CN104254601A - 木质纤维素水解产物脱毒的方法 - Google Patents

木质纤维素水解产物脱毒的方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及对从木质纤维素生物质获得的水解产物进行脱毒的方法和从所述脱毒的水解产物生产乙醇的方法。本发明的方法提供了脱毒的水解产物，其中相对于所述起始水解产物，对发酵微生物有害的化合物的量显著降低，并且其中可发酵性糖损失量最小化。

Description

木质纤维素水解产物脱毒的方法
背景技术
许多工业产品通过在培养物中生长的微生物来生产。微生物生长可以由木质纤维素生物质所释放的可溶性糖分子来支持。木质纤维素生物质主要由纤维素(通过β-1,4-糖苷键相连的葡萄糖的聚合物)、半纤维素(由通过各种不同的不同的β连键和α连键相连的五碳(C5)糖和六碳(C6)糖构成的多糖)和木质素(由通过醚键或碳-碳键相连的苯丙烷单元构成的复杂聚合物)构成。在某些情况下，对木质纤维素生物质进行稀酸水解，在此期间半纤维素被水解成单体糖(液体流)，并且纤维素的晶体结构被破坏，便于将来的酶消化(固体纤维)。从纤维素和木质素固体分离出含有C5和C6糖的液体、即所谓的水解产物，并且其可以被发酵成各种产品，例如乙醇。然而，除了糖之外，水解产物还含有脂族酸、酯(乙酸酯)、酚物质(从木质素水解获得的不同化合物)和糖脱水的产物，包括呋喃醛类糠醛和5-羟甲基糠醛(5-HMF)。大多数这些化合物对微生物具有负面影响并且可以抑制发酵。在发酵之前将水解产物脱毒，是为了避免由水解产物中存在的有毒化合物引起的抑制而可以采取的一种措施。
已经试验了各种脱毒方法，其中超施碱石灰(alkaline overliming)是高效和高成本效益的。在超施石灰过程中，通常在高温下，通过添加适量氢氧化钙(石灰)，将水解产物的pH从约2的pH暂时提高到9至10之间的pH。在一段时间、通常为约30分钟后，通过添加酸将水解产物溶液的pH降低到适合于发酵微生物的pH。在所述脱毒过程中，呋喃醛被降解，并且酸(无机酸和有机酸)被中和。
超施石灰已被了解很长时间(Leonard和Hajny，1945,Ind.Eng.Chem.,37(4):390–395)，并且仍被当作是有效的脱毒方法。然而，所述方法的显著缺点是在脱毒期间发生可发酵性糖的相当大量的损失。参见例如Larsson等，1999,Appl.Biochem.Biotechnol.77-79:91-103。可发酵性糖的损失导致可发酵产物例如乙醇的总得率较低。此外，脱毒期间不溶性硫酸钙(石膏)的形成也是有问题的。参见例如Martinez等，2001,Biotechnol.Prog.17(2):287–293。石膏形成引起结垢和管线堵塞，这显著抬高了维护成本。为了克服与氢氧化钙相关的问题，已经尝试了将其他碱用于水解产物脱毒目的，并取得了不同程度的成功。参见例如Alriksson等，2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121-124:911-922。
因此，对于减少从木质纤维素生物质获得的水解产物中的发酵抑制剂和对所述水解产物进行脱毒的新的改进的方法，存在着需求。具体来说，对于经济上可行并且提供能够以高得率生产乙醇的脱毒的水解产物的脱毒方法，存在着需求。
发明概述
本公开源自于下述发现，即含镁碱(例如氢氧化镁、碳酸镁或氧化镁)可以有效地脱毒从木质纤维素生物质获得的水解产物(在本文中有时被称为“木质纤维素水解产物”)，并且所述脱毒过程产生最小的可发酵性糖损失。当在本文中使用时，术语“脱毒”是指从起始木质纤维素水解产物除去一种或多种对发酵微生物有害的化合物(在本文中被称为“毒素”)或使其失活，由此形成脱毒的水解产物的过程。当在本文中使用时，短语“脱毒的水解产物”是指与在本文中被称为“起始水解产物”的用含镁碱处理之前的水解产物中的毒素水平相比，含有较低毒素水平的水解产物。这样的毒素包括但不限于呋喃醛、脂族酸、酯和酚物质。
作为脱毒用碱，含镁碱与氢氧化钙相比提供了显著优点。例如，使用含镁碱脱毒与使用氢氧化钙脱毒相比，引起较少的糖损耗。此外，使用含镁碱脱毒不导致显著推高维护成本的引起结垢和管道堵塞的不溶性副产物的产生。
本公开的水解产物脱毒方法在燃料分子例如乙醇的生产中找到应用。当将水解产物用含镁碱处理历时足以移除或失活一种或多种毒素的时间时，得到的脱毒的木质纤维素水解产物可以被发酵微生物(例如产乙醇菌)更有效地发酵以生产发酵产物例如乙醇。在包含乙醇发酵的示例性实施方式中，由按照本公开生产的脱毒的水解产物产生的乙醇的量，与使用氢氧化钙脱毒的水解产物产生的乙醇量相当(参见实施例5)。
因此，总的来说，本公开提供了降低木质纤维素水解产物对发酵生物体的毒性的方法。在某些情况下，所述方法包括将起始水解产物的溶液(即起始水解产物溶液)与含镁碱(例如氢氧化镁、碳酸镁或氧化镁)在引起脱毒的水解产物的溶液(即脱毒的水解产物溶液)产生的条件下混合一段时间。本公开的方法提供了脱毒的水解产物，其中相对于起始水解产物，对发酵微生物有害的毒素的量被显著降低。同时，在脱毒过程中损失的可发酵性糖的量极少。
在某些实施方式中，本文公开的方法导致产生的脱毒的水解产物具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、至少95％或至少99％的存在于起始水解产物中的可发酵性糖，以及不超过70％、不超过60％、不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过20％或不超过10％的存在于起始水解产物中的呋喃醛。在特定实施方式中，本公开的脱毒方法提供的脱毒的水解产物具有(a)至少90％的存在于起始水解产物中的总可发酵性糖和不超过50％的存在于起始水解产物中的呋喃醛；(b)至少90％的存在于起始水解产物中的总可发酵性糖和不超过40％的存在于起始水解产物中的呋喃醛；(c)至少90％的存在于起始水解产物中的总可发酵性糖和不超过30％的存在于起始水解产物中的呋喃醛；(d)至少90％的存在于起始水解产物中的总可发酵性糖和不超过20％的存在于起始水解产物中的呋喃醛；(e)至少80％的存在于起始水解产物中的总可发酵性糖和不超过50％的存在于起始水解产物中的呋喃醛；(f)至少80％的存在于起始水解产物中的总可发酵性糖和不超过40％的存在于起始水解产物中的呋喃醛；(g)至少80％的存在于起始水解产物中的总可发酵性糖和不超过30％的存在于起始水解产物中的呋喃醛；或(h)至少80％的存在于起始水解产物中的总可发酵性糖和不超过20％的存在于起始水解产物中的呋喃醛。
生物质优选地为木质纤维质的，并且可以包括但不限于种子、谷粒、块茎、植物废料或食品加工或工业加工的副产物(例如茎秆)、玉米(包括玉米芯、秸秆等)、禾本科植物(包括例如印度草，例如黄假高粱(Sorghastrum nutans)，或柳枝稷例如稷属物种(Panicumspecies)如柳枝稷(Panicum virgatum))、木材(包括例如木片、加工废料)、纸张、纸浆和再生纸(包括例如报纸、打印纸等)。其他生物质材料包括但不限于马铃薯、大豆(例如油菜籽)、大麦、黑麦、燕麦(oat spelt)、小麦、甜菜和甘蔗渣。生物质的其他来源公开在第4.1节中，并且可用于本发明的方法中。
在脱毒之前，所述水解产物溶液中水解产物的个体化合物的浓度部分取决于获得所述水解产物的生物质和用于水解所述生物质的方法，以及水解条件。在某些实施方式中，所述起始水解产物溶液包含(a)浓度在30g/L至160g/L、40g/L至95g/L或50g/L至70g/L范围内的可发酵性糖；(b)浓度在0.5g/L至10g/L、2.5g/L至4g/L或1.5g/L至5g/L范围内的糠醛；(c)浓度在0.1g/L至5g/L、0.5g/L至2.5g/L或1g/L至2g/L范围内的5-HMF；(d)浓度在2g/L至17g/L或11g/L至16g/L范围内的乙酸；(e)浓度在0g/L至12g/L或4g/L至10g/L范围内的乳酸；(f)浓度在0g/L至2.5g/L范围内的其他脂族酸s(例如琥珀酸、甲酸、丁酸和乙酰丙酸)；和/或(g)浓度在0g/L至10g/L、0.5g/L至5g/L或1g/L至3g/L范围内的酚物质。
在脱毒之前，可以将所述起始水解产物溶液浓缩。例如，在生物质水解后，可以将水解产物溶液浓缩1.2倍、1.5倍、2倍、3倍或5倍。在特定实施方式中，将所述起始水解产物浓缩以任两个上述实施方式为边界的范围，例如浓缩1倍至3倍、1.5倍至3倍、3倍至5倍等的范围。
