CN104263722A - 用于人类dermokine基因亚型mRNA表达量检测的扩增引物及其试剂盒 - Google Patents
用于人类dermokine基因亚型mRNA表达量检测的扩增引物及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于人类dermokine基因亚型mRNA表达量检测的扩增引物及其试剂盒。引物根据dermokine亚型mRNA的特异性性设计。试剂盒包括：10条8联PCR反应管，分别包被有2×10-3nmol针对dermokine-α、dermokine-β/γ、dermokine-γ和GAPDH的特异性引物；试剂A：5U/μLTaqDNA聚合酶，20μL；试剂B：2×PCR缓冲液组成，包含600nMROX，1×SYBR?GreenIdye，2mMdNTPs（包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、80mMTris-HCl、80mMKCl、40mM(NH4)2SO4、6mMMgSO4。本发明所提供的整套试剂盒可对人类dermokine不同亚型mRNA表达量进行相对定量分析，检测胰腺癌、大肠癌、皮肤鳞状细胞癌等肿瘤的dermokine表达，为临床诊断及治疗提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于聚合酶链反应(PCR)的分子生物学方法，尤其涉及一种用于人类dermokine基因亚型mRNA表达量检测的扩增引物及其试剂盒。
背景技术
Dermokine是最初在小鼠皮肤棘层中发现的一个特异性基因。近年来对dermokine基因的深入研究发现人类的动dermokine(sk89/30)基因在染色体19q13.12上，位于SBSN和KDAP基因的两侧，由27个外显子编码，全长约17kb。作为一种新型的角质形成细胞分泌的肽，dermokine与另外两种角质形成细胞分泌的肽SBSN和KDAP组成复层上皮细胞基因分泌的复合体(SCC)。Dermokine基因有许多的亚型，除α、β亚型外，还包括γ1、γ2，ε1-3，ζ1-6。Dermokine基因各种亚型的表达均有差异，其中α、β、γ在复层上皮细胞差异分化中高表达，而γ、ζ在正常的上皮细胞中表达外还在EST中发现在癌基因中有表达。Dermokine基因转录时进行复杂的选择性剪接，如α、β、γ编码分泌性蛋白，ζ编码细胞内蛋白。这种差异性表达模式也表明其生物学效应的不同。
Dermokine基因在多种肿瘤如胰腺癌，大肠癌，皮肤鳞状细胞癌等的发生与发展有着密切的关系。Tomoyuki等人的研究表明Dermokine-β/γ在结肠癌和结肠腺瘤当中异常高表达，KENJI等人的研究发现Dermokine-γ的mRNA在体外培养的六种胰腺癌细胞株中有五种(PK-59,NOR-P1,PK-45H,PK-1and KP4)中高表达，并且还在胰腺导管腺癌的癌组织和导管内***状黏液性肿瘤(IPMN)的样本中异常高表达。更是将其与CEA、CA199等肿瘤标志物用酶联免疫法联合检测作为胰腺癌的早期诊断指标。另外，胰腺癌细胞株Panc-1和胰腺癌耐药细胞株比较，选取基因芯片研究发现Dermokine基因在耐药细胞中表达增加，荧光指数从4000，升高到27000。从而为dermokine基因与胰腺癌的发病机制的研究提供了新的表达分型技术。实验操作中快速分离目的细胞并完成总RNA的提取，并于荧光PCR仪器上进行检测。一次性完成对dermokine-α、β、γ的分型及相对定量，可以有效的缩短实验时间、减少经济费用，试剂和仪器可开放使用。对人类dermokine基因亚型的表达量水平研究依赖快速、准确、简单的筛选技术和定量检测技术。荧光定量的聚合酶链反应(Q-PCR)技术可以定量检测低拷贝的核酸片段，首先通过对提取的人总RNA进行逆转录成cDNA，再通过Q-PCR进行相对定量的分析。
检测人dermokine基因亚型mRNA的表达水平，对胰腺癌、大肠癌，皮肤鳞状细胞癌等的发生与发展的监测有重要意义。通过对提取组织总RNA并逆转录为cDNA，然后设计特定引物进行实时荧光定量PCR扩增。此建立的Q-PCR技术,灵敏度高,特异性强,能精确、简便地对人dermokine基因亚型的表达水平进行定量，从而有助于对胰腺癌和结直肠癌等疾病的诊断、治疗和发病机理进行研究。
目前，还未开发出检测全面、结果准确的人类dermokine基因亚型表达量水平检测的试剂盒，用于临床诊断。本发明基于聚合酶链反应(PCR)，特别是涉及荧光定量的聚合酶链反应(Q-PCR)，通过设计、筛选得到一套理想的对人dermokine基因各亚型编码区进行扩增的引物进行Q-CR分析，达到全面检测人类dermokine亚型表达量的高低，解决目前各型dermokine基因表达的相对定量技术。
发明内容
本发明的目的是克服现有诊断技术中难以对人类dermokine亚型进行定量分析，在一些癌症(如胰腺癌、结直肠癌、皮肤鳞状细胞癌)中分离到有利于早期诊断的dermokine亚型，并分析各亚型在治疗和耐药形成的各型dermokine表达情况，用于评估耐药形成。并提供一种检测人类dermokine基因亚型相对表达量的技术。设计一套优化引物进行Q-PCR分析，对dermokine亚型在癌症细胞中的差异表达进行相对定量的检测。
本发明第二个目的是提供一种配套人类dermokine亚型α、β、γ定量检测的三对引物，此套引物进行人dermokine基因表达量检测的特定Q-PCR反应程序，以达到对dermokine亚型表达更准确的评估。
本发明的第三个目的是提供一种对临床标本进行人类dermokine亚型相对定量检测的试剂盒。
本发明的技术方案如下：
用于人类dermokine基因亚型mRNA表达量检测的扩增引物包括一对扩增dermokineα的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，一对扩增dermokineβ/γ的引物SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，一对扩增γ的引物SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。
