CN104263705A - 一种利用黄孢原毛平革菌选择性产生木质素降解酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用黄孢原毛平革菌选择性产生木质素降解酶的方法。本发明提供了利用黄孢原毛平革菌产生木质素降解酶的方法，包括如下步骤：在含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基中发酵黄孢原毛平革菌，收集发酵产物，即得到木质素降解酶；本发明的实验证明，采用本方法进行木质素降解酶发酵，不需在培养过程中通入纯氧或含高浓度氧气的空气，只需控制培养基中的碳氮源浓度和加入非浸没量的载体，即可在空气条件下选择性获得木质素降解酶。本发明方法条件控制简单，获得的木质素降解酶选择性强。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用黄孢原毛平革菌选择性产生木质素降解酶的方法。
背景技术
白腐真菌是一种高等丝状真菌，在分类上大多数属于担子菌纲，生长在树木或木材上，因引起木质白色腐烂而得名。白腐真菌降解木质素，是因为它能够产生木质素降解酶，并分泌到细胞外。木质素降解酶对木质素的降解是以自由基为基础的链反应过程，具有极强的底物非特异性和氧化性，这种降解机制使木质素降解酶不仅能够降解木质素，还能够降解环境中的许多异生物质和持久性有毒有机污染物(Barr&Aust,1994；Cameron et al.,2000；Gao et al.,2010)。因此，白腐真菌及其木质素降解酶在环境污染控制及其生物修复等方面具有重要的应用价值。
黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是白腐真菌产生木质素降解酶和降解环境污染物研究的模式菌种(Wesenberg et al.,2003；Singh&Chen,2008)，属非褶菌目(Phyllophorales)、伏革科(Corticiaceae)和显革菌属(Phanerochaete)。P.chrysosporium木质素降解酶***主要包括木质素过氧化物酶(LiP,EC1.11.1.14)、锰过氧化物酶(MnP,EC1.11.1.13)和产H2O2的氧化酶。木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶是糖基化的含铁的多种同功酶，木质素过氧化物酶能够催化对非酚类木质素型式化合物和芳香族污染物的氧化，锰过氧化物酶能够催化对木质素、木质素衍生物和很多酚类的木质素型式化合物的氧化。黄孢原毛平革菌木质素降解酶的合成受到多种营养和环境因素的复杂调节，木质素降解酶能够在受到氮、碳或硫营养限制时激发产生，在高氧条件下表现活跃(Faison&Kirk,1985；Dosoretz et al.,1990)。高氧条件被认为可以改善氧在菌丝中的传质，特别是在胞外多糖积累的情况下，从而诱导酶的合成。一般认为黄孢原毛平革菌不产生漆酶。
木质素降解酶的应用依赖于酶的高水平发酵。黄孢原毛平革菌木质素降解酶发酵的研究，主要包括以下方面(Ikehata et al.,2004；Singh&Chen,2008)：(1)发酵的营养条件(包括合适的碳源、氮源、微量元素、溶解氧和诱导物等)；(2)发酵的环境条件(如温度、pH、搅拌和固定化条件等)；和(3)反应器发酵放大的研究。木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶是紧密相关的酶类，在白腐真菌中通常同时产生。不过，二者的催化机制有所不同，对不同结构的底物具有不同的降解能力(Cameron et al.,2000；Martinez,2002)。由于两种过氧化物酶的产生受到营养和环境因素影响的程度存在差异，两种酶的合成在共同的调节性质之外可能存在各自的特征。因此，利用营养和环境条件对酶合成调节的差异，有可能实现两种过氧化物酶的选择性产生。过氧化物酶的选择性产生有助于木质素降解酶合成和调节机制的研究，同时对于满足具有不同结构特征有机污染物的降解需要具有重要的应用意义。至今，利用黄孢原毛平革菌选择性产生木质素降解酶的报道还很罕见。Bonnarme和Jeffries(1990a,b)发现锰离子(Mn2+)对黄孢原毛平革菌木质素降解酶合成具有不同的调节效应，通过控制培养基中Mn2+浓度在气升式反应器中实现了黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的选择性产生，不过，要求纯氧通入是其发酵过程的一个限制。李华钟等(2002)同样研究了黄孢原毛平革菌在Mn2+浓度调节下木质素降解酶的选择性产生，不过效果尚不够理想，且仍受纯氧供应的限制。
