CN104254615B - 皮肤和毛发颜色控制因子 - Google Patents
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Abstract
在角质形成细胞中黑色素量调节、皮肤或毛发颜色控制、或者角质形成细胞中黑色素量调节剂或者皮肤或毛发颜色控制剂的选择中利用自噬活性。
Description
技术领域
本发明涉及角质形成细胞中的黑色素量的调节,以及皮肤或毛发的颜色的控制。
背景技术
作为决定皮肤或者毛发的颜色的因子报告有各种因子,但是认为其中存在于表皮的黑色素的数量或质量对皮肤或者毛发的颜色产生大的影响。即,皮肤或者毛发的颜色的形成受到由在色素细胞(黑素细胞)中的被称为黑素体(melanosome)的细胞小器官中制造的黑色素向表皮或者毛囊的角质形成细胞中传送从而遍及表皮或者毛发整体的过程的很大的影响。一直以来由该黑素细胞产生的黑色素作为与个体的皮肤或者毛发的颜色相关的因子而广为人知。
作为涉及黑色素生物合成的细胞的黑素细胞含有来自内体的特有的作为溶酶体相关细胞器的黑素体。在该黑素体中,通过以酪氨酸作为前体的催化路径合成黑色素。黑素体主要接受由反式高尔基体网络(trans-Golginetwork)挑选的各种基因产物,其结果具有与溶酶体共同的性质(例如,内部的低pH)。可是,含有一系列的黑色素合成酶以及与之相关的酪氨酸酶、多巴色素异构酶(dopachrometautomerase)、Pmel-17(GP100)的结构蛋白质仅仅传递给黑素体,作为其结果,黑素体具有合成黑色素的特异的性质。在皮肤颜色产生的过程中,被Rab家族成员等各种膜转运因子控制的色素性黑素体成熟,接下来成熟后的黑素体转移至树突,传送至邻接的角质形成细胞。
现有的皮肤美白剂主要是以黑素细胞中的黑色素产生为目标而开发的。例如,在非专利文献1中报告了作为具有阻碍酪氨酸酶的酶活性并且抑制黑色素产生的作用的皮肤美白剂,有抗坏血酸、熊果苷、曲酸等,其中,酪氨酸酶是与由作为黑色素前体的酪氨酸转化为黑色素相关的酶。
另一方面,还报告有由皮肤颜色的不同而发现在角质形成细胞中的黑色素的存在形式或者成熟状态方面有差异(非专利文献2)。即,认为角质形成细胞内的黑色素动态可能会在决定皮肤颜色中起到某些作用。在至今的报告中,启示了作为受体分子的PAR-2参与角质形成细胞中的黑色素的获取(吞噬),以及通过调节其活性来控制皮肤颜色的可能性(非专利文献3~8)。另外,还启示了作为蛋白质分子的动力蛋白(Dynein)或者动力蛋白激活蛋白(Dynactin)参与黑色素传送到角质形成细胞中之后局部存在于角质形成细胞内(非专利文献9和10),进一步,还启示了与被称为丝状伪足(Filopodia)的细胞结构的形成相关的蛋白质分子MyoX参与从黑素细胞传送至角质形成细胞、以及从角质形成细胞传送至角质形成细胞的两种黑色素传送(非专利文献11)。然而,关于在黑素细胞中产生的黑色素(黑素体)通过角质形成细胞的获取、输送以及代谢的机理,尚未充分明确,也没有验证其对于皮肤颜色的作用。
另外,最近,由使用了来自不同民族的角质形成细胞的探讨启示了在所获取的黑色素的代谢能力方面存在民族差异(非专利文献12)。非专利文献12中报告了在表皮细胞获取了用荧光物质标记的黑色素之后,使用分析表皮细胞内的荧光消退的评价体系,结果为黑色素在来自白人的表皮细胞中容易分解。然而,对于有助于分解的机理或者特定的因子没有任何提及。
自噬(自噬作用)通常是指将细胞器等的细胞内物质移送至溶酶体并进行分解的过程(非专利文献13~15)。自噬已知有几种类型。其中研究最多的主要路径是大自噬(Macroautophagy),通常如果说到自噬就是指大自噬。自噬是由饥饿、低氧、能量枯竭、内质网应激、高温等各种生理性应激、激素刺激、药物(雷帕霉素(rapamycin)、氟司必林(fluspirilene)、三氟拉嗪(trifluoperazine)、哌迷清(pimozide)、尼卡地平(nicardipine)、尼古地平(niguldipine)、洛哌丁胺(loperamide)、胺碘酮(amiodarone)、维拉帕米(verapamil)、米诺地尔(minoxidil)、可乐定(clonidine)等)、免疫信号、细菌、病毒以及寄生虫造成的感染、以及急性胰腺炎、心脏疾病等的疾病引起的。由于与自噬相关的现象在酵母、哺乳类等广泛的物种中能够观察到,因此,认为对生物来说起到非常重要的作用。实际上,到现在为止报告了自噬参与到癌症、神经退行性疾病、炎症、免疫、老化等中(非专利文献16)。
自噬由通过被称为自噬体的特别的细胞器引起的一系列过程构成。在自噬过程中,最开始在细胞质中产生被称为隔离膜或者吞噬泡(phagophore)的小胞。吞噬泡慢慢伸长包入细胞质的一部分,形成自噬体,该自噬体是具有双重膜的袋状结构。接下来,自噬体外膜与溶酶体融合形成自噬性溶酶体,其中,内部的物质与自噬体内膜一起被分解。通过自噬产生的分解产物在细胞内被再次利用。在自噬过程中,经过吞噬泡的产生和伸长、自噬体的形成、自噬体和溶酶体的融合、以及自噬性溶酶体的形成和内部物质的分解等多个步骤,而且在各步骤中多种因子参与。主要的因子是被总称为ATG(自噬相关蛋白,Autophagy-relatedproteins)的参与吞噬泡和自噬体的形成的蛋白质。至今报告有30种以上的ATG(非专利文献11)。
但是,至今未知自噬参与角质形成细胞内的黑色素动态、例如,黑色素的获取、积蓄、分解等。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:美白战略(南江堂)IV.,美白剂的药理和临床,p95-116
非专利文献2:Thongetal(2003)BrJDermatol149:498-505
非专利文献3:Linetal(2008)PigmentCellMelanomaRes21:172-183
非专利文献4:Babiarz-Mageeetal(2004)PigmentCellRes17:241-251
非专利文献5:Seibergetal(2000)JInvestDermatol115:162-167
非专利文献6:Seibergetal(2000)ExpCellRes25:25-32
非专利文献7:Seiberg(2001)PigmentCellRes14:236-242
非专利文献8:Paineetal(2001)JInvestDermatol116:587-595
非专利文献9:Byersetal(2003)JInvestDermatol121:813-820
非专利文献10:Byersetal(2007)JInvestDermatol127:1736-1744
非专利文献11:Singhetal(2010)FASEBJ24:3756-3769
非专利文献12:Ebanksetal(2011)JInvestDermatol131:1226-1233
非专利文献13:LevineandKroemer(2008)Cell132:27-42
非专利文献14:Mizushimaetal(2008)Nature451:1069-1075
非专利文献15:Rubinsztein(2006)Nature443:780-786
非专利文献16:Mizushimaetal(2010)Cell140:313-326
非专利文献17:Mizushimaetal(2007)Autophagy3:542-545
非专利文献18:Kirkinetal(2009)MolCell:505-516
发明内容
在一个实施方式中,本发明提供一种包括下述工序的角质形成细胞中黑色素量调节剂的评价或者选择方法,
将被检验物质对细胞进行给药的工序;
测定该细胞中的自噬活性的工序;以及,
基于该测定的结果,评价该被检验物质的黑色素量调节作用的工序。
在其他实施方式中,本发明提供一种包括下述工序的皮肤或者毛发颜色控制剂的评价或者选择方法,
将被检验物质对细胞进行给药的工序;
测定该细胞中的自噬活性的工序;以及,
基于该测定的结果,评价该被检验物质的皮肤或者毛发颜色控制作用的工序。
进一步,在其它实施方式中,本发明提供一种角质形成细胞中的黑色素量的调节方法,其包括调节希望黑色素量调节的角质形成细胞中的自噬活性的工序。
进一步,在其它实施方式中,本发明提供一种被检验体的皮肤或者毛发颜色控制方法,其包括调节希望皮肤或者毛发颜色控制的被检验体的角质形成细胞中的自噬活性的工序。
附图说明
[图1]由溶酶体阻碍导致的黑色素积累。A:蛋白免疫印迹(Westernblotting)分析。B:基于蛋白免疫印迹结果的定量分析;数据为平均±SD(各N=3),*,p<0.05(方差分析(ANOVA),Holm检验)。
[图2]皮肤颜色不同的人种间的自噬相关因子的表达的差异。
[图3]皮肤颜色不同的人种之间的自噬活性的差异。A:蛋白免疫印迹分析。B:基于蛋白免疫印迹的结果的p62和LC3的定量表达分析;数据为平均±SD,**,p<0.01;*,p<0.05(方差分析,Holm检验)。