在各种实施方式中，木质纤维素水解产物溶液的脱毒可以在25℃至90℃范围内的温度下进行。脱毒过程可以在例如30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃下进行。在特定实施方式中，所述脱毒方法在以任两个上述温度为边界的范围内的温度下，例如在40℃至60℃、45℃至50℃、35℃至65℃等范围内的温度下进行。有利的是，所述脱毒过程在40℃至60℃范围内的温度下进行，这允许脱毒反应以商业上可行的速率发生，同时将可发酵性糖的损失降至最低，由此提高发酵产物(例如乙醇、生物化学品)的得率。
水解产物脱毒过程通常在6.2至9.5范围内的pH下进行。例如，脱毒可以在6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的pH下进行。在特定实施方式中，脱毒过程可以在以任两个上述值为边界的范围内的pH，例如6.5至8、7至8等的范围内的pH下进行。
在某些情况下，本公开提供了降低木质纤维素水解产物对发酵生物体的毒性的方法，所述方法包括将起始木质纤维素水解产物溶液与含镁碱在40℃至70℃之间的温度和6.5至8之间的pH下混合至少1小时、至少4小时、至少10小时或至少20小时的时段的步骤，所述起始木质纤维素水解产物溶液包含可发酵性糖、呋喃醛和脂族酸的混合物。在特定实施方式中，所述含镁碱是氢氧化镁。
脱毒过程可以作为分批过程、连续过程或半连续过程来进行。脱毒过程可以在分批反应器、连续搅拌釜式反应器(CSTR)、一系列连续搅拌釜式反应器或活塞流反应器(PFR)中进行。
本公开还提供了用于连续降低水解产物中毒素的量的方法，所述方法包括下列步骤：将水解产物的第一连续料流流入到连续反应器或一系列连续反应器中，将含镁碱溶液的第二连续料流流入到所述连续反应器或所述一系列连续反应器中，将所述水解产物与所述含镁碱在所述连续反应器中混合足以降低所述水解产物中毒素的量的时间，以及将所述水解产物流出所述连续反应器。
本公开的脱毒的水解产物可以被发酵微生物发酵，以生产发酵产物例如乙醇。因此，本公开的方法还包括在按照本公开生产的脱毒的水解产物存在下，在产生发酵产物的条件下培养发酵微生物。可以使用各种发酵微生物(例如产乙醇菌)来生产可发酵产物，例如在第4.5节中所描述的。
此外，本公开提供了用于连续生产发酵产物的方法，所述方法包括下列步骤：将水解产物的第一连续料流流入到连续反应器或一系列连续反应器或所述一系列连续反应器中，将含镁碱的第二连续料流流入到所述连续反应器中，将所述水解产物与所述含镁碱在所述连续反应器中混合足以将水解产物中的毒素脱毒(减少其量)的时段，将所述水解产物流出所述连续反应器，降低所述水解产物的pH，以及将所述脱毒的水解产物流入到含有发酵微生物的发酵容器中，由此生产发酵产物。
附图说明
图1：本公开的示例性连续过程的流程示意图。
图2A-2C：描述了使用各种不同剂量(即28.5g氢氧化镁/1kg水解产物、85.5g氢氧化镁/1kg水解产物和142.5g氢氧化镁/1kg水解产物)，分别在50℃、70℃和90℃下进行的脱毒反应在不同时间点处木糖和汤泉消除的量的图。
图3：从甘蔗生物质获得的水解产物的使用三种不同碱的滴定曲线。
详细描述
本公开涉及对从生物质获得的水解产物进行脱毒的方法以及从所述脱毒的水解产物生产发酵产物例如乙醇的方法。可用于本发明的方法的生物质的类型包括但不限于在第4.1节中所描述的。水解生物质的方法描述在第4.2节中。水解产物在脱毒之前的典型组成描述在第4.3节中。使用含镁碱对水解产物进行脱毒的方法描述在第4.4节中。发酵脱毒的水解产物以生产发酵产物的方法描述在第4.5节中，并且回收发酵产物的方法描述在第4.6节中。
生物质(4.1节)
当在本文中使用时，术语“生物质”是指包含纤维素(任选地还包含半纤维素和/或木质素)的任何组合物。
可以按照本公开水解或脱毒的相关类型的生物质可以包括来自于下列物质的生物质：农作物，例如含有谷粒的农作物；玉米秸秆，禾本科植物，甘蔗渣，来自于例如水稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、油菜、高粱的秆；块茎，例如甜菜和马铃薯。
生物质优选地是木质纤维素的。木质纤维素生物质适合地来自于禾本科。正确名称是有花植物的百合纲(Liliopsida)(单子叶植物纲)中被称为禾本科(Poaceae)或牧草科(Gramineae)的科。这一科的植物通常被称为禾本科植物，并包括竹。禾本科植物存在约600个属和约9,000-10,000或更多的种(《Kew世界禾本科植物物种索引》(KewIndex of World Grass Species))。
禾本科(Poaceae)包括在全世界生长的主食用粮和禾谷类作物、草坪和饲料用草以及竹。
禾本科植物的成功部分在于它们的形态和生长过程，部分在于它们的生理学多样性。大多数禾本科植物分成两个生理学组，使用C3和C4光合途径进行碳固定。C4禾本科植物具有与特化的叶解剖学相关联的光合途径，所述叶解剖学使它们特别适应于炎热气候和低二氧化碳的大气。C3禾本科植物被称为“冷季禾本科植物”，而C4植物被称为“暖季禾本科植物”。
禾本科植物可以是一年生或多年生的。一年生冷季禾本科植物的实例是小麦、黑麦、一年生蓝草(一年生草地早熟禾，Poa annua)和燕麦。多年生冷季禾本科植物的实例是野茅(鸭茅，Dactylis glomerata)、羊茅(Festuca spp.)、肯塔基蓝草和多年生黑麦草(Lolium perenne)。一年生暖季禾本科植物的实例是玉米、苏丹草和珍珠稷。多年生暖季禾本科植物的实例是大须芒草、假高粱、狗牙根和柳枝稷。
禾本科植物的一种分类辨别出12个亚科：它们是1)anomochlooideae，一个阔叶禾本植物的小谱系，其包括两个属(Anomochloa，Streptochaeta)；2)Pharoideae(aka Poaceae)，包含三个属、包括Pharus和Leptaspis的禾本科植物的小谱系；3)Puelioideae，包括非洲Puelia属的小谱系；4)早熟禾亚科(Pooideae)，其包括小麦、大麦、燕麦、雀麦草(Bronnus)和拂子茅(Calamagrostis)；5)竹亚科(Bambusoideae)，其包括竹子；6)稻亚科(Ehrhartoideae)，其包括水稻和野生稻；7)芦竹亚科(Arundinoideae)，其包括芦竹和芦苇；8)假淡竹叶亚科(Centothecoideae)，由11个属组成的小亚科，有时被包含在黍亚科(Panicoideae)中；9)画眉草亚科(Chloridoideae)，其包括画眉草(Eragrostis，约350个种，包括埃塞俄比亚画眉草)、鼠尾粟(Sporobolus，约160个种)、龙爪稷(Eleusine coracana(L.)Gaertn.)和乱子草(Muhlenbergia，约175个种)；10)黍亚科(Panicoideae)，包括黍、玉米、高粱、甘蔗、大多数粟、fonio和须芒草；11)Micrairoideae；12)Danthoniodieae，包括蒲苇；其中早熟禾属(Poa)是包含原产于两个半球的温带地区的约500个禾本科植物物种的属。
为其可食用的种子而种植的农业禾本科植物被称为谷类。三种常见的谷类是水稻、小麦和玉米。在所有作物中，70％是禾本科植物。
因此，优选的生物质选自能源作物。在另一种优选实施方式中，能源作物是禾本科植物。优选的禾本科植物包括象草(Napier Grass)或乌干达草(Uganda Grass)，例如象草(Pennisetum purpureum)；或芒草(Miscanthus)例如奇岗(Miscanthus giganteus)和芒属(Miscanthus)的其他品种，或印度草(Indian grass)例如黄假高粱(Sorghastrum nutans)；或柳枝稷例如柳枝稷(Panicum virgatum)或稷属(Panicum)的其他品种，芦竹(arundo donax)，能源甘蔗(saccharumspp.)，木材(包括例如木片、加工废料)、纸张、纸浆和再生纸(包括例如报纸、打印纸等)。在某些实施方式中，生物质是甘蔗，其是指甘蔗属(Saccharum)的高的多年生禾本科植物的任何物种。