用于检测人dermokine基因3种亚型mRNA的表达水平的的试剂盒由下列试剂组成：
试剂A：5U/μL Taq DNA聚合酶，20μL；
试剂B：2×PCR缓冲液组成，包含600nM ROX、1×Green I dye、2mM dNTPs、80mM Tris-HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2SO4、6mM MgSO4；
包被引物的PCR反应管：
一号反应管：含有针对dermokine-α的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，含量为2×10-3nmolSEQ ID NO.1和2×10-3nmol SEQ ID NO.2；
二号反应管：含有针对dermokineβ/γ的引物SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，含量为2×10-3nmol SEQ ID NO.3和2×10-3nmol SEQ ID NO.4；
三号反应管：含有针对dermokineγ的引物SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，含量为2×10-3nmolSEQ ID NO.5和2×10-3nmol SEQ ID NO.6；
四号反应管：含有针对GAPDH的引物，含量为2×10-3nmol。
本发明与现有技术相比具有的有益效果是：设计的引物特异性结合dermokine-α、dermokine-β/γ、dermokine-γ的mRNA片段，通过PCR技术能特异性区分dermokine各型的表达量。通过试剂盒检测人类dermokine亚型表达量的高低，对肿瘤的早期诊断与治疗有重要作用。并可用于肿瘤形成，耐药进化的研究。此试剂盒可以有效的缩短实验时间、减少经济费用，试剂和仪器可开放使用。通过优化实验反应体系和反应条件，组成检测灵敏、方便的试剂盒，为肿瘤的早期诊断及治疗效果评估提供可靠的检测技术。
附图说明
图1 dermokine阳性扩增曲线图；
从左到右分别为dermokine-α、dermokine-β/γ和dermokine-γ的结果；
图2 dermokine阴性扩增曲线图；
从左到右分别为dermokine-α、dermokine-β/γ和dermokine-γ的结果；
图3 dermokine扩增的熔接曲线图；
从左到右分别为dermokine-α、dermokine-β/γ和dermokine-γ的结果。
具体实施方式
本发明的扩增和测序引物核苷酸序列为：
SEQ ID NO.1 5’-ccactgcctctgctctgc-3’
SEQ ID NO.2 5’-gttgtaattgtagttctgatcggct-3’
SEQ ID NO.3 5’-ggcacgagattggcagacag-3’
SEQ ID NO.4 5’-ccagaagtttcccaagcacc-3’
SEQ ID NO.5 5’-ccaaatcattgcgtagttcc-3’
SEQ ID NO.6 5’-gggcttcattccctggctt-3’
用于检测人dermokine基因亚型mRNA的表达水平的扩增引物包括一对扩增dermokineα的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，一对扩增dermokineβ/γ的引物SEQ ID NO.3、SEQID NO.4，一对扩增γ的引物SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。
用于检测人dermokine基因3种亚型mRNA的表达水平的的试剂盒由下列试剂组成：
试剂A：5U/μL Taq DNA聚合酶，20μL；
试剂B：2×PCR缓冲液组成，包含600nM ROX、1×Green I dye、2mM dNTPs、80mM Tris-HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2SO4、6mM MgSO4；
包被引物的PCR反应管：
一号反应管：含有针对dermokine-α的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，含量为2×10-3nmolSEQ ID NO.1和2×10-3nmol SEQ ID NO.2；
二号反应管：含有针对dermokineβ/γ的引物SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，含量为2×10-3nmol SEQ ID NO.3和2×10-3nmol SEQ ID NO.4；
三号反应管：含有针对dermokineγ的引物SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，含量为2×10-3nmolSEQ ID NO.5和2×10-3nmol SEQ ID NO.6；
四号反应管：含有针对GAPDH的引物，含量为2×10-3nmol。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1
①取新鲜组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟；培养细胞总RNA提取可直接加入1ml的Trizol。②.每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。③.将上层水相转入新的1.5mlEP管中(约400-500ul)，加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。④.RNA的洗脱小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75％的乙醇(预冷)振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。⑤.小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干(约30分钟，此时RNA沉淀变透明)。注意不能让RNA沉淀完全干燥(会极大地降低它地可溶性)。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。⑥.提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。