[图4]皮肤颜色不同的人种间的黑素体获取后的自噬活性的差异。A:蛋白免疫印迹分析。B:基于蛋白免疫印迹的结果的定量表达分析;数据为平均±SD,**,p<0.01;*,p<0.05(方差分析,Holm检验)。
[图5]由自噬相关因子的表达抑制导致的黑素体积累的增加。A和B:蛋白免疫印迹分析。C:在ATG7表达抑制细胞中的黑色素积累。
[图6]由自噬相关因子的表达抑制导致的黑素体积累的增加。
[图7]由自噬相关因子的表达抑制导致的黑素体积累的增加。
[图8]自噬抑制因子mTOR的表达抑制对自噬以及黑素体积累产生的影响。A:蛋白免疫印迹分析。B:基于蛋白免疫印迹的结果的定量分析;数据为平均±SD(各N=3),**,p<0.01;*,p<0.05(方差分析,Holm检验)。
[图9]自噬调节对角质形成细胞的黑色素含量的影响。在自噬诱导剂存在下培养后的培养物的照片(A)和蛋白免疫印迹分析(B)。在自噬阻碍剂存在下培养后的培养物的照片(C)和蛋白免疫印迹分析(D)。
[图10]与自噬调节剂一起培养的皮肤的明度(L*值);数据为平均±SD(各N=3),**,p<0.01;*,p<0.05(方差分析,Holm检验)。
[图11]通过本发明的选择方法选择的黑色素量调节剂所产生的皮肤颜色控制。A:黑色素量、B:细胞呼吸活性。
具体实施方式
本发明涉及与角质形成细胞中的黑色素量调节、以及皮肤或者毛发颜色控制相关的因子。另外,本发明涉及使用该因子调节角质形成细胞中的黑色素量的方法、控制皮肤或者毛发颜色的方法,以及使用该因子评价或选择角质形成细胞中的黑色素量调节剂、或者皮肤或毛发颜色控制剂的方法。
本发明者们探讨了角质形成细胞内的黑色素量调节相关的因子,结果确认了自噬活性与角质形成细胞中的黑色素量有关,以及自噬活性和皮肤颜色之间有高的相关性。由这些结果,本发明者们发现:如果利用自噬活性,则可以控制角质形成细胞的黑色素量、或者皮肤或毛发颜色。
通过本发明,可以调节角质形成细胞内的黑色素的量,从而控制皮肤或者毛发颜色。另外,通过本发明,由于以自噬活性作为指标可以评价或者选择能够控制皮肤或者毛发颜色的原料,因此,能够开发皮肤或毛发颜色控制剂,例如,美白剂、助晒剂(tanningagent)、毛发染色或者漂色剂、乌发剂等。
在本说明书中,“自噬活性”是指自噬过程的各步骤,例如,吞噬泡的产生、吞噬泡的伸长或者成长、自噬体的形成、自噬体和溶酶体的融合、自噬性溶酶体的形成、自噬性溶酶体内部中的物质的分解等的活动。
自噬活性例如在自噬相关基因或者由该基因编码的分子的表达或者活性中反映,通过检测或者确定这些的表达或者活性可以测定。自噬相关基因或者由其编码的分子的表达或者活性可以通过本领域中通常使用的任意的分析方法进行测定。作为基因表达分析方法,例如可以列举斑点印迹法、Northern印迹法、RNA酶保护试验法、通过荧光素酶等的报告基因试验、RT-PCR法、DNA微阵列(DNAmicroarray)等。作为由基因编码的蛋白质的表达或者活性的分析方法或者定量的方法,可以列举蛋白免疫印迹法、免疫染色法、荧光染色法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、结合实验(bindingassay)等。
在本说明书中,“自噬相关基因”可以是编码参与自噬过程的各步骤,例如,吞噬泡的产生、吞噬泡的伸长或者成长、自噬体的形成、自噬体和溶酶体的融合、自噬性溶酶体的形成、自噬性溶酶体内部中的物质的分解等的蛋白质的基因。另外,在本说明书中,作为“由自噬相关基因编码的分子”可以列举参与上述自噬过程的各步骤的基因所编码的蛋白质以及mRNA。
例如,在哺乳类的自噬中,作为参与吞噬泡的产生的分子,可以列举ATG1(或者ULK1或者ULK2)、ATG13、ATG17、ATG29、ATG31、ATG101、FIP200、VPS34、VPS15(或者p150)、ATG6(或者VPS30或者Beclin1)、ATG14、Ambra1、ATG2、ATG9、ATG18(或者WIPI1-4)、DFVP1、VMP1等。其中,认为ATG1(或者ULK1或ULK2)、ATG13、ATG17、ATG29、ATG31、ATG101、FIP200作为ULK/Atg1复合物(complex)参与吞噬泡初期形成(非特許文献16)。另一方面,VPS34、VPS15、ATG6、ATG14、Ambra1作为ClassIIIPI3-激酶复合物主要在小胞体上生成PI(3)P(磷脂酰肌醇3-磷酸)(非专利文献16)。
作为参与吞噬泡的成长和自噬体的形成的分子,可以列举ATG5、ATG7、ATG10、ATG12、ATG16(或者ATG16L1)、ATG3、ATG4(或者ATG4A-D)、ATG8(或者LC3、GATE-16或者GABARAP)、p62等。其中,ATG5、ATG7、ATG10、ATG12、ATG16形成Atg12-共轭体系(conjugationsystem)。该体系被认为存在于吞噬泡的外侧并且在吞噬泡伸长中重要(非专利文献16)。LC3、ATG3、ATG4、ATG7形成LC3/Atg8-共轭体系。该体系被认为参与吞噬泡的伸长和膜的封闭(非专利文献16)。LC-3是酵母Atg8的哺乳类同系物,并且存在LC3-I和LC3-II的形态。其中LC3-II在细胞质局部存在型的LC3-I上共有结合了磷脂酰乙醇胺,由此局部存在于自噬体膜上。由于LC3-II量与自噬体数呈比例,因此,作为自噬的指标而为人所知(非专利文献17)。例如,通过添加羟氯喹等的自噬阻碍剂、E-64-D或者胃蛋白酶抑制剂A等的蛋白质分解阻碍剂测定LC3-II蛋白质的积累量,从而可以定量地评价自噬活性。或者,通过在每个样品中检测LC3-II的蛋白质量,并与p62等其它已知的自噬的标记组合,可以评价自噬活性(非专利文献17)。p62局部存在于自噬体形成部位,并且是与LC3相互作用的蛋白质,具有将自噬的目标蛋白质募集到自噬体中的功能。另外,p62和Nbr1一起作为自噬选择性基质而为人所知(非专利文献18)。
作为参与自噬体和溶酶体的融合的分子,可以列举UVRAG(或者VPS38)或RAB7等。UVRAG作为促进自噬体和溶酶体的融合过程的分子而为人所知。
在本说明书中,“自噬相关基因或者由该基因编码的分子”优选不包括选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B中的基因以及由该基因编码的分子。
将“自噬相关基因或者由该基因编码的分子”的例子示于下述表1中。这些是在公知的数据库中登记的基因和蛋白质。但是,以前不知道这些基因和分子参与角质形成细胞内的黑色素动态。
[表1]
在本说明书中,自噬相关基因或者由该基因编码的分子可以包含它们的同系物。例如,在本发明中,可以替代表1的基因或者蛋白质而使用这些的同系物。在本说明书中,将与某个基因或者蛋白质序列同一性高且具有同等的功能、优选为进化的起源相同的基因或者蛋白质称为该基因或者蛋白质的“同系物”。例如,与某个自噬相关基因在碱基序列中60%以上、优选为80%以上相同,并且编码参与自噬过程的各步骤,例如吞噬泡的产生、吞噬泡的伸长或者成长、自噬体的形成、自噬体和溶酶体的融合、自噬性溶酶体的形成、自噬性溶酶体内部的物质的分解等的蛋白质且优选为在进化上来自于相同的起源的基因是该自噬相关基因的同系物。另外,例如,由上述自噬相关基因的同系物基因编码、并且参与该自噬相关基因编码的蛋白质参与的自噬过程的步骤的蛋白质是由该自噬相关基因编码的蛋白质的同系物。
在本说明书中,有关氨基酸序列或者碱基序列的“同一性”是指将2个氨基酸序列或者碱基序列排列(比对)时两个序列中存在相同的氨基酸残基或者碱基的位置数相对于全长氨基酸残基或者碱基数的比例(%)。具体而言,是指根据Lipman-Pearson法(Science,227,1435,1985)计算,使用遗传信息处理软件Genetyx-Win(版本5.1.1,软件开发)的同源性分析(Searchhomology)程序,将Unitsizetocompare(ktup)设为2进行分析由此算出的值。
在本发明中,自噬相关基因或者由该基因编码的分子可以使用至少1个。换而言之,该基因或者分子可以分别单独使用,也可以组合任意的2種以上使用。例如,本发明中使用的自噬相关基因或者该基因可以是选自表1中列举的基因或者由其编码的mRNA或蛋白质中的自噬相关基因或者由该基因编码的分子中的至少1种。更详细而言,在本发明中,表1中列举的基因或者由其编码的mRNA或蛋白质可以分别单独使用,或者也可以使用任意2种以上的该基因的组合,也可以使用任意2种以上的由该基因编码的mRNA的组合,也可以使用任意2种以上的由该基因编码的蛋白质的组合,或者也可以使用来自这些基因、mRNA以及蛋白质的任意2种以上的组合。
如后述实施例所例示的,来自具有亮色的皮肤的人种的皮肤的角质形成细胞中的自噬活性比来自具有暗色的皮肤的人种的皮肤的角质形成细胞的高(图2~4)。另外,如后述实施例所例示的,通过自噬相关蛋白质ATG7、ATG13、ATG5、RAB11A和UVRAG的表达阻碍,抑制了被角质形成细胞获取后的黑素体的分解(图5~8),另一方面,通过自噬诱导剂和阻碍剂,培养皮肤模型发生亮色化和暗色化(图9~10)。即,显示出自噬活性有助于角质形成细胞内的黑色素量的调节或皮肤和毛发颜色的控制。