其他类型的生物质包括种子、谷粒、块茎(例如马铃薯和甜菜)、植物废料或食品加工或工业加工的副产物(例如秆)、玉米和玉米副产物(包括玉米皮、玉米芯、玉米纤维、玉米秸秆等)、木材和木材副产物(包括例如加工废料、落叶木材、针叶木材、木片(例如落叶或针叶木片)、锯末(例如落叶或针叶木锯末))、纸张和纸张副产物(例如木浆、废材和再生纸，包括例如报纸、打印纸等)、大豆(例如油菜籽)、大麦、黑麦、燕麦、小麦、甜菜、苏丹高粱、买罗高粱、碾碎的干小麦、水稻、甘蔗渣、林业残余物、农业残余物、藜麦、麦草、高粱秆、柑橘废料、城市绿色废物或残余物、食品制造工业废料或残余物、谷物制造废料或残余物、干草、禾秆、稻草、谷粒壳、用过的酒糟、稻壳、柳木、杉木、杨木、桉木、埃塞俄比亚芥(Brassicacarinata)残余物、海棠蓼(Antigonum leptopus)、枫香树、胡枝子(Sericealespedeza)、乌柏、***、油菜籽、高粱(Sorghum bicolor)、大豆和大豆产品(大豆叶、大豆茎、大豆荚和大豆残余物)、向日葵和向日葵产品(例如叶、向日葵茎、无籽向日葵头、葵花籽壳和葵花籽残余物)、芦竹、坚果壳、落叶木叶子、棉纤维、粪肥、沿海百慕大草、三叶草、约翰逊草、亚麻、禾秆(例如大麦秆、荞麦秆、燕麦秆、黍秆、黑麦秆、苋菜秆、斯佩耳特小麦秆)、苋菜和苋菜产品(例如苋菜茎、苋菜叶和苋菜残余物)、苜蓿和竹子。
生物质的其他来源包括硬木和软木。适合的软木和硬木树的实例包括但不限于下列：松树，例如火炬松、短叶松、加勒比松、美国黑松、美国短叶松、沼泽松、洪都拉斯松、马尾松、苏门答腊松、山白松、卵果松、长叶松、帕图拉松、海岸松、西黄松、辐射松、红松、北美白松、欧洲赤松、南洋杉树；杉树，例如花旗松；以及铁杉树，加上任何上述树的杂交种。其他实例包括但不限于下列：桉树，例如邓恩桉、蓝桉、玫瑰桉、悉尼蓝桉、帝汶白桉和尾巨桉(E.urograndis)杂交种；杨树，例如美洲黑杨、大齿杨、颤杨和黑杨；以及其他硬木树例如赤杨、枫香、马褂木、阔叶梣木、绿白蜡木和柳树，加上任何上述树的杂交种。
生物质的水解(4.2节)
任何水解方法可用于制备木质纤维素水解产物，包括酸水解和碱水解。酸水解是便宜和快速的方法，并且可以适合地使用。浓酸水解优选地在20℃至100℃的温度下进行，并且酸强度在10％至45％的范围内(例如10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％、20％、20.5％、21％、21.5％、22％、22.5％、23％、23.5％、24％、24.5％、25％、25.5％、26％、26.5％、27％、27.5％、28％、28.5％、29％、29.5％、30％、30.5％、31％、31.5％、32％、32.5％、33％、33.5％、34％、34.5％、35％、35.5％、36％、37％、37.5％、38％、38.5％、39％、39.5％、40％、41％、41.5％、42％、42.5％、43％、43.5％、44％、44.5％、45％或以任两个上述值为边界的任何范围)。稀酸水解是更简单的方法，但是在更高温度(100℃至230℃)和压力下最优。优选地使用不同种类的酸，其中浓度在0.001％至10％的范围内(例如0.001％、0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％或以任两个上述值为边界的任何范围)。在水解步骤中可以使用适合的酸，包括硝酸、亚硫酸、亚硝酸、磷酸、乙酸、盐酸和硫酸。优选情况下使用硫酸。
取决于酸的浓度、执行酸水解步骤的温度和压力，可能需要耐腐蚀设备和/或耐压设备。
水解可以进行2分钟至10小时(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、26、27、28、29或30分钟，或0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10小时，或以任两个上述值为边界的范围)、优选地1分钟至2小时、2分钟至15分钟、2分钟至2小时、15分钟至2小时、30分钟至2小时、10分钟至1.5小时或1小时至5小时的时段。
作为酸处理的可替选方案(例如在不存在酸水解的情况下)或除了酸水解之外(例如在其之前或之后)，水解还可以包括热或压力处理或热和压力的组合，例如用蒸汽处理约0.5小时至约10小时(例如0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10小时，或以任两个上述值为边界的范围)。
酸水解方法的变化形式在本领域中是已知的，并且可以被本公开的方法所涵盖。例如，可以通过使生物质材料经历两步过程来进行水解。第一(化学)水解步骤在水性介质中、在所选温度和压力下进行，以主要实现半纤维素的解聚而不实现纤维素向葡萄糖的显著解聚。这一步骤产生浆液，其中液体水性相含有从半纤维素的解聚得到的溶解的单糖和可溶性和不溶性的半纤维素寡聚物，并且固体相含有纤维素和木质素。参见例如美国专利号5,536,325。在优选实施方式中，利用硫酸来执行第一水解步骤。在从第一阶段的水解过程分离糖之后，在更严苛的条件下运行第二水解步骤，以水解更具有抗性的纤维素级分。
在另一种实施方式中，水解方法要求使生物质材料在反应器中经历包含强酸和金属盐的稀溶液的催化剂。生物质材料可以是例如原材料或干燥的材料。这种类型的水解可以降低纤维素水解的活化能或温度，最终允许可发酵性糖的较高得率。参见例如美国专利号6,660,506、6,423,145。
另一种示例性方法包括下列步骤：通过一个或多个使用约0.4％至约2％的酸的稀酸水解阶段来加工生物质材料；然后用碱去木质素作用处理酸水解的材料的未反应的固体木质纤维素组分。参见例如美国专利号6,409,841。另一种示例性水解方法包括在预水解反应器中对生物质(例如木质纤维素材料)进行预水解；向固体木质纤维素材料添加酸性液体以制造混合物；将所述混合物加热至反应温度；将反应温度维持足以将木质纤维素材料分级成含有来自于所述木质纤维素材料的至少约20％的木质素的增溶的部分，以及含有纤维素的固体级分；将所述增溶的部分与所述固体级分分离开，并在等于或接近反应温度下除去增溶的部分；以及回收所述增溶的部分。
水解还可以包括将生物质材料与化学计算量的非常低浓度的氢氧化钠和氢氧化铵相接触。参见Teixeira等，1999,Appl.Biochem.andBiotech.77-79:19-34。水解还可以包括将木质纤维素与化学品(例如碱，例如碳酸钠或氢氧化钾)在约9至约14的pH和适度的温度、压力和pH下相接触。参见PCT公开WO2004/081185。
也可以使用氨水解。这样的水解方法包括使生物质材料在高固体条件下经历低的氨浓度。参见例如美国专利公布号20070031918和PCT公布WO2006/110901。
在水解后，水解产物包含酸和碱、部分降解的生物质和可发酵性糖的混合物。在进一步加工之前，可以通过施加真空从混合物中除去酸或碱。也可以在脱毒之前将混合物中和。
在脱毒之前，可以在被称为固/液分离的过程中，将包含增溶的糖的水性级分与混合物中残留的不溶性颗粒物分离开。将可溶性级分与不溶性级分分离开的方法包括但不限于离心(连续、半连续和分批)、倾析和过滤。可以任选地将水解的生物质固体用水性溶剂(例如水)清洗，以除去吸附的糖。
在脱毒之前，可以对固体进行进一步处理，例如脱水。脱水可以使用螺旋压力机适合地实现。螺旋压力机是使用大的螺杆将含有固体的料流沿着水平筛管推动的机器。固体的移动可以受到管末端处的加重板的阻碍。该板对固体塞的压力迫使液体流出固体并通过筛管侧面中的孔，然后沿着排液管流出。然后螺杆将剩余的固体推过所述板，在那里它们跌落在下方的收集垫或传送带上。
水解产物特征(4.3节)
在生物质水解和固/液分离步骤之后，对木质纤维素水解产物进行脱毒。在脱毒之前的木质纤维素水解产物溶液(即起始木质纤维素水解产物溶液)中包含的个体化合物、包括可发酵性糖、呋喃醛、脂族酸和酚物质的相对量和浓度，取决于具体的木质纤维素生物质和获得水解产物的水解方法。
在某些实施方式中，起始水解产物溶液包含(a)浓度在30g/L至160g/L、40g/L至95g/L或50g/L至70g/L范围内的总可发酵性糖；(b)浓度在0.5g/L至10g/L、2.5g/L至4g/L或1.5g/L至5g/L范围内的糠醛；(c)浓度在0.1g/L至5g/L、0.5g/L至2.5g/L或1g/L至2g/L范围内的5-HMF；(d)浓度在2g/L至17g/L或11g/L至16g/L范围内的乙酸；(e)浓度在1g/L至12g/L或4g/L至10g/L范围内的乳酸；(f)浓度在0g/L至2.5g/L范围内的其他脂族酸(例如琥珀酸、甲酸、丁酸和乙酰丙酸)；和/或(g)浓度在0g/L至10g/L、0.5g/L至5g/L或1g/L至3g/L范围内的酚物质。在这些实施方式中，起始水解产物溶液在本文中被称为“1x”。