实施例2
一种配套此方法检测目的mRNA的逆转录操作程序。10μL体系中含1μL mRNA(0.5pg-1μg)，polyA逆转录引物1μL，逆转录酶试剂1μL和逆转录缓冲液2μL，加水5μL(终浓度dNTP为1mM，引物为500nM，M-MuLV逆转录酶浓度为40U，Tris-HCl浓度为50mM，KCl浓度为50mM，MgCl2浓度为4mM)。逆转录程序为冰上放置5min，30℃30min，95℃5min。逆转录完成后，试管内加入90μL水，进行10倍的稀释。
实施例3
通过常规方法对各PCR管的Ct值进行分析，经与GAPD内对照进行比较后得出结果。
实施例3
用本发明试剂盒检测dermokine基因表达量的Q-PCR方法，及操作过程和反应程序。每个项目需要进行2个重复管的检测，每反应管反应系为20μL。首先，按实验的标本个数计算各试剂的需要量，实验步骤如下：
1.扩增反应液配置：按顺序配置反应液(1个检测标本)，首先取18μL稀释后的cDNA加入空白的管中，加90μL的试剂B，加水70μL，加2μL试剂A，共180μL；混匀。
2.各管按顺序加入20μL的扩增反应液，盖好盖子。
3.按实验设计的PCR程序进行扩增：为95℃预变性3分钟后，94℃变性5秒，61℃退火延伸30秒，延伸期获取荧光值，进行40个循环，最后保存在25℃；及时取出进行测序。
4.通过常规方法对各PCR管的Ct值进行分析，经与GAPD内对照进行比较后得出结果。
序列表
<110> 温州医科大学附属第一医院
<120> 用于人类dermokine基因亚型mRNA表达量检测的扩增引物及其试剂盒
<160> 6
<170> PatentIn Version 2.1
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> prim_bind
<222> (1)...(18)
<400> 1
ccactgcctc tgctctgc
18
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> prim_bind
<222> (1)...(25)
<400> 2
gttgtaattg tagttctgat cggct 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> prim_bind
<222> (1)...(20)
<400> 3
ggcacgagat tggcagacag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> prim_bind
<222> (1)...(20)
<400> 4
ccagaagttt cccaagcacc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> prim_bind
<222> (1)...(20)
<400> 5
ccaaatcatt gcgtagttcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> prim_bind
<222> (1)...(19)
<400> 6
gggcttcatt ccctggctt 19
Claims (2)
1.一种用于人类dermokine基因亚型mRNA表达量检测的扩增引物，其特征在于包括一对扩增 dermokineα的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，一对扩增 dermokine β/γ的引物SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，一对扩增γ的引物SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。
2.一种用于检测人dermokine基因3种亚型mRNA的表达水平的的试剂盒，其特征在于由下列试剂组成：
试剂A：5U/μL Taq DNA聚合酶，20μL；
试剂B：2×PCR缓冲液组成，包含600nM ROX、1×SYBR? Green I dye、2mM dNTPs、80mM Tris-HCl、80mM KCl、40mM (NH4)2SO4、6mM MgSO4；
包被引物的PCR反应管：
一号反应管：含有针对dermokine-α的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，含量为2×10-3nmol SEQ ID NO.1和2×10-3nmol SEQ ID NO.2；
二号反应管：含有针对dermokine β/γ的引物SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，含量为2×10-3nmol SEQ ID NO.3和2×10-3nmol SEQ ID NO.4；
三号反应管：含有针对dermokineγ的引物SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，含量为2×10-3nmol SEQ ID NO.5和2×10-3nmol SEQ ID NO.6；
四号反应管：含有针对GAPDH的引物，含量为2×10-3nmol。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150107 |