黑色素在角质形成细胞内的动态,例如,从黑素细胞传送的黑色素的获取、输送、局部存在、积累、排出、分解等主要与由角质形成细胞构成的皮肤表皮层或毛囊的毛母质细胞或者构成毛干的毛皮质细胞中的黑色素的量以及分布密切相关,进一步,对皮肤和毛发的颜色产生影响。
通过改变角质形成细胞中的自噬活性,可以调节角质形成细胞中的黑色素量,从而可以调节皮肤表皮层或毛囊的毛母质细胞或进一步构成毛干的毛皮质细胞中的黑色素量以及分布,其结果,可以控制皮肤和毛发的颜色。
例如,角质形成细胞中的自噬活性降低会增加该角质形成细胞中的黑色素量并使细胞的颜色暗色化。相反地,通过增强角质形成细胞中的自噬活性,该角质形成细胞的黑色素量降低,细胞的颜色亮色化。因此,通过增强角质形成细胞中的自噬活性,皮肤和毛发的颜色变得明亮。相反地,通过降低角质形成细胞中的自噬活性,皮肤和毛发的颜色变暗。
作为改变细胞的自噬活性的方法的一个例子,可以列举改变该细胞中的上述的自噬相关基因或者由该基因编码的分子的表达或者活性的方法。
例如,在角质形成细胞中上述自噬相关基因以及由其编码的分子中,参与自噬活化的基因以及分子的表达降低会降低自噬活性,因此,增加角质形成细胞中的黑色素量,使细胞的颜色暗色化。相反地,通过这些基因和分子的表达增加,增强自噬活性,因此,角质形成细胞的黑色素量降低,细胞的颜色亮色化。
因此,通过增加角质形成细胞中参与自噬活化的基因或者分子的表达或者活性,皮肤和毛发的颜色变亮。相反地,通过降低该基因或者分子的表达或者活性,皮肤和毛发的颜色变暗。
另外,例如角质形成细胞中的上述自噬相关基因以及由其编码的分子中,由于参与自噬活性抑制的基因和分子的表达增加会降低自噬活性,因此,增加角质形成细胞中的黑色素量,使细胞的颜色暗色化。相反地,通过降低这些基因和分子的表达,从而增强自噬活性,因此,角质形成细胞的黑色素量降低,细胞的颜色亮色化。
因此,通过降低角质形成细胞中参与自噬活性抑制的基因或者分子的表达或者活性,皮肤和毛发的颜色变亮。相反地,通过增加该基因或者分子的表达或者活性,皮肤和毛发的颜色变暗。
参与自噬活化的基因、参与自噬活性抑制的基因、以及由这些基因编码的分子可以通过用通常的手段来调查基因或者分子的表达对自噬活性产生的影响来鉴定。
例如,通过将作用机理未知的自噬诱导剂或者自噬阻碍剂给药,确定使自噬活性亢进或者降低时表达发生变化的基因或者分子,调查过表达或者抑制表达这些基因或者分子时的自噬活性的变化,从而可以鉴定参与自噬的活化或者活性抑制的基因或者分子。或者,在与自噬的关联为已知的基因或者分子的情况下,也可以仅调查过表达或者抑制表达这些基因或者分子时的自噬活性的变化。
例如,在后述的实施例中使用的LC3(例如,LC3-I和LC3-II)、p62、COX-IV,以及ATG5、ATG13、RAB11A、UVRAG基因以及由其编码的mRNA或蛋白质是参与自噬的活化或者活性抑制的基因和分子的例子。另外,上述表1中列举的基因或者蛋白质、或者它们的同系物也是参与自噬的活化或者活性抑制的基因和分子的例子。
通过改变上述自噬相关基因或者由该基因编码的分子的表达或者活性,可以调节角质形成细胞中的黑色素量,并控制皮肤或者毛发的颜色。换而言之,上述自噬相关基因或者由该基因编码的分子可以用于角质形成细胞中黑色素量调节或者用于皮肤或者毛发颜色控制。或者,上述自噬相关基因或者由该基因编码的分子也可以用于角质形成细胞中黑色素量调节或者在制造用于皮肤或者毛发颜色控制的制剂中使用。
自噬相关基因或者由该基因编码的分子的表达或者活性可以通过在该领域中通常使用的任意的手段来改变。作为改变该基因的表达、或者该分子的表达或者活性的手段,例如,作为改变基因表达的手段,可以列举通过反义寡核苷酸或者siRNA等的基因抑制(geneknockdown)、通过特异的启动子的目标基因的转录活化、使用了载体的来自外部的基因的导入、添加具有改变其它基因的表达的作用的任意的物质等。其中,优选添加具有改变该基因的表达的作用的任意的物质。
作为用于导入基因的载体的例子,作为培养细胞用的载体可以列举编入了CMV启动子或者EF1α启动子的各种基因表达载体,作为培养细胞和组织用的载体可以列举腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。使用了这些载体的基因导入的顺序为本领域技术人员所熟知。例如,使用慢病毒载体向皮肤中导入基因的顺序在GeneTher.2007Apr,14(8):648-56中有记载。另外,市售有利用这些载体的基因导入用试剂盒。通过将编入了自噬相关基因的上述载体导入到细胞中,可以使该细胞内自噬相关基因过表达,改变自噬活性。
通过siRNA的基因抑制是基于RNA干扰(RNAi)的机理,序列特异地诱导mRNA分解从而特异地阻碍目标基因的表达的方法。siRNA也被用于在包括哺乳类的各种生物的体内基因抑制中(例如,参照Songetal.,NatureMedicine,2003,9:347-351;McCafferyetal.,Nature,2002,418:38-39;Lewisetal.,NatureGenetics,2002,32:107-108;Xiaetal.,NatureBiotech.,2002,20:1006-1010等)。可以购买目标特异地合成的siRNA,而且siRNA转染用的试剂盒由QUIAGEN、TAKARABIOINC.等的很多同行售卖。
作为上述由自噬相关基因编码的分子,可以列举由该基因编码的mRNA和多肽。在此,“分子的表达或者活性的变化”是指改变分子整体中的表达或者活性的任意的状态,例如,可以包括分子的表达量的变化、分子的分解速度的变化、分子的活化率的变化、分子的失活率的变化等,不过优选为分子的表达量的变化。作为改变分子的表达或者活性的手段,可以列举改变上述的基因表达的手段、改变蛋白质表达的手段、改变分子的酶活性等的手段、改变分子和其目标因子的相互作用的手段、改变分子产生作用的信号路径的手段等。其中,优选改变基因表达的手段、改变蛋白质表达的手段等。
作为改变自噬活性的手段的其它的例子,可以列举自噬诱导剂或者自噬阻碍剂的给药等。作为公知的自噬诱导剂,可以列举以雷帕霉素为代表的mTOR信号阻碍剂、氟司必林、三氟拉嗪、哌迷清、尼卡地平、尼古地平、洛哌丁胺、胺碘酮、维拉帕米、米诺地尔、可乐定、PP242、或者MG-132等的蛋白酶体阻碍剂等。作为公知的自噬阻碍剂,可以列举羟氯喹、氯喹、巴佛洛霉素A1、作为PI3激酶阻碍剂的3-甲基腺嘌呤或渥曼青霉素(Wortmannin)等。
作为改变自噬活性的手段的另外其它的例子,可以列举将上述自噬诱导或者阻碍剂的目标因子活化或者抑制、以及将影响上述表1记载的自噬相关基因或者由该基因编码的分子的表达的因子活化或者抑制。例如,上述自噬诱导剂雷帕霉素抑制细胞蛋白质mTOR的活性。mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶向基因,mammaliantargetofrapamycin)是作为雷帕霉素靶发现的蛋白质,并且是参与细胞内信号传递的蛋白质激酶(丝氨酸-苏氨酸激酶)的一种。已知mTOR还具有抑制自噬诱导的作用(NatGenet.2004Jun;36(6):585-95)。如后述的实施例8所示,通过抑制mTOR,细胞的自噬作用活性上升,并且黑色素量減少。
在本发明中,作为改变自噬活性的被检验体,可以列举天然或者基因工程学地改变了的具有表达上述基因中的至少一种的能力并且希望调节黑色素量的角质形成细胞、以及含有其的培养物、组织、器官以及动物。作为上述角质形成细胞,优选为存在于皮肤或毛囊中的角质形成细胞,进一步优选为表皮角质形成细胞、毛母质细胞和毛皮质细胞。作为包含上述角质形成细胞的培养物、组织、器官,优选为培养角质形成细胞、以及表皮组织、毛囊组织、皮肤及其培养物。作为上述动物,优选为人或者非人哺乳动物,作为非人哺乳动物,可以列举狗、猫、兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猪、马等。
在一个实施方式中,通过上述本发明的黑色素量调节、或者皮肤或者毛发颜色控制可以以上述角质形成细胞、或者含有其的培养物、组织或者器官作为被检验体来进行。优选被检验体为培养角质形成细胞、培养皮肤组织、培养表皮、或者培养毛囊。在其它的一个实施方式中,通过上述本发明的黑色素量调节、或者皮肤或者毛发颜色控制中,希望调节角质形成细胞的黑色素量、或者希望控制皮肤或者毛发颜色的动物可以是被检验体。
另外,在其它的一个实施方式中,该黑色素量调节或者皮肤或者毛发颜色控制可以以美容目的或者审美的目的,例如,根据皮肤的美白或者晒黑、毛发的染色(亮色化或者暗色化)或者漂色、漂色后的颜色复原、乌发等的目的,优选由全身美容师、美容师、理发美容师、宠物美容师等非医疗从业人员非治疗性地进行。在本说明书中,“非治疗性”是不包括医疗行为,即不包括通过治疗对人体进行的处置行为的概念。