除了Mn2+控制，目前，还没有见到利用其他调节手段实现黄孢原毛平革菌木质素降解酶选择性产生的报道，尤其是在空气环境中。木质素降解酶在空气条件下的有效合成对于酶的大规模发酵具有成本效益和更大的可行性。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种利用黄孢原毛平革菌产生木质素降解酶的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：在含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基中发酵黄孢原毛平革菌，收集发酵产物，即得到木质素降解酶；
所述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基为将所述固定化培养载体加入用于培养白腐真菌的液体培养基中，且使其堆积高度高于所述液体培养基液面，处于非浸没状态，得到的培养基。
上述方法中，所述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基中固定化培养载体的含量大于等于1.8g/100mL。
上述方法中，所述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基中固定化培养载体的含量为1.8g/100mL-3.0g/100mL，具体为1.8g/100mL、2.2g/100mL、2.6g/100mL或3.0g/100mL。
上述方法中，所述液体培养基为碳限制液体培养基，用其发酵产生的木质素降解酶为木质素过氧化物酶；
所述碳限制液体培养基具体为C原子和N原子的摩尔比小于等于3.8的碳限制液体培养基。
上述方法中，所述碳限制液体培养基中的C原子来源于葡萄糖，N原子来源于酒石酸铵；
每1L所述碳限制培养基由终浓度为5.04g/L葡萄糖、终浓度为4.05g/L酒石酸铵、终浓度为2.0g/L KH2PO4、终浓度为0.5g/L MgSO4、终浓度为0.1g/L CaCl2、终浓度为1mg/L维生素B1、终浓度为1.5mM藜芦醇、pH 4.4且终浓度为20mM乙酸缓冲液和70mL/L微量元素溶液组成；
所述微量元素溶液由终浓度为3g/L MgSO4、终浓度为0.5g/L MnSO4、终浓度为1.0g/L NaCl、终浓度为0.1g/L FeSO4·7H2O、终浓度为0.1g/L CoCl2、终浓度为0.1g/LZnSO4·7H2O、终浓度为0.1g/L CuSO4、终浓度为10mg/L AlK(SO4)2·12H2O、终浓度为10mg/LH3BO3、终浓度为10mg/L Na2MoO4·2H2O、终浓度为1.5g/L次氮基三乙酸盐和水组成。
上述方法中，所述液体培养基为氮限制液体培养基，用其发酵产生的木质素降解酶为锰过氧化物酶；
所述氮限制液体培养基具体为C原子和N原子的摩尔比大于等于152.7的氮限制液体培养基。
上述方法中，所述氮限制液体培养基中的C原子来源于葡萄糖，N原子来源于酒石酸铵；
每1L所述氮限制液体培养基为用终浓度为10.08g/L葡萄糖、终浓度为0.203g/L酒石酸铵替换掉所述碳限制液体培养基中的葡萄糖和酒石酸铵，其余组分与所述碳限制液体培养基相同。
上述方法中，所述液体培养基的pH值均为4.4；
所述固定化培养载体为惰性材料，具体为聚氨酯泡沫块；所述聚氨酯泡沫块的边长尤其具体为0.5cm。
本发明的另一个目的是提供一种利用黄孢原毛平革菌产生木质素降解酶的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基。
上述方法中，所述木质素降解酶为木质素过氧化物酶或锰过氧化物酶。
上述方法或试剂盒中，所述黄孢原毛平革菌为BKM-F-1767，所述培养基的pH均为4.0-5.0，所述发酵培养条件为：温度为37oC，转速为160rpm发酵培养。
本发明的实验证明，本发明采用黄孢原毛平革菌作为木质素降解酶发酵菌株，发酵培养基采用碳限制液体培养基(C/N比不大于3.8，即葡萄糖/NH4 +不大于28/44mM)，或氮限制液体培养基(C/N比不小于152.7，即葡萄糖/NH4 +不小于56/2.2mM)，采用惰性材料作为固定化培养载体，使载体在培养基中处于非浸没状态，在空气环境下振荡培养，在碳限制培养液中主要获得木质素过氧化物酶，在氮限制培养液中主要获得锰过氧化物酶。采用本方法进行木质素降解酶发酵，不需在培养过程中通入纯氧或含高浓度氧气的空气，只需控制培养基中的碳氮源浓度和加入非浸没量的载体，即可在空气条件下选择性获得木质素降解酶。本发明方法条件控制简单，获得的木质素降解酶选择性强。
附图说明
图1为黄孢原毛平革菌在空气环境下固定化培养时在碳限制下木质素过氧化物酶的产生。