在其他实施方式中，起始水解产物可以比1x更浓。例如，起始水解产物溶液可以比1x浓1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在这些实施方式中，起始水解产物将分别被称为1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x和10x。
在其他实施方式中，起始水解产物浓度可以比1x更低。例如，起始水解产物溶液的浓度可以为1x的0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍或0.9倍。在这些实施方式中，起始水解产物将分别被称为0.1x、0.2x、0.3x、0.4x、0.5x、0.6x、0.7x、0.8x和0.9。
在脱毒过程之前，可以调整水解产物溶液的浓度。在连续过程的情形中，水解产物溶液的浓缩可能特别有利(参见图1和第4.4节)。例如，在稀酸水解和固/液分离后离开水解器的水解产物溶液，可以在添加用于脱毒的含镁碱之前进行浓缩。在某些实施方式中，在脱毒之前可以将水解产物溶液浓缩1.2倍、1.5倍、2倍、3倍或5倍。在特定实施方式中，可以将起始水解产物在以任两个上述实施方式为边界的范围内浓缩，例如浓缩1倍至3倍、1.5倍至3倍、3倍至5倍等。
在脱毒之前浓缩水解产物溶液，可以导致对呋喃醛消除的选择性增加到超过糖降解。不受理论限制，据信对于糖降解来说反应速率是一阶的，对于呋喃醛消除来说反应速率是二阶的。因此，浓缩水解产物溶液导致呋喃醛消除速率相对于可发酵性糖降解速率增加。
水解产物溶液可以在减压下和/或通过加热来浓缩。在一种实施方式中，水解产物溶液在多级蒸发装置中浓缩(参见图1和实施例1)。水解产物的浓缩液可以通过其他技术例如膜过滤、碳处理和离子交换树脂来进行。蒸发导致糖浓度增加，并且可以导致一定量糠醛和乙酸盐的移除。
水解产物使用含镁碱的脱毒(4.4节)
一般来说，本公开的脱毒方法需要将木质纤维素水解产物与含镁碱(例如氢氧化镁、碳酸镁或氧化镁)在导致产生脱毒的木质纤维素水解产物的条件下混合一段时间。脱毒方法对于呋喃醛的消除来说是高选择性的。当在本文中使用时，短语“对呋喃醛的消除高选择性”是指观察到呋喃醛与含镁碱的反应速率高于可发酵性糖与含镁碱的反应速率。结果，按照本公开生产的脱毒的水解产物相对于起始水解产物具有较高百分率的可发酵性糖和较低百分率的呋喃醛。脱毒的水解产物然后可以被适合的发酵微生物发酵，以生产发酵产物例如乙醇。
脱毒方法通常包括将起始木质纤维素水解产物溶液与含镁碱在导致产生脱毒的水解产物溶液的条件下混合一段时间。适合于执行脱毒过程的时间量取决于多种因素，包括水解产物的化学组成、水解产物溶液的浓度、反应温度、水解产物溶液的pH、添加的含镁碱的总量、搅拌速率和所使用的反应器的类型。脱毒过程通常进行15分钟至80小时范围内的时段，更通常在1小时至40小时之间。在特定实施方式中，脱毒过程进行1小时至30小时、1.5小时至20小时、2小时至12小时、3小时至9小时、4小时至10小时或6小时至9小时范围内的时段。这一过程适用于分批和连续容器处理。
水解产物脱毒过程通常在90℃或更低的温度下，例如在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃、75℃、80℃或85℃的温度下进行。在特定实施方式中，温度在以任两个上述实施方式为边界的范围内，例如但不限于40℃至70℃、40℃至60℃、40℃至55℃、45℃至55℃、45℃至50℃、50℃至55℃或40℃至50℃范围内的温度。在特定实施方式中，水解产物溶液的温度在40℃至60℃的范围内。在该范围内，获得对呋喃醛消除的高选择性，并在同时观察到商业上可行的脱毒反应速率。
水解产物脱毒过程通常在6.2至9.5范围内的pH下，例如在6.5、7、7.5、8、8.5、9.0或9.5的pH下进行。在特定实施方式中，pH在以任两个上述值为边界的范围内，例如但不限于6.5至8、6.5至7.5、7至8或7至7.5范围内的pH。应该理解，水解产物溶液的pH取决于含镁碱的浓度和溶液的温度。在使用氢氧化镁进行水解产物脱毒的实施方式中，氢氧化镁的溶解度随着温度升高而降低。因此，对于向水解产物溶液添加的给定量的氢氧化镁来说，当温度升高，所有其他变量保持恒定时，平衡pH降低(参见例如表3)。随着脱毒过程的进展，由于氢氧化物在与糖和呋喃的反应中的消耗，溶液的pH可能略微降低。在反应过程中，可以向水解产物溶液添加另外的氢氧化镁以调整pH。
向1x水解产物溶液添加的含镁碱的总量可以在2克每1千克水解产物(2g/1kg水解产物)至200克每1千克水解产物(200g/1kg水解产物)的范围内。例如，向水解产物溶液添加的含镁碱的总量可以为40g/1kg水解产物、80g/1kg水解产物、100g/1kg水解产物、120g/1kg水解产物、140g/1kg水解产物或160g/1kg水解产物。含镁碱可以在单一步骤中、分成多个部分或在整个脱毒过程中连续地添加到水解产物溶液。在特定实施方式中，向水解产物溶液添加的含镁碱的总量在以任两个上述实施方式为边界的范围内，例如但不限于40g/1kg水解产物至160g/1kg水解产物、40g/1kg水解产物至120g/1kg水解产物、80g/1kg水解产物至160g/1kg水解产物、80g/1kg水解产物至140g/1kg水解产物或140g/1kg水解产物至160g/1kg水解产物。对于更浓的水解产物溶液(例如4x)来说，足以将pH升高到所需水平的含镁碱的量相对于1x水解产物溶液将会增加。对于浓度较低的水解产物溶液(例如0.5x)来说，足以将pH升高到所需水平的含镁碱的量相对于1x水解产物溶液将会减少。
水解产物脱毒过程可以在任何适合的容器例如分批反应器或连续反应器(例如连续搅拌釜式反应器(CSTR)或活塞流反应器(PFR))中进行。连续反应器允许在脱毒反应进行时连续添加和移除输入的材料(例如水解产物、含镁碱浆液)。适合的容器可以装备有用于搅拌水解产物溶液的手段，例如旋桨。反应器设计在Lin,K.-H.和Van Ness,H.C.(在Perry,R.H.和Chilton,C.H.主编的《化学工程师手册》(Chemical Engineer’s Handbook)第5版(1973)，第4章，McGraw-Hill,NY)中讨论。
脱毒过程可以以分批模式进行。所述方法通常包括将水解产物溶液与含镁碱(或含镁碱浆液)在反应器中合并。水解产物溶液和含镁碱可以一起或分开地进料到反应器。任何类型的反应器可用于分批模式脱毒，其简单地包括添加原料，在特定条件(例如温度、剂量和时间)下进行脱毒过程，以及从反应器移除脱毒的水解产物。
或者，脱毒过程可以以连续模式进行。本公开的连续过程有利地减少了对停止和清洁反应器的需要，并因此可以以连续模式进行例如几天或更长(例如一周或更长)的时段，以支持总的连续过程。方法通常需要向反应器连续进料水解产物溶液和含镁碱浆液。水解产物和含镁碱浆液可以一起或分开地进料。得到的混合物在反应器中具有特定的滞留或停留时间。停留时间由向反应器添加水解产物和碱后达到所需脱毒水平的时间所决定。在脱毒过程后，脱毒的水解产物离开反应器，并且可以向反应器添加其他组分(例如水解产物和碱浆液)。可以将多个这样的反应器串联连接，以在延长的滞留时间内支持进一步的pH调整和/或在延长的滞留时间内调整温度。
对于连续模式的脱毒来说，可以使用允许相等的输入和输出速率的任何反应器例如连续搅拌釜式反应器或活塞流反应器，以便在反应器中实现稳态并使反应器的填充水平保持恒定。
本公开的脱毒过程可以以半连续模式进行。可以使用具有不相等的输入和输出料流并最终需要将***重新设定到起始条件的半连续反应器。
本公开提供了对从木质纤维素生物质获得的生物质进行连续脱毒的方法。如图1中所示，连续脱毒过程的步骤包括将水解产物的第一连续料流流入到连续反应器中，将含镁碱溶液的第二连续料流流入到所述连续反应器中，将水解产物与含镁碱在所述连续反应器中混合足以减少水解产物中毒素的量的时段，以及将水解产物流出所述连续反应器。
除了脱毒之外，本公开方法还可以包括其他步骤，例如在图1中示出的在脱毒步骤上游或下游的一个或多个步骤。在图1中，仅仅示出了在生物质水解下游的步骤。在生物质水解和固/液分离后，将水解产物在多级蒸发装置100中浓缩。水解产物通过管线101离开多级蒸发装置100，并进入连续搅拌釜式反应器102。在进入连续搅拌釜式反应器102之前，可以对水解产物加热。通过管线103将氢氧化镁连续供应到连续搅拌釜式反应器。在连续搅拌釜式反应器102中的脱毒完成后，将脱毒的水解产物通入管线104中，在那里它遇到来自于管线105的酸(例如硫酸或磷酸)料流。将脱毒的水解产物的混合物通入到混合器106中。中和的脱毒的水解产物通过管线107离开混合器106，并流入到发酵容器108中。
在添加含镁碱后水解产物溶液的充分混合，可以提高碱的溶解速率并确保在整个溶液中pH保持基本上均匀。例如，理想的混合将避免形成局部的较高pH的口袋，所述口袋可以造成对呋喃消除的较低选择性。可以使用100转每分钟(rpm)至1500rpm之间的混合速度来确保水解产物溶液的充分混合。例如，可以使用100rpm、200rpm、400rpm、800rpm和1500rpm的混合速度。在特定实施方式中，混合在以任两个上述混合速度为边界的速度下进行，例如但不限于100rpm至200rpm、100rpm至400rpm、200rpm至400rpm、400rpm至800rpm或800rpm至1,500rpm。在其他实施方式中，可以使用间歇的混合方案，其中混合速率随着脱毒过程的进展而变。水解产物溶液的混合可以使用本领域中已知的任何混合器来实现，例如高剪切混合器、桨式混合器、磁力搅拌机或振摇器、涡旋振荡、使用珠子的搅拌和顶置式搅拌。
本公开的脱毒方法提供了与起始水解产物相比已除去显著部分的呋喃醛的脱毒的水解产物。同时，脱毒导致可发酵性糖的极小损失。因此，脱毒反应对呋喃醛的消除是高度选择性的。在特定实施方式中，本文中公开的方法提供的脱毒的水解产物具有存在于起始水解产物中的至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的可发酵性糖，以及存在于起始水解产物溶液中的不超过50％、不超过40％、不超过30％或不超过20％的呋喃醛。
在特定实施方式中，本公开的脱毒方法提供的脱毒的水解产物具有(a)起始水解产物中存在的至少90％的总可发酵性糖和起始水解产物中存在的不超过50％的呋喃醛；(b)起始水解产物中存在的至少90％的总可发酵性糖和起始水解产物中存在的不超过40％的呋喃醛；(c)起始水解产物中存在的至少90％的总可发酵性糖和起始水解产物中存在的不超过30％的呋喃醛；(d)起始水解产物中存在的至少90％的总可发酵性糖和起始水解产物中存在的不超过20％的呋喃醛；(e)起始水解产物中存在的至少80％的总可发酵性糖和起始水解产物中存在的不超过50％的呋喃醛；(f)起始水解产物中存在的至少80％的总可发酵性糖和起始水解产物中存在的不超过40％的呋喃醛；(g)起始水解产物中存在的至少80％的总可发酵性糖和起始水解产物中存在的不超过30％的呋喃醛；(h)起始水解产物中存在的至少80％的总可发酵性糖和起始水解产物中存在的不超过20％的呋喃醛。
在特别有利的实施方式中，用于脱毒的含镁碱是氢氧化镁。氢氧化镁的优点在于它在脱毒过程进展时有效地缓冲水解产物溶液。由于氢氧化镁的有限的溶解度，固体氢氧化镁仅仅在中和或碱性***中，在氢氧化物离子与水解产物包含的其他组分(例如呋喃醛)反应后才进一步解离。此外，由于常见的离子效应，当氢氧化物在与呋喃醛或糖的反应中被消耗时，可溶性镁离子(其不反应并且作为观察离子存在)的积累将阻止氢氧化镁的进一步溶解，并因此产生对pH进一步提高的限制。因此，在整个脱毒过程中，溶液的pH保持在狭窄的范围内。
不受理论的限制，据信使用本公开的方法观察到的对呋喃醛的高选择性，部分源自于使用氢氧化镁或碳酸镁作为脱毒碱所实现的紧密pH控制。滴定研究表明，氢氧化镁在水解产物溶液中具有低的溶解度，尤其是在通常进行脱毒过程的6至8范围内的pH下(参见图3和实施例6)。因此，水解产物溶液中可用于与水解产物的组分(例如总可发酵性糖和呋喃醛)反应的氢氧化物离子的量有限。动力学研究(参见实施例7)表明，糠醛破坏的活化能低于糖降解的活化能。因此，溶液中存在的绝大部分氢氧化物被导向与呋喃醛而不是总可发酵性糖的反应。
在脱毒过程完成后，可以通过添加适合的酸(例如硫酸或磷酸)(参见图1)来降低脱毒的水解产物溶液的pH。可以将pH调整到适合于发酵微生物的水平。一般来说，将pH调整到3.5至8之间的值，更通常为4至7之间的值。在将pH调整到所需水平之后，可以将脱毒的水解产物转移到发酵容器。
脱毒的水解产物的发酵(4.5节)
糖向发酵产物的发酵可以在单步或多步发酵中，通过一种或多种适合的发酵微生物来进行。发酵微生物可以是野生型微生物或重组微生物，并包括埃希氏菌(Escherichia)、发酵单胞菌(Zymomonas)、酵母(Saccharomyces)、假丝酵母(Candida)、毕赤酵母(Pichia)、链霉菌(Streptomyces)、芽孢杆菌(Bacillus)、乳杆菌(Lactobacillus)和梭状芽孢杆菌(Clostridium)。特别适合的发酵微生物物种包括大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、热纤梭状芽孢杆菌(Clostridiathermocellum)、Thermoanaerobacterium saccharolyticum和树干毕赤酵母(Pichia stipitis)。大肠杆菌或运动发酵单胞菌的遗传修饰菌株可用于乙醇生产(参见例如Underwood等，2002,Appl.Environ.Microbiol.68:6263-6272和US2003/0162271A1)。
发酵可以在含有或不含其他营养物例如维生素和玉米浆(CSL)的最低培养基中进行。发酵可以在本领域中已知的任何适合的发酵容器中进行。例如，发酵可以在Erlenmeyer摇瓶、Fleaker、DasGipfedbatch-pro(DasGip technology)、2L BioFlo发酵罐或10L发酵罐(B.Braun Biotech)中进行(参见实施例5)。发酵过程可以作为分批、补料分批或连续过程来进行。发酵液的起始pH在3.5的值至8的值的范围内，更通常在4的值至7的值的范围内。发酵一般在20℃至40℃之间的温度下进行，更通常在25℃至35℃之间。在特定实施方式中，发酵进行5至90小时、10至50小时或20至40小时之间的时段。
发酵产物的回收(4.6节)
发酵产物可以使用本领域中已知的各种方法来回收。产物可以通过离心、过滤、微滤和纳滤与其他发酵组分分开。产物可以通过离子交换、溶剂萃取或电透析来提取。可以使用絮凝剂来协助产物分离。作为具体实例，可以使用本领域中已知的用于ABE发酵的方法从发酵培养基分离生物生产的乙醇(参见例如Durre,1998,Appl.Microbiol.Biotechnol.49:639-648；Groot等，1992,Process.Biochem.27:61-75；以及其中的参考文献)。例如，可以通过离心、过滤、倾倒等从发酵培养基中移除固体。
在发酵后，发酵产物例如乙醇，可以通过已知用于从水性溶液分离乙醇的许多常规技术中的任一种，从发酵液分离。这些方法包括蒸发、蒸馏、共沸蒸馏、溶剂萃取、液-液萃取、膜分离、薄膜蒸发、吸附、涤气、渗透汽化等。
具体实施方式
实施例1：木质纤维素生物质的水解(5.1节)
收获木质纤维素生物质(例如能源甘蔗或甘蔗)并使用饲料切碎机切成一定大小，用乳杆菌细菌制备物接种并储存在农用袋中直至使用。在稀酸水解之前，从袋子中取出木质纤维素生物质并用工艺用水清洗以除去有机酸，然后使用螺旋压力机脱水。然后将生物质与水和硫酸(0.2％至3％)一起运送到加压反应室(即水解器)。最小化浆液的液/固比，以最大化水解后水解产物中溶解的糖的浓度。在水解器中的滞留时间和水解器的温度取决于生物质的参数(例如湿度和葡聚糖水平)。一般来说，水解器的温度在120℃至180℃的范围内，滞留时间在3分钟至2小时的范围内。
在稀酸水解后，得到的水解器浆液含有溶解的糖以及残留的不溶性纤维。将浆液***减压并吹入到旋风分离器装置中，以将浆液减压。使用清洗用水将材料重新形成浆液，并使用螺旋压力机将浆液脱水，以便榨出溶解的糖和毒素。使用具有反向流清洗的三个螺旋压力机步骤来脱水和清洗抑制剂饼。反向流清洗被定义为清洗用水以与饼流动相反的方向流动。将高固体百分率的浆液稀释成低固体百分率的浆液(<10％固体)并泵向螺旋压力机。这种稀释使用当***达到稳态时从后面的螺旋压力机通过反向流交换所提供的一部分重循环液体(被定义为“压出液”)。在最后的螺旋压力机步骤中与压出液一起加入清洁的水，以使饼可泵送。使用另外两个螺旋压力机重复最初的液/固分离步骤，以从饼中除去毒素。将得到的高固体百分率的饼推进到进行同时糖化和发酵，并收集来自于第一步的压出液用于脱毒工作。
来自于几种生物质来源的起始水解产物中各个化合物(例如糖、呋喃和脂族酸)在稀酸水解和固/液分离后的浓度，示出在表1中。
表1：起始水解产物的组成
实施例2：水解产物用氢氧化镁的脱毒-分批反应器(5.2节)
材料和方法(5.2.1节)
高粱水解产物DP100309(5.2.1.1节)
将水解产物DP100309置于装备有搅拌棒的1L三颈圆底烧瓶中。将圆底烧瓶置于油浴中并加热至70℃。当水解产物溶液被加温时，称量目标量的氢氧化镁浆液(即氢氧化镁在水中的超饱和溶液)。向水解产物添加的氢氧化镁的总量，从水解产物溶液用氢氧化钠的滴定来确定(参见图3和实施例6)。也参见Martinez等，2001,Biotechnol.Prog.17(2):287-293。在将水解产物溶液加热至所需温度后，在70℃下，以22.86g/Kg水解产物的剂量向水解产物溶液快速添加氢氧化镁浆液。使用磁力搅拌器将溶液剧烈搅拌3小时。随时间监测脱毒过程的进展。在各个不同时间点从水解产物溶液获取样品，并将其用停止溶液(50mM H2SO4)在冰上淬灭(将约1.3ml每个时间点的样品立即加入到11.7ml冰冷的停止溶液(50mM H2SO4，10x倍数稀释)，以在进一步化学分析的时间尺度上淬灭任何进一步反应的发生)。在脱毒过程完成后，随后将脱毒的水解产物冷却至发酵温度，并通过添加4M H2SO4将pH调整到发酵pH。
在脱毒的水解产物溶液的酸化后，测量水解产物中各个化合物的浓度。糖通过HPLC来分离和定量。使用Shodex SP0810孔径排阻和配体交换柱以及Agilent1200系列折光率检测器(RID)。使用HPLC级别的水作为流动相运行等度方法，所述方法提供足够的分辨率，以产生可以从中计算不同糖包括木糖、***糖、葡萄糖、纤维二糖、半乳糖、甘露糖和其他糖的浓度的色谱图。
糠醛和5-HMF的浓度也通过HPLC来分析，使用Alltech PlatinumC18柱和相同的Agilent RID。将样品在水/乙腈混合物中稀释并转移到小瓶或多孔板中。这些样品通过保留时间和峰面积，针对已知浓度的各种被分析物的标准曲线来鉴定和定量。
能源甘蔗水解产物DP100511(5.2.1.2节)
将水解产物DP100511置于装备有搅拌棒的1L三颈圆底烧瓶中。将圆底烧瓶置于油浴中并加热至70℃。当水解产物溶液被加温时，称量目标量的氢氧化镁浆液。在将水解产物溶液加热至所需温度后，在70℃下，以16.53g/Kg水解产物的剂量向水解产物溶液快速添加氢氧化镁浆液。使用磁力搅拌器将溶液剧烈搅拌3小时。随时间监测脱毒过程的进展。在各个不同时间点从水解产物溶液获取样品，并将其用停止溶液(50mM H2SO4)在冰上淬灭(将约1.3ml每个时间点的样品立即加入到11.7ml冰冷的停止溶液(50mM H2SO4，10x倍数稀释)，以在进一步化学分析的时间尺度上淬灭任何进一步反应的发生)。在脱毒过程完成后，随后将脱毒的水解产物冷却至发酵温度，并通过添加4M H2SO4将pH调整到发酵pH。
在脱毒的水解产物溶液的酸化后，水解产物中各个化合物的浓度如第5.2.1.1节中所描述来测量。
能源甘蔗水解产物DP100513-1(5.2.1.3节)
将水解产物DP100513-1置于装备有搅拌棒的1L三颈圆底烧瓶中。将圆底烧瓶置于油浴中并加热至70℃。当水解产物溶液被加温时，称量目标量的氢氧化镁浆液。在将水解产物溶液加热至所需温度后，在70℃下，以22.59g/Kg水解产物的剂量向水解产物溶液快速添加氢氧化镁浆液。使用磁力搅拌器将溶液剧烈搅拌10小时。随时间监测脱毒过程的进展。在各个不同时间点从水解产物溶液获取样品，并将其用停止溶液(50mM H2SO4)在冰上淬灭(将约1.3ml每个时间点的样品立即加入到11.7ml冰冷的停止溶液(50mM H2SO4，10x倍数稀释)，以在进一步化学分析的时间尺度上淬灭任何进一步反应的发生)。在脱毒过程完成后，随后将脱毒的水解产物冷却至发酵温度，并通过添加4M H2SO4将pH调整到发酵pH。
在脱毒的水解产物溶液的酸化后，水解产物中各个化合物的浓度如第5.2.1.1节中所描述来测量。
结果(5.2.2节)
各种水解产物的生物质脱毒的选择性(5.2.2.1节)
在50℃或70℃下进行的从高粱(DP100309)和能源甘蔗(DP100511和DP100513-1)获得的木质纤维素水解产物的脱毒的结果示出在表2中。表2中示出的结果表明，与糖损失相比，脱毒反应对呋喃醛移除具有远远更高的选择性。在所指示的时间点时，糖损失的百分率为7％或更低，而呋喃移除的百分率为29.5％或更高。将具有较高呋喃醛初始浓度的水解产物溶液与氢氧化镁混合较长时间，在一组标准条件下获得所需的呋喃醛消除水平。例如，将从能源甘蔗获得的具有1.7g/L糠醛起始浓度的水解产物DP100511在70℃下脱毒3小时，获得所需的糠醛消除水平。另一方面，将也从能源甘蔗获得的具有2.73g/L糠醛起始浓度的水解产物DP100513-1在70℃下脱毒10小时，获得所需的糠醛消除水平。
脱毒过程的选择性还取决于温度。例如，使用从能源甘蔗获得的水解产物DP100513-1开始，当脱毒过程在50℃的温度下运行时，在9小时后损失可忽略量的糖。在70℃下，当将相同的水解产物脱毒9小时时，损失5％的糖。然而，在70℃下运行9小时的脱毒过程与在50℃下运行9小时的脱毒相比，糠醛移除的百分率高两倍以上。因此，在较低温度下，较长的反应时间提供可接受的呋喃消除水平。
表2:使用氢氧化镁作为碱时不同水解产物的生物质脱毒的选择性
从能源甘蔗获得的水解产物在不同的碱浓度和各种温度下的脱毒(5.2.2.2节)
在50℃、70℃和90℃下，使用不同量的氢氧化镁，对从能源甘蔗获得的水解产物(DP100513-1)进行上述的脱毒程序。水解产物DP100513-1的各个化合物的浓度示出在表1中。图2A-2C提供的图分别示出了在50℃、70℃和90℃下进行的使用各种剂量(即28.5g氢氧化镁/1kg水解产物、85.5g氢氧化镁/1kg水解产物和142.5g氢氧化镁/1kg水解产物)的脱毒反应在各个时间点时木糖和糠醛消除的量。在50℃下(图2A)，不论使用的氢氧化镁浓度如何，糠醛消除的选择性高。糠醛消除的速率随着氢氧化镁剂量的增加而增加。在70℃的温度下(图2B)，对糠醛消除的选择性仍然显著，尽管低于在50℃下的选择性。在70℃下，与50℃下相比，糠醛消除的速率略微更快。在90℃下(图2C)，相对于在50℃和70℃下运行的脱毒，对糠醛消除的选择性降低，并且与在较低温度下运行的脱毒相比，过程中消耗更多的糖。在90℃下，与在50℃或70℃下相比，糠醛消除的速率明显更高。
实施例3：水解产物的脱毒-串联的CSTR(5.3节)
脱毒过程使用一系列连续搅拌釜式反应器反应器(CSTR)来进行。使用加热套和/或循环水浴将水解产物溶液加热至目标温度，并用蠕动泵提供给一系列串联连接的事先添加有氢氧化镁浆液的搅拌反应器(1、2或4L尺寸)中的第一个反应器。水解产物溶液与向反应器添加的氢氧化镁浆液的比率基于滴定剂量(例如1ml/min的碱浆液比20ml/min的水解产物)。然后将得到的混合物泵向一个或多个另外的CSTR。如果混合物的pH下降到低于某个水平，则向每个随后的CSTR反应器添加两外的碱浆液。通过固定目标体积并维持目标流速来限制在每个反应器中的停留时间(其中流速乘以体积等于停留时间)。为了防止泡沫积累，也将消泡剂提供到一个搅拌釜反应器中。下面的表描述了使用串联的两个CSTR反应器，在实验室规模上的操作计划的操作范围。
参数 操作范围
Hz泵速 10-95ml/min
消泡剂泵速 0.1-0.5ml/min
反应器1的保留容积 400-4000ml
反应器2的保留容积 500-4000ml
总停留时间 30-300min
总的碱泵速 0.1-20ml/min
总的输出流速 20-100ml/min
实施例4：在使用氢氧化镁的水解产物脱毒中温度与pH之间的关系(5.4节)
分别在50℃、70℃和90℃的温度下，使用不同量的氢氧化镁，对从能源甘蔗获得的水解产物(DP100513-1)进行在第5.2.1.3节中描述的脱毒程序。表3示出了在添加142.5氢氧化镁/1kg水解产物后，反应的pH随水解产物的温度的变化。正如在表3中指明的，水解产物溶液的pH随着溶液温度的提高而降低。
表3：在使用氢氧化镁的木质纤维素水解产物的脱毒中温度对pH的影响
实施例5：脱毒的水解产物的发酵(5.5节)
材料和方法(5.5.1节)
在脱毒步和酸化后，将水解产物溶液发酵以生产乙醇。脱毒的水解产物的发酵使用大肠杆菌作为产乙醇菌，在35℃下进行。发酵在含有或不含其他营养物例如维生素和CSL的最低培养基中，在5.0至7.0之间的起始pH下进行，进行或不进行pH控制。
过程包括通过Erlenmeyer摇瓶、Fleaker(Spectrum Lab)、DasGipfedbatch-pro(DasGip technology)、2L BioFlo发酵罐(New Brunswick)和10L发酵罐(B.Braun Biotech)的发酵。分批和补料分批发酵在2L和10L发酵罐中进行。大肠杆菌接种物培养分三步进行生长。种子I和II培养基由40mM MES、1x AM6(0.5g/L磷酸钠、0.859g/L尿素)、1％CSL和60.79g/L葡萄糖构成。将含有100ml培养基的250mlErlenmeyer摇瓶用100μl甘油储用物接种，在35℃下在120rpm的旋转摇床上生长11小时(种子I)。种子II培养用100μl种子I培养物接种，并在35℃下在120rpm的旋转摇床上生长11小时。含有1x AM6、5g/L CSL、50％脱毒的水解产物(v/v)和0.6％酵母自溶物的种子III培养，在2L发酵罐中用5％种子II培养物接种，并在35℃(pH7.0)和495rpm的搅拌下生长10-11小时，直至乙醇浓度达到5g/L。将含有95％(v/v)脱毒的水解产物和1x AM6并含有或不含其他营养物的主发酵容器用5％(v/v)种子III接种物接种，并以分批和补料分批两种模式，在35℃(pH7)下进行好氧发酵。在补料分批发酵期间，脱毒的水解产物和AM6以各种不同速率补料，并通过搅拌匀变曲线使用溶氧级联控制策略来维持补料期间的溶氧。
使用气相色谱(GC，Agilent6890系列)测定来自于发酵样品的乙醇浓度。具体来说，使用具有火焰离子化检测器和HP-Innowax柱的Agilent***。GC***设置包括1)HP-INNOWax聚乙二醇毛细管柱(30m x0.25mm x0.25um)；2)以0.8mL/min恒速流动的作为载样气体的氦气；3)柱温箱程序：40℃(保持5.6min)，以25℃/min的速率匀变升温至125℃；4)进样：入口温度250℃，进样体积1uL，分离比为100:1。使用化合物1-丙醇作为内标，并获得多点标准曲线以计算每个样品的最终乙醇浓度。将样品用含有0.2％1-丙醇作为内标的甲醇进行稀释，并在除去沉淀物后注入到GC***中。乙醇通过停留时间来鉴定并通过峰面积来定量。
结果(5.5.2节)
对于用氢氧化镁或氢氧化钙脱毒后的脱毒的水解产物，评估被定义为发酵能力的产乙醇菌生产乙醇的能力。使用氢氧化钙的脱毒反应，以与实施例2中描述的脱毒反应相似的方式，在标准的超施石灰条件(55℃30分钟)下进行。
脱毒的水解产物的发酵能力结果示出在表4中。在表4中，发酵能力测量值已被归一化至标准的超施石灰条件，其中1的发酵能力被定义为达到与标准的超施石灰条件相同的最大乙醇浓度的情况。如表4中所示，在大肠杆菌中，使用氢氧化镁脱毒的水解产物与超施石灰条件相比显示出略微更低的发酵能力。因此，使用氢氧化镁的脱毒产生容易被产乙醇菌发酵，产生高得率乙醇的水解产物。产生的乙醇的量与使用氢氧化钙脱毒的水解产物的量相当。
表4：脱毒的水解产物的发酵能力
实施例6：滴定曲线的产生(5.6节)
材料和方法(5.6.1节)
产生了用于向源自于甘蔗的水解产物DP110105添加的三种不同碱(氢氧化镁、氢氧化钙和氢氧化钠)的添加的滴定曲线，以确定可以被添加以将水解产物溶液的pH提高到特定水平的碱的量。为了产生滴定曲线，将预热的预先称重过的量的水解产物DP110105，在搅拌下通过定期添加标定过的碱或碱浆液的等分试样进行处理，并记录在每次添加碱等分试样后的pH。将碱通过手动移液、滴定管、蠕动泵或注射器泵添加到预装有水解产物的带有搅拌棒的烧杯或预装有水解产物的顶置式搅拌釜反应器。以使用的碱的体积作为横坐标并以pH值作为纵坐标，产生这些pH值的图。
结果(5.6.2节)
这些碱的滴定曲线示出在图3中。向水解产物溶液添加增加量的氢氧化镁，导致pH缓慢上升直至低于8的最大pH。氢氧化钙或氢氧化钠的添加导致随着碱的添加pH急剧上升。
对于氢氧化钙添加来说，pH在大于10的值处变平。滴定研究表明，氢氧化镁在水解产物溶液中具有低的溶解度，尤其是在进行脱毒过程的6至8范围内的pH下。因此，当将氢氧化镁用作脱毒碱时，水解产物溶液中可用于与水解产物的化合物(例如总可发酵性糖和呋喃醛)反应的氢氧化物离子的量有限，尤其是当与氢氧化钙或氢氧化钠相比时。
实施例7：使用氢氧化镁脱毒的动力学研究(5.7节)
材料和方法(5.7.1节)
为了分析脱毒过程的动力学，使用水解产物DP100513和作为脱毒碱的氢氧化镁，在各种温度、pH水平和水解产物浓度下运行实施例2中描述的方法。在添加碱或碱浆液后的多个时间点获取样品，并表征各种被分析物的浓度。选择木糖和糠醛浓度的时间依赖性的降低来代表呋喃与醛糖之间的更广泛的竞争，这是因为这两种化合物以最高浓度存在于起始水解产物中，因此最适合进行良好的模型拟合。假设幂定律动力学，将这些数据拟合于通用形式的阿累尼乌斯方程，以解出前指数因子、反应的级数和活化能。模型加工是误差平方和的迭代最小化，使得对于每种参数来说，所有数据可以拟合于单一方程。使用各种非线性拟合软件，包括Excel SOLVER和Athena。糠醛移除方程的活化能低于木糖消除的活化能，这与观察到的在较低温度下对糠醛破坏的较高选择性相一致。
结果(5.7.2节)
动力学研究的结果表明，糠醛消除的活化能低于木糖降解的活化能。结果，在较低温度下获得较高选择性。
具体实施方式和参考引入
本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献以其全部内容为所有目的通过参考并入本文，其程度如同每个单个的出版物、专利、专利申请或其他文献被单独地指明为所有目的通过参考并入。
尽管已经说明并描述了各种具体的实施方式，但应该认识到，可以做出各种改变而不背离本发明的精神和范围。

Claims (73)

1.一种降低木质纤维素水解产物对发酵生物体的毒性或减少来自于木质纤维素水解产物的对发酵生物体的一种抑制剂的至少一部分的方法，所述方法包括将起始木质纤维素水解产物溶液与选自氢氧化镁、碳酸镁和氧化镁的含镁碱在导致形成脱毒的水解产物溶液的条件下混合一段时间，由此降低所述木质纤维素水解产物的毒性的步骤，所述起始木质纤维素水解产物溶液包含可发酵性糖、呋喃醛和脂族酸的混合物，所述脱毒的水解产物溶液包含存在于所述起始木质纤维素水解产物溶液中的至少90％的总可发酵性糖和存在于所述起始木质纤维素水解产物溶液中的不超过40％的呋喃醛。
2.权利要求1的方法，其中所述含镁碱是氢氧化镁。
3.权利要求1的方法，其中所述含镁碱是碳酸镁。
4.权利要求1的方法，其中所述含镁碱是氧化镁。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述条件包括40℃至70℃之间的温度。
6.权利要求1-4任一项的方法，其中所述条件包括45℃至50℃之间的温度。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述条件包括6.2至9.5之间的pH。
8.权利要求1-6任一项的方法，其中所述条件包括6.5至8之间的pH。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述起始水解产物与所述含镁碱的混合在分批反应器中进行。
10.权利要求1-8任一项的方法，其中所述起始水解产物与所述含镁碱的混合在连续反应器中进行。
11.权利要求10的方法，其中所述连续反应器是活塞流反应器(PFR)。
12.权利要求10的方法，其中所述连续反应器是连续搅拌釜式反应器(CSTR)。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述起始水解产物与所述含镁碱的混合进行1小时至40小时之间的时段。
14.权利要求1-12任一项的方法，其中所述起始水解产物与所述含镁碱的混合进行2小时至12小时之间的时段。
15.权利要求1-12任一项的方法，其中所述起始水解产物与所述含镁碱的混合进行3小时至9小时之间的时段。
16.权利要求1-15任一项的方法，其中所述起始水解产物中总可发酵性糖的浓度在30g/L至160g/L之间。
17.权利要求1-15任一项的方法，其中所述起始水解产物中总可发酵性糖的浓度在40g/L至95g/L之间。
18.权利要求1-15任一项的方法，其中所述起始水解产物中总可发酵性糖的浓度在50g/L至70g/L之间。
19.权利要求1-18任一项的方法，其中所述呋喃醛包含糠醛和5-HMF。
20.权利要求19的方法，其中所述起始水解产物中糠醛的起始浓度在0.5g/L至10g/L之间。
21.权利要求19的方法，其中所述起始水解产物中糠醛的起始浓度在1.5g/L至5g/L之间。
22.权利要求19-21任一项的方法，其中所述起始水解产物中5-HMF的浓度在0.1g/L至5g/L之间。
23.权利要求19-21任一项的方法，其中所述起始水解产物中5-HMF的浓度在0.5g/L至2.5g/L之间。
24.权利要求1-23任一项的方法，其中所述脂族酸包含乙酸和乳酸。
25.权利要求24的方法，其中所述起始水解产物中乙酸的浓度在2g/L至17g/L之间。
26.权利要求24的方法，其中所述起始水解产物中乙酸的浓度在11g/L至16g/L之间。
27.权利要求24-26任一项的方法，其中所述起始水解产物中乳酸的浓度在0g/L至12g/L之间。
28.权利要求1-27任一项的方法，其中所述起始水解产物还包含酚物质。
29.权利要求28的方法，其中所述起始水解产物中酚物质的浓度在0.5g/L至5g/L之间。
30.权利要求1-29任一项的方法，其中所述可发酵性糖包括木糖、***糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖中的一种或多种。
31.权利要求1-30任一项的方法，其中所述脱毒的水解产物溶液包含不超过30％的存在于所述起始木质纤维素水解产物溶液中的呋喃醛。
32.权利要求1-30任一项的方法，其中所述脱毒的水解产物溶液包含不超过20％的存在于所述起始木质纤维素水解产物溶液中的呋喃醛。
33.权利要求1-30任一项的方法，其中所述脱毒的水解产物溶液包含不超过10％的存在于所述起始木质纤维素水解产物溶液中的呋喃醛。
34.权利要求1-33任一项的方法，其中所述脱毒的水解产物溶液包含至少90％的存在于所述起始水解产物溶液中的总可发酵性糖。
35.权利要求1-33任一项的方法，其中所述脱毒的水解产物溶液包含至少93％的存在于所述起始水解产物溶液中的总可发酵性糖。
36.权利要求1-33任一项的方法，其中所述脱毒的水解产物溶液包含至少95％的存在于所述起始水解产物溶液中的总可发酵性糖。
37.权利要求1-33任一项的方法，其中所述脱毒的水解产物溶液包含至少99％的存在于所述起始水解产物溶液中的总可发酵性糖。
38.权利要求1-37任一项的方法，其中向所述水解产物溶液添加的含镁碱的量在2g/1kg水解产物至200g/1kg水解产物之间。
39.权利要求1-37任一项的方法，其中向所述水解产物溶液添加的含镁碱的量在40g/1kg水解产物至160g/1kg水解产物之间。
40.权利要求1-39任一项的方法，其还包括添加酸以将所述脱毒的水解产物的pH降低到3.5至8之间的pH的步骤。
41.权利要求1-39任一项的方法，其还包括添加酸以将所述脱毒的水解产物的pH降低到4至7之间的pH的步骤。
42.权利要求1-41任一项的方法，其中所述起始水解产物溶液通过水解木质纤维素生物质来制备。
43.权利要求42的方法，其中所述木质纤维素生物质选自象草、能源甘蔗、高粱、芦竹、糖用甜菜、柳枝稷、甘蔗渣、稻秆、芒草、柳枝稷、麦秆、木材、木材废料、纸张、废纸、农业废料、城市废料、桦木、燕麦、玉米秸秆、桉木、柳木、杂交杨木、短周期木本作物、针叶软木和作物残茬。
44.权利要求1-43任一项的方法，其还包括在所述混合步骤之前浓缩水解产物溶液以产生所述起始水解产物溶液的步骤。
45.一种降低木质纤维素水解产物对发酵生物体的毒性的方法，所述方法包括将起始木质纤维素水解产物溶液与选自氢氧化镁、碳酸镁和氧化镁的含镁碱在40℃至70℃之间的温度和6.5至8之间的pH下混合至少1小时、至少4小时、至少10小时或至少20小时的时段，由此降低所述木质纤维素水解产物的毒性的步骤，所述起始木质纤维素水解产物溶液包含可发酵性糖、呋喃醛和脂族酸的混合物。
46.权利要求45的方法，其中所述含镁碱是氢氧化镁。
47.权利要求45的方法，其中所述含镁碱是碳酸镁。
48.权利要求45的方法，其中所述含镁碱是氧化镁。
49.权利要求45-48任一项的方法，其中所述混合进行至多4小时的时段。
50.权利要求45-49任一项的方法，其中所述pH在7至8的范围内。
51.权利要求45-50任一项的方法，其中所述温度在40℃至70℃之间。
52.权利要求45-50任一项的方法，其中所述温度在40℃至55℃之间。
53.权利要求45-52任一项的方法，其中所述起始水解产物与所述含镁碱的混合在分批反应器中进行。
54.权利要求45-52任一项的方法，其中所述起始水解产物与所述含镁碱的混合在连续反应器中进行。
55.权利要求54的方法，其中所述连续反应器是活塞流反应器(PFR)。
56.权利要求55的方法，其中所述连续反应器是连续搅拌釜式反应器(CSTR)。
57.一种生产发酵产物的方法，所述方法包括在通过权利要求1-56任一项的方法生产的脱毒的水解产物溶液存在的条件下、在生产乙醇的条件下培养发酵微生物由此生产所述发酵产物的步骤。
58.权利要求57的方法，其还包括从所述培养物中分离所述发酵产物。
59.权利要求57或58的方法，其中所述发酵生物体包括大肠埃希式杆菌(Escherichia coli)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(acillus stearothermophilus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、热纤梭菌(Clostridia thermocellum)、Thermoanaerobacterium saccharolyticum和树干毕赤酵母(Pichiastipitis)中的一种或多种。
60.权利要求57-59任一项的方法，其还包括在所述培养步骤之前生产所述脱毒的水解产物。
61.权利要求57-59任一项的方法，其中所述发酵产物是乙醇。
62.一种用于连续降低水解产物中毒素的量的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)将所述水解产物的第一连续料流流入到连续反应器中；
(b)将含镁碱的第二连续料流流入到所述连续反应器中；
(c)将所述水解产物与所述含镁碱在所述连续反应器或一系列连续反应器中混合历时足以降低所述水解产物中毒素的量的时段；以及
(d)将所述水解产物流出所述连续反应器或所述一系列连续反应器。
63.权利要求62的方法，其中所述含镁碱选自氢氧化镁、碳酸镁和氧化镁。
64.权利要求63的方法，其中所述含镁碱是氢氧化镁。
65.权利要求62-64任一项的方法，其中所述反应器是活塞流反应器(PFR)。
66.权利要求62-64任一项的方法，其中所述反应器是连续搅拌釜式反应器(CSTR)。
67.权利要求62-66任一项的方法，其还包括在步骤(a)之前浓缩所述水解产物。
68.一种用于连续生产发酵产物的方法，所述方法包括：
(a)将水解产物的第一连续料流流入到连续反应器中；
(b)将含镁碱的第二连续料流流入到所述连续反应器中；
(c)将所述水解产物与所述含镁碱在所述连续反应器或一系列连续反应器中混合历时足以降低所述水解产物中呋喃醛的量的时段；
(d)将所述水解产物流出所述连续反应器或所述一系列连续反应器；
(e)降低所述水解产物的pH；以及
(f)将所述水解产物流入到含有发酵微生物的发酵容器中，由此生产所述发酵产物。
69.权利要求68的方法，其中所述含镁碱选自氢氧化镁、碳酸镁和氧化镁。
70.权利要求69的方法，其中所述含镁碱是氢氧化镁。
71.权利要求68-70任选的方法，其中所述反应器是活塞流反应器(PFR)。
72.权利要求68-70任一项的方法，其中所述反应器是连续搅拌釜式反应器(CSTR)。
73.权利要求68-72任一项的方法，其还包括在步骤(a)之前浓缩所述水解产物。
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