本发明所例示的实施方式为一种角质形成细胞中黑色素量的增加方法,其包括通过抑制希望黑色素量增加的角质形成细胞中自噬活性,来增加该角质形成细胞中的黑色素量的工序。
本发明的其它例示的实施方式为一种角质形成细胞中黑色素量的降低方法,其包括通过增强希望黑色素量降低的角质形成细胞中的自噬活性来减少该角质形成细胞中的黑色素量的工序。
该方式的一个实施方式为一种角质形成细胞中黑色素量的增加方法,其包括通过抑制希望黑色素量增加的角质形成细胞中参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性来增加该角质形成细胞中的黑色素量的工序。
其它的实施方式为一种角质形成细胞中黑色素量的降低方法,其包括通过增强希望黑色素量降低的角质形成细胞中参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性来降低该角质形成细胞中的黑色素量的工序。
另外,其它的实施方式为一种角质形成细胞中黑色素量的增加方法,其包括通过增强希望黑色素量增加的角质形成细胞中参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性来增加该角质形成细胞中的黑色素量的工序。
另外,其它的实施方式为一种角质形成细胞中黑色素量的降低方法,其包括通过抑制希望黑色素量降低的角质形成细胞中参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性来降低该角质形成细胞中的黑色素量的工序。
本发明的其它例示的实施方式为一种使被检验体的皮肤颜色褐色化或者暗色化的方法,其包括通过抑制希望皮肤颜色褐色化或者暗色化的被检验体的皮肤角质形成细胞中的自噬活性来增加该角质形成细胞中的黑色素量的工序。通过该方法,例如,可以将皮肤晒成褐色。
本发明的其它例示的实施方式为一种使被检验体的皮肤颜色亮色化的方法,其包括通过增强希望皮肤颜色亮色化的被检验体的皮肤角质形成细胞中的自噬活性,从而减少该角质形成细胞中的黑色素量的工序。通过该方法,例如,可以皮肤美白。
该方式的一个实施方式为一种使被检验体的皮肤颜色褐色化或者暗色化的方法,其包括通过抑制希望皮肤颜色褐色化或者暗色化的被检验体的皮肤角质形成细胞中参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性来增加该角质形成细胞中的黑色素量的工序。通过该方法,例如,可以将皮肤晒成褐色。
其它的实施方式为一种使被检验体的皮肤颜色亮色化的方法,其包括通过增强希望皮肤颜色亮色化的被检验体的皮肤角质形成细胞中参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性来减少该角质形成细胞中的黑色素量的工序。通过该方法,例如可以皮肤美白。
另外,其它的实施方式为一种使被检验体的皮肤颜色褐色化或者暗色化的方法,其包括通过增强希望皮肤颜色褐色化或者暗色化的被检验体的皮肤角质形成细胞中参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性来增加该角质形成细胞中的黑色素量的工序。通过该方法,例如可以将皮肤晒成褐色。
另外,其它的实施方式为一种使被检验体的皮肤颜色亮色化的方法,其包括通过抑制希望皮肤颜色亮色化的被检验体的皮肤角质形成细胞中参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性来减少该角质形成细胞中的黑色素量的工序。通过该方法,例如可以皮肤美白。
本发明的进一步其它例示的实施方式为使被检验体的毛发颜色褐色化或者暗色化的方法,其包括通过抑制希望毛发颜色褐色化或者暗色化的被检验体的毛囊角质形成细胞中的自噬活性来增加该角质形成细胞中的黑色素量的工序。通过该方法,例如,漂白后的毛发的颜色恢复或者乌发成为可能。
本发明的其它的例示的实施方式为一种使被检验体的毛发颜色亮色化的方法,其包括通过增强希望毛发颜色亮色化的被检验体的毛囊角质形成细胞中的自噬活性来减少该角质形成细胞中的黑色素量的工序。通过该方法,例如毛发的亮化或者漂色成为可能。
该方式的一个实施方式为一种使被检验体的毛发颜色褐色化或者暗色化的方法,其包括通过抑制希望毛发颜色褐色化或者暗色化的被检验体的毛囊角质形成细胞中参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性来增加该角质形成细胞中的黑色素量的工序。通过该方法,例如,漂色后的毛发的颜色恢复或者乌发成为可能。
其它的实施方式为一种使被检验体的毛发颜色亮色化的方法,其包括通过增强希望毛发颜色亮色化的被检验体的毛囊角质形成细胞中参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性来减少该角质形成细胞中的黑色素量的工序。通过该方法,例如,毛发的亮化或者漂色成为可能。
另外,其它的实施方式为一种使被检验体的毛发颜色褐色化或者暗色化的方法,其包括通过增强希望毛发颜色褐色化或者暗色化的被检验体的毛囊角质形成细胞中参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性,来增加该角质形成细胞中的黑色素量的工序。通过该方法,例如,漂色后的毛发的颜色恢复或者乌发成为可能。
另外,其它实施方式为一种使被检验体的毛发颜色亮色化的方法,其包括通过抑制希望毛发颜色亮色化的被检验体的毛囊角质形成细胞中参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性,来减少该角质形成细胞中的黑色素量的工序。通过该方法,例如,毛发的亮化或者漂色成为可能。
改变自噬活性的物质为能够调节角质形成细胞中黑色素量并控制皮肤或者毛发的颜色的物质。因此,本发明还提供利用了自噬活性的物质的角质形成细胞的黑色素量调节作用或者皮肤或毛发颜色控制作用的评价方法、以及角质形成细胞的黑色素量调节剂、或者皮肤或毛发颜色控制剂的评价或者选择方法。
通过本发明的角质形成细胞中黑色素量调节剂的评价或者选择方法包括:对细胞将被检验物质给药的工程;测定该细胞中的自噬活性的变化的工序;以及,基于该测定的结果,评价该被检验物质的黑色素量调节作用的工序。
将被检验物质给药的细胞只要具有自噬活性,可以是天然的细胞或者也可以是基因工程学地改变后的细胞,优选为培养细胞、或者来自动物的组织或者器官培养物的细胞,更优选为培养人细胞。另外,优选细胞为皮肤细胞,进一步优选为表皮细胞或者毛囊细胞,更加优选为角质形成细胞。作为优选的细胞的具体例子,为来自人的培养表皮细胞(例如,人正常表皮细胞(NormalHumanEpidermalKeratinocyte;NHEK)、或者人组织培养毛囊细胞。
被检验物质的种类可以是天然物也可以是合成物,另外,可以是单一物质也可以是组合物或者混合物。给药的方式依赖于被检验物质,可以是任意的方式。
自噬活性例如可以通过调查自噬相关基因或者由该基因编码的分子的表达或者活性、或者在该分子的细胞内的量来测定。该基因或者由其编码的分子的表达或者活性、或者在该分子的细胞内的量可以通过该领域中通常使用的任意的分析方法来测定。作为基因表达分析方法,例如可以列举斑点印迹法、Northern印迹法、RNA酶保护试验法、通过荧光素酶等的报告基因试验、RT-PCR法、DNA微阵列等。作为由基因编码的蛋白质的表达或者活性的分析方法、或者定量的方法,可以列举蛋白免疫印迹法、免疫染色法、荧光染色法、ELISA、结合测定等。
基于测定的自噬活性,可以评价由被检验物质的给药产生的自噬活性的变化。例如,可以在被检验物质的给药前后测定自噬活性,并根据需要将测定值定量化之后,比较给药前后的结果。另外,例如可以在测定被检验物质的给药组、非给药组或者对照物质给药组的自噬作用活性,并根据需要定量测定值之后,在给药组和非给药组、或者给药组和对照物质给药组之间比较结果。进一步,还可以将不同浓度的被检验物质给药测定自噬活性,调查由被检验物质的浓度产生的测定结果的差异。
基于上述自噬活性的测定结果,可以评价被检验物质的角质形成细胞中黑色素量的调节作用。被评价为对自噬活性产生影响的被检验物质被判断为具有角质形成细胞中黑色素量的调节作用的物质,或者可以被选择为能够用于角质形成细胞中黑色素量的调节的角质形成细胞中黑色素量调节剂。因此,本发明中的黑色素量调节剂的评价或者选择方法可以进一步包括基于被检验物质的评价结果选择该被检验物质作为角质形成细胞中黑色素量调节剂的工序。
例如,抑制自噬活性的物质被选择作为角质形成细胞中黑色素量增加剂。作为这样的物质,可以列举抑制参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的物质、以及增强参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的物质。该制剂可以作为增加角质形成细胞中的黑色素量使皮肤或者毛发颜色褐色化或者暗色化的皮肤或者毛发颜色的褐色化或者暗色化剂(例如,皮肤助晒剂、毛发暗色化剂、漂色后的毛发的颜色恢复剂、乌发剂等)来使用。