图2为黄孢原毛平革菌在空气环境下固定化培养时在氮限制下木质素降解酶的产生.(a)木质素过氧化物酶；(b)锰过氧化物酶。
图3为黄孢原毛平革菌在碳限制下在聚氨酯泡沫块上固定化培养时的扫描电镜照片(FEI QUANTA 200).(a)30×；(b)100×。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中培养基的pH均为4.0-5.0。
实施例1、黄孢原毛平革菌在碳限制下选择性产生木质素过氧化物酶
1、碳限制液体培养基的配制
采用碳限制液体培养基，培养基是基于典型的Tien和Kirk培养基(1988)稍加修改而成，培养基C/N比(摩尔比)为3.8，具体组成如下：
碳限制液体培养基由终浓度为5.04g/L(28mM)葡萄糖、终浓度为4.05g/L(NH4 +44mM)酒石酸铵、终浓度为2.0g/L KH2PO4、终浓度为0.5g/L MgSO4、终浓度为0.1g/L CaCl2、终浓度为1mg/L维生素B1、终浓度为1.5mM藜芦醇、终浓度为20mM(pH 4.4)乙酸缓冲液，70mL/L微量元素溶液和去离子水组成；pH为4.4。
微量元素溶液由终浓度为3g/L MgSO4、终浓度为0.5g/L MnSO4、终浓度为1.0g/LNaCl、终浓度为0.1g/L FeSO4·7H2O、终浓度为0.1g/L CoCl2、终浓度为0.1g/LZnSO4·7H2O、终浓度为0.1g/L CuSO4、终浓度为10mg/L AlK(SO4)2·12H2O、终浓度为10mg/LH3BO3、终浓度为10mg/L Na2MoO4·2H2O、终浓度为1.5g/L次氮基三乙酸盐和水组成。
2、黄孢原毛平革菌在碳限制下选择性产生木质素过氧化物酶
采用边长0.5cm的聚氨酯泡沫块作为固定化培养载体，采用的载体量分别为1.0、1.4、1.8、2.2、2.6和3.0g，将载体置于装有100mL碳限制液体培养基的250mL锥形瓶中，载体的堆积高度对应着不同的浸没和非浸没状态；分为如下两组培养方式：
不同载体量的浸没培养：向100mL碳限制液体培养基中分别加入1.0和1.4g固定化培养载体，且使其堆积高度低于液面，处于浸没状态，得到不同载体量的浸没培养体系；
不同载体量的非浸没培养：向100mL碳限制液体培养基中分别加入1.8、2.2、2.6和3.0g固定化培养载体，且使其堆积高度高于液面，处于非浸没状态，得到不同载体量的非浸没培养体系；
将上述不同载体量的浸没培养体系和不同载体量的非浸没培养体系分别灭菌(115℃，30min)后，将生长在30℃ PDA平板(200g土豆浸出液/L,20g葡萄糖/L，20g琼脂/L)上的黄孢原毛平革菌BKM-F-1767孢子(Tien,M.,Kirk,T.K.Lignin peroxidase ofPhanerochaete chrysosporium.Methods in Enzymology.1988,161:238-249，公众可从清华大学获得)无菌接入培养基中，接种后孢子浓度约为1.0×105孢子/mL。
将上述接入孢子的不同载体量的浸没培养体系和接入孢子的不同载体量的非浸没培养体系，在空气环境(不另外充入纯氧)，温度为37℃，转速为160rpm条件下发酵培养，得到培养液即为发酵产物木质素降解酶溶液。培养液样品经离心(9000r/min，10min，4℃)得到上清液,用于木质素降解酶酶活检测。
将上清液进行木质素过氧化物酶活性分析，木质素过氧化物酶活性采用以藜芦醇为底物的方法测定，每1min氧化1μmol藜芦醇成藜芦醛所需的酶量定义为1个酶活力单位。
木质素过氧化物酶的产生结果如图1所示。
载体量为1.0和1.4g的浸没培养体系培养BKM-F-1767的发酵上清液，没有检测到酶活；
载体量不小于1.8g的非浸没培养体系培养BKM-F-1767的发酵上清液，最大酶活随载体量增大而增大，在3.0g载体时，获得最高酶活为87.5U/L。
将不同培养条件下发酵产物上清液同时进行锰过氧化物酶活性检测，锰过氧化物酶活性采用以Mn2+为底物的方法分析，每1min氧化1μmol Mn2+所需的酶量定义为1个酶活力单位。无论采用何种载体量，培养过程均没有锰过氧化物酶产生。
因此，黄孢原毛平革菌在空气环境下非浸没固定化培养时，在碳限制下能够选择性产生木质素过氧化物酶。
黄孢原毛平革菌在碳限制下在聚氨酯泡沫块上固定化培养时的扫描电镜照片，如图3所示。
实施例2、黄孢原毛平革菌在氮限制下选择性产生锰过氧化物酶
1、氮限制液体培养基的配制
采用氮限制液体培养基，培养基C/N比(摩尔比)为152.7，具体组成如下：
