片段的大小占据主要因素。

本实验中经过多种尝试，先后实验了10bp、30bp、50bp、60bp、100bp、200bp、400bp以及600bp的长度，最终，实验结果显示，在50-60bp长度的基因片段能够比较理想地重聚为完整的基因片段，并且在后续导入酵母菌株当中能够显示出活性。

因此，在克服了重聚困难的前提下继续进行后续的实验操作。

2.3GOD-Mtt与穿梭表达质粒pPIC9K双酶切

对GOD-Mtt与穿梭表达质粒pPIC9K先后进行AvrII与NotI分步酶切，酶切体系如下：

2.4重组质粒的构建

将双酶切后的载体与基因连接，16℃，过夜连接，连接体系为：

T4连接酶	0.5μl
		连接酶缓冲液	1μl
双酶切pPIC9K-(A-N)	2μl
		双酶切GOD-Mtt-(A-N)	6.5μl

葡萄糖氧化酶变异基因与穿梭表达质粒pPIC9K连接之后组成变异基因库，命名为pPIC9K-GOD-Mtt。

实施例3将葡萄糖氧化酶变异基因库导入毕赤酵母GS115及其筛选

3.1菌株与质粒

酵母表达菌株毕赤酵母GS115；

穿梭表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司；

测序载体pMD19-T购自Takara公司。

3.2培养基以及酶活测定底物

用于酵母菌培养的常规培养基YPD、酵母菌富集培养基BMGY以及酵母菌诱导培养基BMMY具体成分参照EasySelect^TM Pichia Expression Kit A Manual of Methods forExpression of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZαin Pichia pastorisCatalog no.K1740-01。

用于筛选出的高酶活表达酵母菌的3L放大发酵培养基配方参照刘彦丽等人的《毕赤酵母发酵生产重组人血清白蛋白高密度培养条件的研究》中所涉及到的培养基组成。

酶活测定底物：

先配置前五个，30℃温育10min，之后再用HCl终止反应。在540nm测定其吸光度。上述所列各项底物的用量为了适应高通量筛选的96孔板方法而进行了调整。

3.3葡萄糖氧化酶酶活标准曲线的绘制

由Sigma公司购买葡萄糖氧化酶标准品，稀释至一定的梯度绘制标准曲线。

稀释的梯度如下：0.4,0.8,1.0,2.0,4.0U/ml，按照3.2中所述的底物配比混合保温 之后测定吸光度OD540。

以葡萄糖氧化酶标准品酶活为纵坐标，以OD540为横坐标，对散点进行二次线性回归做标准曲线。

根据标准曲线的结果，得出葡萄糖氧化酶酶活单位的计算公式：

酶活(U/ml)＝(4.792x-0.637)×N

其中x为反应终止之后在OD540处的吸光度；N为样品的稀释倍数。

3.4葡萄糖氧化酶变异基因在毕赤酵母GS115中的表达

为了便于穿梭质粒携带葡萄糖氧化酶变异基因进入毕赤酵母中，同时便于进入酵母菌中的基因能够整合入酵母菌的基因组中，先用PmeI对变异基因库pPIC9K-GOD-Mtt进行线性化酶切。

之后采用电击转化的方式转化酵母菌。将转化菌液涂布在MD平板上30℃培养4天至长出转化子。随机挑选转化子连同对照酵母菌株一起接种至含有BMGY液体培养基的48深孔板中富集菌体24小时；收集菌体并将其转移至含有BMMY液体培养基的48深孔板中利用甲醇进行诱导。诱导72小时后离心菌体，测定上清液的葡萄糖氧化酶酶活。

在发现酶活与对照组相比有显著提高的菌株之后将菌株纯化放大培养。首先从纯化的平板上讲菌落转移至4mlYPD液体试管培养基中。培养24小时后以1％接种量转接50mlBMGY，培养24小时之后收集菌体转移至100mlBMMY培养基中进行甲醇的流加诱导。诱导72小时之后测定酶活。

在放大至100ml诱导发酵之后可以确定酶活确实有所提高的菌株，以此菌株为出发菌扩增出其中变异的葡萄糖氧化酶基因，再次进行DNA shuffling。

重复上述相关步骤，在两轮DNA shuffling之后，总共筛选大约1000株含有突变基因的菌株。得到一株酶活与对照组相比有显著提高的菌株，命名为ZC#4。

3.5高酶活菌株的放大高密度发酵

对筛选得到的菌株ZC#4进行放大至3L发酵罐水平的高密度发酵。

以1％的接种量将液体菌液接种至200mlBMGY培养基中进行种子培养。大概48小时之后至OD600达到20左右种子养成，接种于3L发酵罐中。

由发酵罐控制柜控制发酵条件。在菌体富集阶段为pH6.0，温度28℃，通气量8L/min，搅拌速度300rpm。当溶氧下降至最低值后突越回高值的时候开始流加甲醇进行诱导。此时搅拌速度提高为500rpm。控制发酵罐内甲醇的浓度为0.8％左右。

诱导阶段，每12小时取样，将样品离心之后测定上清液中的葡萄糖氧化酶酶活、蛋白含量、OD600的生物量，同时烘干菌体，测定菌体干重。随着诱导时间增长，酶活不断上升，诱导132小时后停止诱导，发酵完成。

从3L发酵的结果可得，筛选得到的ZC#4转化子在甲醇诱导132小时之后酶活达到767U/ml(图7)，蛋白分泌量为0.89mg/ml(图8)，换算之后比酶活达到858U/mg(图9)，生物量OD600最高达到311(图10)，细胞干重最终为85g/L(图11)。

经过与现阶段已知的葡萄糖氧化酶生产或改造方案相比，可以看出两轮DNAshuffling改造之后，可以筛选得到酶活有着显著提高的菌株。

实施例4ZC#4菌株遗传稳定性的验证

4.1ZC#4的传代

由于单纯使用液体YPD培养基会造成染菌，而单纯使用YPD平板培养基会出现菌株退化的情况。因此菌株的传代采用液固交替的方法进行传代。

首先从平板之上将菌落完整挑取接种至4mlYPD液体培养基中，在30℃，180rpm的条件下培养24小时，之后在含有G418的YPD平板之上进行划线培养，完成一轮纯化。如此交替进行五轮传代。

第一代菌体命名为ZC#4-1，传代五代之后的为菌株ZC#4-5。

4.2ZC#4-1与ZC#4-5遗传稳定性发酵酶活验证

从G418抗性平板上分别选取ZC#4-1与ZC#4-5的酵母菌株接种至4mlYPD液体培养基中，以1％的接种量接种至50mlBMGY液体培养基中富集菌体24小时；收集菌体并将其转移至100mlBMMY液体培养基中利用1％甲醇进行诱导表达。诱导72小时后离心菌体，测定上清液中葡萄糖氧化酶酶活。

酶活的测定结果显示，ZC#4-1与ZC#4-5的酶活分别为21.66U/ml与23.87U/ml。第五代的菌株与第一代的菌株酶活相比酶活虽然有所上升，但是上升的幅度在误差范围之内。

因此，由酶活数据可以得出，筛选得到的高酶活菌株在酶活上保持良好的效果。

4.3ZC#4-1与ZC#4-5遗传稳定性PCR验证

4.2中从G418抗性平板上分别选取的ZC#4-1与ZC#4-5的酵母菌株接种至4mlYPD液体培养基中，利用得到的菌体提起酵母菌的基因组，以提取得到的基因组为模板，从中扩增葡萄糖氧化酶变异基因。

PCR的电泳结果显示(图12)，在ZC#4-1与ZC#4-5的基因组中都扩增得到了相应的基因。表明第五代的菌株与第一代的菌株在遗传学上具有很好的稳定性，整合入酵母基因组中的基因可以稳定遗传给后代。

Claims (8)

1.一种通过非理性突变得到的新的人工改造的葡萄糖氧化酶基因，其特征在于：核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种通过非理性突变得到的新的人工改造的葡萄糖氧化酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.各种含有权利要求2中涉及到的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的葡萄糖氧化酶表达菌株。

4.权利要求1中所述基因在分泌表达葡萄糖氧化酶中的应用。

5.根据权利要求4中所述基因在分泌表达葡萄糖氧化酶中的应用，其特征在于：

将所述的通过非理性突变得到的新的人工改造的葡萄糖氧化酶基因在原核细胞中，与用于原核细胞进行基因操作所用的穿梭表达质粒连接构成重组表达质粒；将重组表达质粒转化入真核细胞表达蛋白并整合入真核细胞基因组中得到重组酵母；培养重组酵母，诱导葡萄糖氧化酶的分泌表达。

6.按照权利要求5中所述的应用，原核细胞为大肠杆菌Escherichia coli BMTOP10。

7.按照权利要求5中所述的应用，其特征在于：

真核细胞表达蛋白是毕赤酵母Pichia pastoris GS115表达蛋白。

8.按照权利要求5所述的应用，其特征在于：将所述的通过非理性突变得到的新的人工改造的葡萄糖氧化酶基因在大肠杆菌Escherichia coli BMTOP10中与穿梭表达质粒连接构成重组表达质粒；将重组表达质粒转化入毕赤酵母Pichia pastoris GS115并整合入其基因组中得到重组酵母；培养重组酵母，诱导葡萄糖氧化酶的分泌表达。