另一方面,增强自噬活性的物质被选择作为角质形成细胞中黑色素量降低剂。作为这样的物质,可以列举增强参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的物质、以及抑制参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的物质。该制剂可以作为减少角质形成细胞中的黑色素量使皮肤或者毛发颜色亮色化的皮肤或者毛发颜色的亮色化剂(例如,皮肤美白剂、毛发的亮化或者漂色剂等)使用。
本发明还提供皮肤或者毛发颜色控制剂的选择方法。该方法包括:对细胞将被检验物质给药的工程;测定该细胞中的自噬活性的变化的工程;以及基于该测定的结果,评价该被检验物质的皮肤或者毛发颜色控制作用的工程。该方法中使用的细胞、被检验物质、基因或者分子的表达或者活性的测定方法、以及该测定结果的评价方法与上述相同。
基于上述自噬活性的测定结果,可以评价被检验物质的皮肤或者毛发颜色控制作用。被评价为对自噬活性产生影响的被检验物质被判断为具有皮肤或者毛发颜色控制作用的物质,或者可以被选择作为能够用于皮肤或者毛发颜色的控制的皮肤或者毛发颜色控制剂。因此,本发明中的皮肤或者毛发颜色控制剂的评价或者选择方法可以进一步包括基于被检验物质的评价结果,选择该被检验物质作为皮肤或者毛发颜色控制剂的工序。
例如,抑制自噬活性的物质可以被选择作为增加角质形成细胞中的黑色素量从而使皮肤或者毛发颜色褐色化或者暗色化的皮肤或者毛发颜色的褐色化或者暗色化剂(例如,皮肤助晒剂、毛发暗色化剂、漂色后的毛发的颜色恢复剂、乌发剂等)。作为这样的物质,可以列举抑制参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的物质、以及增强参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的物质。
另一方面,增强自噬活性的物质可以被选择作为减少角质形成细胞中的黑色素量从而使皮肤或者毛发颜色亮色化的皮肤或者毛发颜色的亮色化剂(例如,皮肤美白剂、毛发的亮化或者漂色剂等)。作为这样的物质,可以列举增强参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的物质、以及抑制参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的物质。
作为本发明的例示的实施方式,进一步在本说明书中公开了以下的组合物、方法、或者用途。但是,本发明不限定于这些的实施方式。
<1>一种角质形成细胞中黑色素量调节剂的评价或者选择方法,其中,包括下述工序,
对细胞将被检验物质给药的工序;
测定该细胞中的自噬活性的变化的工序;以及,
基于该测定的结果,评价该被检验物质的黑色素量调节作用的工序。
<2>一种评价被检验物质的角质形成细胞中黑色素量调节作用的方法,其中,包括下述工序,
对细胞将被检验物质给药的工序;
测定该细胞中的自噬活性的变化的工序;以及
基于该测定的结果,评价该被检验物质的角质形成细胞中黑色素量调节作用的工序。
<3>如<1>或<2>所述的方法,其中,进一步包括基于上述评价的结果,选择上述被检验物质作为角质形成细胞中黑色素量调节剂的工序。
<4>如<1>~<3>中任一项所述的方法,其中,在以下的情况下,上述被检验物质被评价为具有增加角质形成细胞中的黑色素量的作用,
(i)抑制了参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;或者
(ii)增强了参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况。
<5>如<1>~<3>中任一项所述的方法,其中,在以下的情况下,上述被检验物质被评价为具有降低角质形成细胞中的黑色素量的作用,
(i)增强了参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;或者
(ii)抑制了参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况。
<6>一种皮肤或者毛发颜色控制剂的评价或者选择方法,其中,包括下述工序,
对细胞将被检验物质给药的工序;
测定该细胞中的自噬活性的变化的工序;以及
基于该测定的结果,评价该被检验物质的皮肤或者毛发颜色控制作用的工序。
<7>一种评价被检验物质的皮肤或者毛发颜色控制作用的方法,其中,包括下述工序,
对细胞将被检验物质给药的工序;
测定该细胞中的自噬活性的变化的工序;以及
基于该测定的结果,评价该被检验物质的皮肤或者毛发颜色控制作用的工序。
<8>如<6>或者<7>所述的方法,其中,进一步包括基于上述评价的结果,选择上述被检验物质作为皮肤或者毛发颜色控制剂的工序。
<9>如<6>~<8>中任一项所述的方法,其中,在以下的情况下,上述被检验物质被评价为具有使皮肤或者毛发颜色暗色化的作用,
(i)抑制了参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;或者
(ii)增强了参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况。
<10>如<6>~<8>中任一项所述的方法,其中,在以下的情况下,上述被检验物质被评价为具有使皮肤或者毛发颜色亮色化的作用,
(i)增强了参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;或者
(ii)抑制了参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况。
<11>一种角质形成细胞中黑色素量的调节方法,其中,包括调节希望进行黑色素量调节的角质形成细胞中的自噬活性的工序。
<12>如<11>所述的方法,其中,上述调节自噬活性的工序为通过以下的工序增加角质形成细胞中的黑色素量的工序,
(i)抑制参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;或者
(ii)增强参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序。
<13>如<11>所述的方法,其中,上述调节自噬活性的工序为通过以下的工序减少角质形成细胞中的黑色素量的工序,
(i)增强参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;或者
(ii)抑制参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序。
<14>一种被检验体的皮肤或者毛发颜色控制方法,其中,包括调节希望进行皮肤或者毛发颜色控制的被检验体的角质形成细胞中的自噬活性的工序。
<15>如<14>所述的方法,其中,上述调节自噬活性的工序为通过以下的工序使皮肤颜色暗色化的工序,
(i)抑制参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;或者
(ii)增强参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序。
<16>如<14>所述的方法,其中,上述调节自噬活性的工序为通过以下的工序使皮肤颜色亮色化的工序,
(i)增强参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;或者
(ii)抑制参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序。
<17>如<15>或者<16>所述的方法,其中,角质形成细胞为皮肤角质形成细胞。
<18>如<14>所述的方法,其中,上述调节自噬活性的工序为通过以下的工序使毛发颜色暗色化的工序,
(i)抑制参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;或者
(ii)增强参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序。
<19>如<14>所述的方法,其中,上述调节自噬活性的工序为通过以下的工序使毛发颜色亮色化的工序,
(i)增强参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;或者
(ii)抑制参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序。
<20>如<18>或<19>所述的方法,其中,角质形成细胞为毛囊角质形成细胞。
<21>如<11>~<20>中任一项所述的方法,其中,所述方法为非治疗性方法。
<22>自噬相关基因或者由该基因编码的分子用于调节角质形成细胞中的黑色素量的用途。