氮限制液体培养基配方为将终浓度为10.08g/L(56mM)葡萄糖、0.203g/L(NH4 +2.2mM)酒石酸铵替换掉碳限制液体培养基中的葡萄糖和酒石酸铵，其余组分与实施例1中的碳限制液体培养基相同；pH为4.4。
2、黄孢原毛平革菌在氮限制下选择性产生锰过氧化物酶
培养条件和分析方法与实施例1相同，仅是培养基替换为氮限制液体培养基。
木质素降解酶产生结果如图2所示，在载体量不小于1.8g时检测到木质素过氧化物酶酶活(2.2g载体时酶活最大)；载体量小于1.8g时，没有检测到木质素过氧化物酶酶活，但在所有载体条件下最高酶活均不超过20U/L(图2a)；
与之相对照，在载体量不小于1.8g时，锰过氧化物酶显著生成，在2.2g载体时，最高酶活达到338.7U/L(图2b)；载体量小于1.8g时，没有检测到锰过氧化物酶酶活。
因此，黄孢原毛平革菌在空气环境下非浸没固定化培养时，在氮限制下能够选择性产生锰过氧化物酶。
Claims (10)
1.一种利用黄孢原毛平革菌产生木质素降解酶的方法，包括如下步骤：在含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基中发酵黄孢原毛平革菌，收集发酵产物，即得到木质素降解酶；
所述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基为将所述固定化培养载体加入用于培养白腐真菌的液体培养基中，且使其堆积高度高于所述液体培养基液面，处于非浸没状态，得到的培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基中固定化培养载体的含量大于等于1.8g/100mL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基中固定化培养载体的含量为1.8g/100mL、2.2g/100mL、2.6g/100mL或3.0g/100mL。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：
所述液体培养基为碳限制液体培养基，用其发酵产生的木质素降解酶为木质素过氧化物酶；
所述碳限制液体培养基具体为C原子和N原子的摩尔比小于等于3.8的碳限制液体培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述碳限制液体培养基中的C原子来源于葡萄糖，N原子来源于酒石酸铵；
每1L所述碳限制培养基由终浓度为5.04g/L葡萄糖、终浓度为4.05g/L酒石酸铵、终浓度为2.0g/L KH2PO4、终浓度为0.5g/L MgSO4、终浓度为0.1g/L CaCl2、终浓度为1mg/L维生素B1、终浓度为1.5mM藜芦醇、pH 4.4且终浓度为20mM乙酸缓冲液和70mL/L微量元素溶液组成；
所述微量元素溶液由终浓度为3g/L MgSO4、终浓度为0.5g/L MnSO4、终浓度为1.0g/L NaCl、终浓度为0.1g/L FeSO4·7H2O、终浓度为0.1g/L CoCl2、终浓度为0.1g/LZnSO4·7H2O、终浓度为0.1g/L CuSO4、终浓度为10mg/L AlK(SO4)2·12H2O、终浓度为10mg/LH3BO3、终浓度为10mg/L Na2MoO4·2H2O、终浓度为1.5g/L次氮基三乙酸盐和水组成。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：
所述液体培养基为氮限制液体培养基，用其发酵产生的木质素降解酶为锰过氧化物酶；
所述氮限制液体培养基具体为C原子和N原子的摩尔比大于等于152.7的氮限制液体培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述氮限制液体培养基中的C原子来源于葡萄糖，N原子来源于酒石酸铵；
每1L所述氮限制液体培养基为用终浓度为10.08g/L葡萄糖、终浓度为0.203g/L酒石酸铵替换掉所述碳限制液体培养基中的葡萄糖和酒石酸铵，其余组分与所述碳限制液体培养基相同。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：
所述液体培养基的pH值均为4.4；
所述固定化培养载体为惰性材料，具体为聚氨酯泡沫块；所述聚氨酯泡沫块的边长尤其具体为0.5cm。
9.一种利用黄孢原毛平革菌产生木质素降解酶的试剂盒，包括权利要求1-8中的所述含有处于非浸没状态的固定化培养载体的培养基。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述木质素降解酶为木质素过氧化物酶或锰过氧化物酶。
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