<23>如<22>所述的用途,其中,所述用途是用于使黑色素量增加或者减少。
<24>自噬相关基因或者由该基因编码的分子用于控制皮肤或者毛发颜色的用途。
<25>如<24>所述的用途,其中,所述用途是用于使皮肤或者毛发颜色暗色化或者亮色化。
<26>如<22>~<25>中任一项所述的用途,其中,所述用途为非治疗性用途。
<27>用于调节角质形成细胞中的黑色素量的自噬相关基因或者由该基因编码的分子。
<28>如<27>所述的基因或者分子,其中,该基因或分子是用于黑色素量的增加或者减少。
<29>用于在皮肤或者毛发颜色的控制中使用的自噬相关基因或者由该基因编码的分子。
<30>如<29>所述的基因或者分子,其中,该基因或分子是用于皮肤或者毛发颜色的暗色化或者亮色化。
<31>如<1>~<21>中任一项所述的方法,其中,自噬活性选自吞噬泡的产生、吞噬泡的成长、自噬体的形成、自噬体和溶酶体的融合、自噬性溶酶体的形成、以及自噬性溶酶体内部的物质的分解。
<32>如<22>~<26>中任一项所述的用途,其中,自噬活性选自吞噬泡的产生、吞噬泡的成长、自噬体的形成、自噬体和溶酶体的融合、自噬性溶酶体的形成、以及自噬性溶酶体内部的物质的分解。
<33>如<27>~<30>中任一项所述的基因或者分子,其中,自噬相关基因为参与选自自噬中的吞噬泡的产生、吞噬泡的成长、自噬体的形成、自噬体和溶酶体的融合、自噬性溶酶体的形成、以及自噬性溶酶体内部的物质的分解中的步骤的基因。
实施例
以下,示出实施例进一步具体地说明本发明。
样品
(来自正常人新生儿***的角质形成细胞;NHEKs)
来自正常人新生儿***的角质形成细胞(NHEKs)由KURABO购得。将细胞以1×105细胞/孔的密度接种于6孔板上,在37℃、5%(v/v)CO2下培养24小时。培养基使用EpiLife培养基(KURABO)[添加10μg/ml胰岛素、0.1μg/mlhEGF、0.5μg/ml氢化可的松、50μg/ml庆大霉素、50ng/ml两性霉素B、以及0.4%(v/v)牛脑垂体提取物(bovinepituitaryextract;BPE)]。培养后,进一步在除去BPE和hEGF的培养基中培养24小时,用于以下的实验中。
(黑素体)
黑色素瘤MNT-1细胞由Dr.PiedGiorgioNatali(ReginaElena研究所,罗马,意大利)的好意提供。将MNT-1细胞在RPMI-1640培养基[添加10%(v/v)FBS以及10%(v/v)AIM-Vmedium]中培养,之后从该细胞中分离黑素体。
(来自新生儿***的角质形成细胞;NHEKs)
高加索裔美国人以及非裔美国人捐献者的新生儿***由NationalDiseaseResearchInterchange(费城)得到,按照Yoshidaetal(FASEBJ21:2829-2839,2007)中记载的方法调制NHEKs。即,通过对***进行分散酶处理来分离表皮和真皮,将表皮薄片在0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液中在37℃下处理10分钟来分离细胞,使用专用培养基,原代培养了NHEKs。
(三维培养人皮肤模型)
三维(3D)培养人皮肤模型(3D-humanskinsubstitutes,3D-HSSs)由MatTekCo.购得(MEL-300A或者B),根据产品指南,在EPI-100NMM-113medium(MatTekCo.)中在37℃、5%CO2下维持。
参考例1溶酶体结构在黑色素分解中的参与
培养NHEKs和来自MNT-1细胞的分离黑素体一起,在作为溶酶体阻碍剂的E-64-D以及胃蛋白酶抑制剂A(各20μg/ml)的存在下或者不存在下进行培养。24小时之后,用PBS清洗细胞,进一步在E-64-D以及胃蛋白酶抑制剂A(各20μg/ml)的存在下或者不存在下培养24小时。使用PBS清洗细胞,并用含有蛋白酶阻碍剂混合物(Roche)的RIPA缓冲液(Sigma-Aldrich)溶解,用超声波使之均质化,回收上清液,用SDS-聚丙烯酰胺电泳进行分离。将分离的样品转移到Sequi-Blot(注册商标)PVDF膜(Bio-Rad)上,进行通过对黑素体蛋白质Pmel-17特异的抗体(cloneHMB-45,DAKOInc.)的蛋白免疫印迹分析。
在蛋白免疫印迹中,将上述PVDF膜和Pmel-17特异性抗体(稀释2000倍)一起进行孵育,清洗,与2次抗体一起进行孵育。2次抗体使用了过氧化物酶标记抗小鼠IgG或者过氧化物酶标记抗兔IgG(稀释5000倍,GEHealthcareUKLtd.)。条带用ECLwesternblottingdetectionreagents(GEHealthcareUKLtd.)进行可视化。然后,用作为内参的经过负载的对β-肌动蛋白特异的抗体(Sigma-Aldrich)对膜进行再印迹杂交,将所负载的蛋白质量进行标准化。
对于一部分数据,求得蛋白免疫印迹分析中所得到的Pmel-17的各条带相对于β-肌动蛋白的条带的相对强度,将黑色素积累量定量化。
将结果示于图1中。通过添加溶酶体阻碍剂,在NHEKs中积累了黑素体。由该结果启示了溶酶体的活性参与NHEKs中的黑素体分解。
实施例1皮肤颜色不同的人种间的自噬相关因子的表达的差异
调查高加索裔美国人以及非裔美国人的来自新生儿***的角质形成细胞(NHEKs)中自噬相关因子ATG7或者ATG13的表达量。
NHEKs进行2天培养之后,以与参考例1同样的顺序进行通过ATG7特异性抗体(EpitomicsInc.)或者ATG13特异性抗体(MBLInternational)的蛋白免疫印迹分析。
将结果示于图2中。来自具有亮色的皮肤的高加索裔美国人的NHEKs相比于来自具有暗色的皮肤的非裔美国人的NHEKs,自噬相关因子的表达高。
实施例2皮肤颜色不同的人种间的自噬活性的差异
调查高加索裔美国人以及非裔美国人的来自新生儿***的角质形成细胞(NHEKs)中的自噬活性。
NHEKs在作为自噬阻碍剂的羟氯喹(HCQ,10μM)的存在下或者不存在下培养48小时,以与参考例1同样的顺序进行通过作为自噬的基质的p62特异性抗体(稀释2000倍,MBLInternational)或者LC3特异性抗体(稀释2000倍,MBLInternational或者CosmoBioCo.Ltd.)的蛋白免疫印迹分析。另外,作为LC3蛋白质,检测LC3-I和在LC3-I上附加有磷脂酰乙醇胺并且局部存在于自噬体上的LC3-II。求得蛋白免疫印迹的各条带相对于β-肌动蛋白的条带的相对强度,将自噬活性定量化。
将结果示于图3。结果显示在作为自噬阻碍剂的羟氯喹存在下,来自高加索裔美国人的NHEKs与来自非裔美国人的NHEKs相比,p62以及LC3-II的积累量多,具有高的自噬活性。
实施例3皮肤颜色不同人种间的黑素体获取后的自噬活性的差异
将高加索裔美国人以及非裔美国人的来自新生儿***的角质形成细胞(NHEKs)与来自MNT-1细胞的分离黑素体一起培养了0、4、8、24或48小时。将细胞用PBS清洗,以与参考例1同样的顺序进行通过LC3特异性抗体、或者COX-IV特异性抗体(AbcamInc.)的蛋白免疫印迹分析。将蛋白免疫印迹的各条带相对于β-肌动蛋白进行标准化,求得相对强度。
将结果示于图4。来自高加索裔美国人的NHEKs由于黑素体LC3-II量增加,另外,作为由自噬活性分解的标记之一而被已知的COX-IV量減少,因此,启示了自噬活性高,并且变得积极分解黑色素。另一方面,来自非裔美国人的NHEKs由于黑素体而LC3-II量减少,由于自噬活性被抑制,因此,启示了积极积累黑色素。由以上可以认为,角质形成细胞中的自噬活性与皮肤的黑色素量、以及皮肤颜色相关。
实施例4通过自噬相关因子的表达抑制导致的角质形成细胞中的黑素体积累的增加
对于NHEKs使用HiPerfectTransfectionReagent(QUIAGEN),按照产品手册转染了10nM的ATG7特异的siRNA、ATG13特异的siRNA、UVRAG特异的siRNA、或者非特异的siRNA(对照)。48小时后,添加来自MNT-1细胞的分离黑素体,培养了24小时。将培养物用PBS清洗,清洗没有被细胞获取的黑素体,进一步培养24小时之后,按照与参考例1同样的顺序通过ATG7特异的抗体(EpitomicsInc.)、LC3特异的抗体(CosmoBioCo.Ltd.或者MBLInternational)、p62特异的抗体(MBLInternational)或者作为黑素体蛋白质的对Pmel17特异的抗体(cloneHMB-45,DAKOInc.)进行蛋白免疫印迹分析。将结果示于图5A和B中。通过ATG7、ATG13和UVRAG的特异性表达阻碍,作为角质形成细胞中自噬的基质的p62积累,Pmel17的量显著地增加。
对NHEKs转染10nM的ATG7特异的siRNA或者非特异的siRNA(对照),和NHEMs一起培养7天时间。用PBS清洗细胞后干燥,用SolvableTM(PerkinElmer)使之溶解,通过吸光度计(MicroplateReaderModel550;Bio-RadLaboratories)测定黑色素量。将结果示于图5C中。通过ATG7表达阻碍,角质形成细胞和黑素细胞的共培养中的黑色素量增加。
这些结果启示了自噬有助于角质形成细胞中的黑素体分解。
实施例5通过自噬相关因子的表达抑制导致的角质形成细胞中黑素体积累的增加
对NHEKs使用HiPerfectTransfectionReagent(QUIAGEN),按照产品手册转染了100pM、1nM或者10nM的RAB11A特异的siRNA或者ATG7特异的siRNA、或者10nM的非特异的siRNA(对照)。48小时后,添加来自MNT-1细胞的分离黑素体,培养24小时。用PBS清洗培养物,清洗未被细胞获取的黑素体,进一步培养24小时之后,按照与参考例1同样的顺序,通过RAB11A特异的抗体(LifeTechnologies,Corp.)、ATG7特异的抗体(EpitomicsInc.)、或者Pmel17特异性抗体(cloneHMB-45,DAKOInc.)进行蛋白免疫印迹分析。
将结果示于图6中。Pmel17量依赖于RAB11A以及ATG7的siRNA浓度而增加。其结果启示了角质形成细胞的自噬活性水平与黑色素积累之间呈负相关。
实施例6通过自噬相关因子的表达抑制导致的角质形成细胞中黑素体积累的增加
对培养NHEKs,使用HiPerfectTransfectionReagent(QUIAGEN),按照产品手册转染了10nM的ATG5特异的siRNA、UVRAG特异的siRNA、或者非特异的siRNA(对照)。48小时后、添加来自MNT-1细胞的分离黑素体,培养了24小时。用PBS清洗培养物来清洗未被细胞获取的黑素体,进一步培养了24小时之后,按照与参考例1同样的顺序通过Pmel17特异的抗体(cloneHMB-45,DAKOInc.)进行了蛋白免疫印迹分析。
将结果示于图7中。通过ATG5或者UVRAG的特异性阻碍,Pmel17(clone;HMB45)的量显著增加。该结果启示了自噬相关因子有助于NHEKs中的黑素体分解。
实施例7通过自噬活化导致的角质形成细胞中黑素体积累的增加
调查作为自噬抑制因子的mTOR的抑制对黑色素积累产生的影响。对培养NHEKs,使用HiPerfectTransfectionReagent(QUIAGEN),按照产品手册转染了10nM的mTOR特异的siRNA或者非特异的siRNA(对照)。24小时后,添加来自MNT-1细胞的分离黑素体,培养了24小时。用PBS清洗培养物来清洗未被细胞获取的黑素体,进一步培养24小时之后,按照与参考例1同样的顺序通过LC3特异的抗体(CosmoBioCo.Ltd.或者MBLInternational)以及Pmel17特异的抗体(cloneHMB-45,DAKOInc.)进行了蛋白免疫印迹分析。将蛋白免疫印迹的各条带相对于β-肌动蛋白进行标准化,求得相对强度。
将结果示于图8中。由于作为自噬抑制因子的mTOR的特异性阻碍自噬活性亢进,因此,LC3-II量增加,Pmel17显著地降低。由该结果启示了mTOR通过自噬构造影响了黑色素积累量。
实施例8自噬调节对三维培养人皮肤模型(3D-HSSs)的黑色素含量的影响
3D-HSSs(三维人皮肤替代品,three-dimensionalhumanskinsubstitutes,包含NHEK以及NHEM的再构成表皮模型)和作为自噬诱导剂的维拉帕米(10μM)或者雷帕霉素(1μM)一起培养了14天时间。培养基每隔1天交换。培养之后,按照与参考例1同样的顺序通过p62特异的抗体(MBLInternational)以及LC3特异的抗体(CosmoBioCo.Ltd.或者MBLInternational)进行了蛋白免疫印迹分析。
另外,将3D-HSSs在内皮素-1以及SCF存在下和作为自噬阻碍剂的羟氯喹(HCQ,10μM)一起培养14天时间,进行了蛋白免疫印迹分析。
将结果示于图9中。通过自噬诱导剂,抑制了3D-HSSs的暗色化(图9A,培养14天之后)。另外,作为自噬活性的指标因子的LC3-II的量增加,并且通过自噬受到分解的基质蛋白质p62的量减少(图9B,培养6天之后)。另一方面,通过作为自噬阻碍剂的HCQ,3D-HSSs暗色化,并且p62的量增加(图9C、D)。
实施例9自噬调节对人皮肤颜色的影响
从非裔美国人采集皮肤组织,在自噬作用诱导剂维拉帕米(10μM)或者雷帕霉素(1μM)、或者自噬阻碍剂羟氯喹(HCQ,10μM)的存在下或者不存在下进行培养。培养8天之后,通过色差计(Colorimeter;cyberDERM公司)测定了培养皮肤的明度(L*値)。将结果示于图10中。和自噬诱导剂一起培养的皮肤的L*值上升(即,皮肤颜色变亮),而和自噬阻碍剂一起培养的皮肤的L*值降低(即,皮肤颜色变暗)。
实施例10黑色素量调节剂的评价或者选择
在培养NHEKs中添加试验物质培养了72小时。培养后,用PBS清洗细胞,用含有蛋白酶阻碍剂混合物(Roche)的RIPA缓冲液(Sigma-Aldrich)进行溶解,用超声波使之均匀回收上清液。对回収的上清液中的RAB11A或者ATG7量进行蛋白免疫印迹分析。对按照同样的顺序不添加试验物质培养的细胞(对照)测定RAB11A或者ATG7量。将与对照相比RAB11A或者ATG7的量抑制了30%以上的试验物质选择作为黑色素量增强剂的候选物质。其结果,15种的试验物质被选择作为候选物质。
调查选择的候选物质的黑色素量调节活性。仅向含有NHEK以及NHEM的3D-HSSs的上部(角质层侧)中添加上述选择的候选物质,培养14天时间。培养之后,通过用氢氧化钠(2N)水溶液将组织进行增溶,测定组织中的黑色素量。通过用Alamar-Blue法测定同样地添加候选物质并进行了培养的3D-HSSs的细胞呼吸活性,调查候选物质的细胞毒性。将对两种候选物质样品A和B的结果示于图11中。确认了候选物质具有黑色素量增强活性。另外,根据细胞呼吸活性的结果,确认了这些候选物质没有细胞毒性。
以上,说明了本发明的实施方式,不过这应该理解为不是意图将本发明限定于所说明的特定的实施方式。本领域技术人员清楚属于本发明的范围之内的各种其它的变更以及修改。
本说明书中所引用的文献和专利申请正如其在本说明书中完整地记载的那样被作为参考引用。
Claims (14)
1.一种角质形成细胞中黑色素量调节剂的评价或者选择方法,其中,
包括下述工序,
将被检验物质对细胞进行给药的工序;
测定该细胞中的自噬活性的变化的工序;以及
基于该测定的结果,评价该被检验物质的黑色素量调节作用的工序;
在以下的情况下,所述被检验物质被评价为具有使角质形成细胞中的黑色素量增加的作用,
(i)抑制了参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;或者
(ii)增强了参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;
所述参与自噬活化的基因或者由其编码的分子、以及所述参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子不包括选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B中的基因以及由该基因编码的分子。
2.一种角质形成细胞中黑色素量调节剂的评价或者选择方法,其中,
包括下述工序,
将被检验物质对细胞进行给药的工序;
测定该细胞中的自噬活性的变化的工序;以及
基于该测定的结果,评价该被检验物质的黑色素量调节作用的工序;
在以下的情况下,所述被检验物质被评价为具有使角质形成细胞中的黑色素量降低的作用,
(i)增强了参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;或者
(ii)抑制了参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;
所述参与自噬活化的基因或者由其编码的分子、以及所述参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子不包括选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B中的基因以及由该基因编码的分子。
3.一种皮肤颜色控制剂的评价或者选择方法,其中,
包括下述工序,
将被检验物质和黑素体对角质形成细胞进行给药的工序;
测定该角质形成细胞中的自噬活性的变化的工序;以及
基于该测定的结果,评价该被检验物质的皮肤颜色控制作用的工序;
在以下的情况下,所述被检验物质被评价为具有使皮肤颜色暗色化的作用,
(i)抑制了参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;或者
(ii)增强了参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;
所述参与自噬活化的基因或者由其编码的分子、以及所述参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子不包括选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B中的基因以及由该基因编码的分子。
4.一种皮肤颜色控制剂的评价或者选择方法,其中,
包括下述工序,
将被检验物质和黑素体对角质形成细胞进行给药的工序;
测定该角质形成细胞中的自噬活性的变化的工序;以及
基于该测定的结果,评价该被检验物质的皮肤颜色控制作用的工序;
在以下的情况下,所述被检验物质被评价为具有使皮肤颜色亮色化的作用,
(i)增强了参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;或者
(ii)抑制了参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;
所述参与自噬活化的基因或者由其编码的分子、以及所述参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子不包括选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B中的基因以及由该基因编码的分子。
5.一种毛发颜色控制剂的评价或者选择方法,其中,
包括下述工序,
将被检验物质对角质形成细胞进行给药的工序;
测定该角质形成细胞中的自噬活性的变化的工序;以及
基于该测定的结果,评价该被检验物质的毛发颜色控制作用的工序;
在以下的情况下,所述被检验物质被评价为具有使毛发颜色暗色化的作用,
(i)抑制了参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;或者
(ii)增强了参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;
所述参与自噬活化的基因或者由其编码的分子、以及所述参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子不包括选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B中的基因以及由该基因编码的分子。
6.一种毛发颜色控制剂的评价或者选择方法,其中,
包括下述工序,
将被检验物质对角质形成细胞进行给药的工序;
测定该角质形成细胞中的自噬活性的变化的工序;以及
基于该测定的结果,评价该被检验物质的毛发颜色控制作用的工序;
在以下的情况下,所述被检验物质被评价为具有使毛发颜色亮色化的作用,
(i)增强了参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;或者
(ii)抑制了参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的情况;
所述参与自噬活化的基因或者由其编码的分子、以及所述参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子不包括选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B中的基因以及由该基因编码的分子。
7.一种角质形成细胞中的黑色素量的非治疗性调节方法,其中,
包括调节希望黑色素量调节的角质形成细胞中的自噬活性的工序;
所述调节自噬活性的工序为通过以下的工序增加角质形成细胞中的黑色素量的工序,
(i)抑制参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;或者
(ii)增强参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;
所述参与自噬活化的基因或者由其编码的分子、以及所述参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子不包括选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B中的基因以及由该基因编码的分子。
8.一种角质形成细胞中的黑色素量的非治疗性调节方法,其中,
包括调节希望黑色素量调节的角质形成细胞中的自噬活性的工序;
所述调节自噬活性的工序为通过以下的工序减少角质形成细胞中的黑色素量的工序,
(i)增强参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;或者
(ii)抑制参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;
所述参与自噬活化的基因或者由其编码的分子、以及所述参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子不包括选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B中的基因以及由该基因编码的分子。
9.一种被检验体的皮肤颜色的非治疗性控制方法,其中,
包括通过调节希望皮肤颜色控制的被检验体的角质形成细胞中的自噬活性来调节黑色素量的工序;
所述调节自噬活性的工序为通过以下的工序使皮肤颜色暗色化的工序,
(i)抑制参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;或者
(ii)增强参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;
所述参与自噬活化的基因或者由其编码的分子、以及所述参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子不包括选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B中的基因以及由该基因编码的分子。
10.一种被检验体的皮肤颜色的非治疗性控制方法,其中,
包括通过调节希望皮肤颜色控制的被检验体的角质形成细胞中的自噬活性来调节黑色素量的工序;
所述调节自噬活性的工序为通过以下的工序使皮肤颜色亮色化的工序,
(i)增强参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;或者
(ii)抑制参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;
所述参与自噬活化的基因或者由其编码的分子、以及所述参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子不包括选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B中的基因以及由该基因编码的分子。
11.如权利要求9或10所述的方法,其中,
角质形成细胞为皮肤角质形成细胞。
12.一种被检验体的毛发颜色的非治疗性控制方法,其中,
包括通过调节希望毛发颜色控制的被检验体的角质形成细胞中的自噬活性来调节黑色素量的工序;
所述调节自噬活性的工序为通过以下的工序使毛发颜色暗色化的工序,
(i)抑制参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;或者
(ii)增强参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;
所述参与自噬活化的基因或者由其编码的分子、以及所述参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子不包括选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B中的基因以及由该基因编码的分子。
13.一种被检验体的毛发颜色的非治疗性控制方法,其中,
包括通过调节希望毛发颜色控制的被检验体的角质形成细胞中的自噬活性来调节黑色素量的工序;
所述调节自噬活性的工序为通过以下的工序使毛发颜色亮色化的工序,
(i)增强参与自噬活化的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;或者
(ii)抑制参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子的表达或者活性的工序;
所述参与自噬活化的基因或者由其编码的分子、以及所述参与自噬活性抑制的基因或者由其编码的分子不包括选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B中的基因以及由该基因编码的分子。
14.如权利要求12或13所述的方法,其中,
角质形成细胞为毛囊角质形成细胞。
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C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |