CN104245599A - 用于检测辅酶q10的方法和试剂盒 - Google Patents

用于检测辅酶q10的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了易于适应于高通量筛选方法的用于快速和定量提取和检测样品中辅酶Q10的方法。本发明还提供了用于实施本发明的方法的试剂和试剂盒。

Description

用于检测辅酶Q10的方法和试剂盒
相关申请
本申请要求2012年3月2日提交的61/606019号美国临时申请的优先权，其全部内容在此通过引用并入本文。
发明背景
辅酶Q10，本文也称为CoQ10、泛醌或泛癸利酮，是一种常用的营养补充物，并可以作为维生素类补充剂在营养品商店、健康食品商店、药店等处找到其胶囊的形式，以通过泛醇(CoQ10的还原形式)的抗氧化性能帮助保护免疫***。CoQ10在人体的大部分组织和其他哺乳动物的组织中普遍发现。CoQ10是高度亲脂性的，并且在大部分不溶于水。不溶性与烃性质的50个碳原子的类异戊二烯侧链有关，如CoQ10的如下结构中所示。
辅酶Q10(CoQ10)是线粒体中氧化磷酸化机制的有机组成部分，并与生物膜和细胞的氧化还原状态的动态平衡相关。CoQ10的还原形式(CoQ10H2)参与许多重要的生化功能，包括作为抗氧化剂、产生ATP和***膜脂以保持结构。
发明概述
研究表明，总CoQ10(T-CoQ10)中CoQ10H2的较低百分比与线粒体细胞病、糖尿病、心脏病、帕金森氏病和癌症相关。最近的研究还表明，降低的CoQ10水平与服用他汀类药物的患者中***癌的风险增加和黑色素瘤患者中转移的风险增加有关。这就强调了开发稳定、准确、灵敏和特异的CoQ10和CoQ10H2测量方法的重要性。本发明提供了一种易于适应于高通量筛选方法的用于快速和定量的提取和检测样品中CoQ10的方法。本发明还提供了用于实施本发明方法的试剂和试剂盒。
在一个方面，本发明提供了一种用于测定样品中的辅酶Q10(CoQ10)的量的方法，包括向样品中加入第一提取缓冲液和第二提取缓冲液，其导致样品的相分离；和光谱学分析第二提取层来测定CoQ10的量。
在另一个方面，本发明还提供了用于测定样品中的CoQ10的量的方法，包括向样品中加入第一提取缓冲液和第二提取缓冲液；混合样品；和分析第二提取层以测定CoQ10的量，其中所述第一提取缓冲液和第二提取缓冲液的单次提取比使用单独甲醇提取导致检测到至少2倍的CoQ10量。
在另一个方面，本发明提供了用于测定样品中的CoQ10的量的方法，包括向样品中加入第一提取缓冲液；加热并混合样品；向样品中加入第二提取缓冲液，其导致样品的相分离；加热并混合样品；冷却样品至环境温度；及分析第二提取缓冲液层以测定样品中CoQ10的量。
而在另一个方面，本发明提供了用于测定样品中的CoQ10的量的方法，包括向样品中加入第一提取缓冲液；加热并混合样品；向样品中加入第二提取缓冲液，其导致样品的相分离；加热并混合样品；冷却样品至环境温度；及对第二提取缓冲液层进行光谱分析以测定样品中CoQ10的量，其中提取缓冲液的单次提取比使用单独甲醇提取随后液相色谱/质谱/质谱(LC/MS/MS)导致提取到至少2倍的CoQ10量。
在本发明的某些实施方式中，在样品中检测到的CoQ10的量是由光谱分析法光谱学地测定的。在本发明的某些实施方式中，CoQ10的量是用LC/MS/MS检测的。在本发明的某些实施方式中，光谱学地测定使用第一提取缓冲液和第二提取缓冲液提取的CoQ10的量，和使用LC/MS/MS测定用单独甲醇提取检测的CoQ10的量。
在本发明的某些实施方式中，所述方法是高通量筛选分析方法的部分。在本发明的某些实施方式中，整个方法是自动化完成的。在本发明的某些实施方式中，整个方法是在短的时间段中完成的。例如，使用光谱分析进行该方法和样品中CoQ10量的测定在使用LC/MS/MS进行分析所需的大约一半的时间或者更少、大约四分之一的时间或更少、或约十分之一的时间或者更少的时间内完成。在某些实施方式中，将用光谱检测方法对一组样品进行分析所需的时间量与用LC/MS/MS对一组样品进行分析的时间量相比较。在某些实施方式中，用光谱检测方法对一组样品进行分析所需的时间量少于5小时、少于4小时、少于3小时、少于2小时、少于30分钟、少于15分钟、少于10分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟、少于1分钟或少于30秒。
在本发明的某些实施方式中，与使用单独甲醇提取随后LC/MS/MS的CoQ10检测在重复样品中检测到的CoQ10的总量相比，其中所述样品使用第一提取缓冲液和第二提取缓冲液提取并且CoQ10的量用光谱学测定，在样品中检测到的CoQ10的总量为至少2倍。例如，光谱学测定的CoQ10的总量是使用单独甲醇提取随后LC/MS/MS的CoQ10检测量的至少5倍、至少10倍、至少15倍或至少25倍。
在本发明的某些实施方式中，第二提取缓冲液包含非极性溶剂。在本发明的某些实施方式中，第二提取缓冲液包含有机溶剂。在本发明的某些实施方式中，第二提取缓冲液包含选自于苯、甲苯、二甲苯、己烷、庚烷、辛烷、环己烷、1,4-二氧六烷、氯仿、二***、二异丙醚和二异丁基醚、四氯化碳、二甲基甲酰胺(DMF)、氯甲烷和二氯甲烷或它们的任何组合中的溶剂。在本发明的某些实施方式中，第二提取缓冲液包含烷烃。在本发明的某些实施方式中，第二提取缓冲液包含己烷。在本发明的某些实施方式中，第二提取缓冲液包含乙腈。在本发明的某些实施方式中，第二提取缓冲液包含异丙醇。
在本发明的某些实施方式中，所述第一提取缓冲液包含极性质子溶剂。在本发明的某些实施方式中，所述第一提取缓冲液包含有机溶剂。在本发明的某些实施方式中，所述第一提取缓冲液包含选自于甲酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇，乙醇、甲醇、乙酸、三氯乙酸(TCA)以及水或它们的任何组合中的溶剂。在本发明的某些实施方式中，所述溶剂包含醇。在本发明的某些实施方式中，所述醇是甲醇。
在本发明的某些实施方式中，所述第一提取缓冲液包含表面活性剂。
在本发明的某些实施方式中，所述第一提取缓冲液包含去垢剂。在本发明的某些实施方式中，该去垢剂是温和的去垢剂。在本发明的某些实施方式中，第一提取缓冲液为水性溶液。在本发明的某些实施方式中，第一提取缓冲液包含类固醇酸。在本发明的某些实施方式中，所述类固醇酸是胆汁酸。在本发明的某些实施方式中，所述胆汁酸包括选自于牛黄胆酸(taurochloric acid)、甘氨胆酸、胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸和石胆酸或它们的任何组合中的酸。在本发明的某些实施方式中，所述胆汁酸包括脱氧胆酸。在本发明的某些实施方式中，所述脱氧胆酸是盐。在本发明的某些实施方式中，脱氧胆酸盐包含I族金属的无机离子。在本发明的某些实施方式中，脱氧胆酸盐的无机离子包括选自于Li+、Na+和K+的盐的无机离子。在本发明的某些实施方式中，脱氧胆酸盐的无机离子包括作为钠离子的无机离子。
在本发明的某些实施方式中，所述样品包括生物样品。在本发明的某些实施方式中，所述生物样品是基于细胞的样品。在本发明的某些实施方式中，所述样品包括哺乳动物样品或两栖动物样品。在本发明的某些实施方式中，所述样品包括选自于人类样品、非人灵长类动物样品和啮齿动物样品的样品。在本发明的某些实施方式中，所述样品是来自选自小鼠、大鼠、豚鼠、兔和人的受试者的样品。
在本发明的某些实施方式中，所述光谱分析通过使用选自于吸收光谱法、荧光X射线光谱法、火焰光谱法、可见光谱法、紫外光谱法、红外光谱法、近红外光谱法、拉曼光谱法、相干反斯托克斯拉曼光谱法(CARS)、核磁共振光谱法、光子发射光谱法和穆斯堡尔光谱的光谱技术进行。在本发明的某些实施方式中，所述光谱技术是紫外光谱法。在本发明的某些实施方式中，紫外光谱法是在270nm至280nm的一个或多个波长处进行。在本发明的某些实施方式中，该紫外光谱法是在273nm至277nm的一个或多个波长处进行。在本发明的某些实施方式中，该紫外光谱法是在275nm波长处进行。在本发明的某些实施方式中，该紫外光谱法是在270nm至280nm之间的波长处进行，例如270nm、271nm、272nm、273nm、274nm、275nm、276nm、277nm、278nm、279nm或280nm。
在本发明的某些实施方式中，所述第一提取缓冲液的体积与第二提取缓冲液的体积之比是5:1至1:1(v/v)(例如，5:1、4:1、3:1、2:1或1:1，或仅由这些值包括的任何范围，例如4:1至1:1或4:1至2:1)。
在本发明的某些实施方式中，所述表面活性剂或去垢剂与第一提取缓冲液的体积的比率为50:1至1:1(v/v)(例如，大约45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1.15:1、10:1、5:1、2:1、1:1；或仅由那些值值包括的任何范围，例如，40:1至10:1、40:1至5:1、40:1至2:1、40:1至1:1、35:1至10:1、35:1至5:1、35:1至5:1、35:1至1:1、25:1至10:1、25:1至5:1、20:1至5:1、15:1至5:1、10:1至5:1、10:1至2:1、或10:1至1:1)。
在本发明的某些实施方式中，在添加第一提取缓冲液、第二提取缓冲液或第一和第二提取缓冲液两者后将样品加热至50-100℃，例如约50-100℃、约55-90℃、约60-85℃、约60-80℃、约55-75℃、约60-70℃、约62-68℃、约63-67℃、约64-66℃或约65℃。在某些实施方式中，将样品加热到约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃或约70℃。在某些实施方式中，在添加第一提取缓冲液和第二提取缓冲液后，所述样品被加热至相同的温度。在某些实施方式中，在添加第一提取缓冲液和第二提取缓冲液后，所述样品被加热至不同的温度。在某些实施方式中，所述的样品被加热至少5秒、至少10秒、至少15秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少60秒、至少75秒、至少90秒、至少105秒或至少120秒的时间，也就是小于该范围的上限但大于零的一个秒数。
在本发明的某些实施方式中，添加第一提取缓冲液和第二提取缓冲液后，所述样品被加热相同的时间量。在某些实施方式中，在添加第一提取缓冲液和第二提取缓冲液后，所述样品被加热不同的时间量。
在某些实施方式中，与没有被加热的对照样品相比，加热样品提高CoQ10的提取至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少50％。
在本发明的某些实施方式中，所述样品通过机械搅拌混合。在本发明的某些实施方式中，所述样品通过超声处理混合。在本发明的某些实施方式中，所述样品通过磁力搅拌混合。在某些实施方式中，样品在加入所述第一提取缓冲液后混合。在某些实施方式中，样品在加入所述第二提取缓冲液后混合。在某些实施方式中，样品在加入所述第一提取缓冲液和所述第二提取缓冲液后混合。
在本发明的某些实施方式中，在加入所述第二提取缓冲液后向样品中加入无机盐。在某些实施方式中，无机盐包括NaCl。在某些实施方式中，在加入第二提取缓冲液后，向样品添加饱和的盐水溶液。在某些实施方式中，所述盐被添加至约1mM至约50mM的终浓度，即至约1mM至约10mM、约1mM至约20mM、约1mM至约30mM、约1mM至约40mM、约5mM至约50mM、约10mM至约40mM、约20mM至约50mM、约10mM至约25mM、约15mM至约35mM的浓度；或仅由这些值包括的任何值的范围，如在约10mM至20mM之间。
在本发明的某些实施方式中，在第二提取缓冲液的光谱分析前过滤所述样品。
在本发明的某些实施方式中，在10分钟内、在5分钟内、1分钟内或在30秒内完成整个方法。
本发明提供了用于实施前述权利要求中任一项所述的方法的试剂盒。在某些实施方式中，所述试剂盒包括以下的至少两个：第一提取缓冲液，第二次提取缓冲液。在另一个方面，该试剂盒还包括CoQ10。在另一个方面，所述试剂盒包含第一提取缓冲液，第二提取缓冲液和使用说明书。
在另一个方面，本发明提供了使用氧化的和还原的氘化CoQ10内标的新方法。在某些实施方式中，本发明提供了用于测定CoQ10和CoQ10H2的量的LC-MS/MS方法。
在一些实施方式中，本发明提供了一种用于测定样品中辅酶Q10(CoQ10)的量的方法，所述方法包括：
a)向样品中加入已知量的氘化的辅酶Q10(CoQ10-d6)；
b)通过质谱检测CoQ10和CoQ10-d6；和
c)通过将其与已知量的检测到的CoQ10-d6相比较来测定检测到的CoQ10的量。
在一些实施方式中，本发明还提供了一种用于测定样品中还原形式的CoQ10(CoQ10H2)的量的方法，所述方法包括：
a)向样品中加入已知量的还原形式的氘化辅酶Q10(CoQ10H2-d6)；
b)通过质谱检测CoQ10H2和CoQ10H2-d6；和
c)通过将其与已知量的检测到的CoQ10H2-d6相比较来测定检测到的CoQ10H2的量。
在其他的实施方式中，本发明还提供了一种用于同时测定样品中CoQ10和CoQ10H2的量的方法，所述方法包括：
a)向样品中加入已知量的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6；
b)通过质谱检测CoQ10、CoQ10H2、CoQ10-d6和CoQ10H2-d6；和
c)通过将其与已知量的检测到的CoQ10H2-d6相比较来测定检测到的CoQ10的量；和
d)通过将其与已知量的检测到的CoQ10H2-d6相比较来测定检测到的CoQ10H2的量。
而在其它的实施方式中，本发明提供了一种用于测定样品中CoQ10H2氧化的程度的方法，所述方法包括：
a)向样品中加入已知量的CoQ10H2-d6和/或CoQ10-d6；
b)通过质谱测量样品中CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相对量；和
c)将CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的理论相对量与在步骤b中测得的CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相对量相比较。
在另一个方面，本发明提供了一种用于测定样品中CoQ10H2氧化的程度的方法，所述方法包括：
a)向样品中加入已知量的CoQ10H2-d6和/或CoQ10-d6；
b)在第一时间和第二时间通过质谱测量样品中CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相对量
c)将在第一时间相同样品中存在的CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的理论相对量与在第二时间相同样品中存在的CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相对量相比较；
其中在第一时间和第二时间的CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相对量的改变指示样品承受的氧化的程度。
在一些实施方式中，通过将CoQ10-d6与一种或多种还原剂进行反应而获得CoQ10H2-d6。在一个具体实施方式中，还原剂是硼氢化钠。
在一些实施方式中，在样品采集后立即将CoQ10-d6和/或CoQ10H2-d6加入到样品中。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于测定样品中的CoQ10的量的方法，所述方法包括：
a)提供样品；
b)向样品中加入已知量的CoQ10-d6；
c)提取样品；
d)任选地将样品进行液相色谱分析；
e)通过质谱检测CoQ10和CoQ10-d6；和
f)通过将其与已知量的检测到的CoQ10-d6相比较来测定检测到的CoQ10的量。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于测定样品中CoQ10H2的量的方法，所述方法包括：
a)提供样品；
b)向样品中加入已知量的CoQ10H2-d6；
c)提取样品；
d)任选地将样品进行液相色谱分析；
e)通过质谱检测CoQ10H2和CoQ10H2-d6；和
f)通过将其与已知量的检测到的CoQ10H2-d6相比较来测定检测到的CoQ10H2的量。
而在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于测定样品中的CoQ10和CoQ10H2的量的方法，所述方法包括：
a)提供样品；
b)向样品中加入已知量的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6；
c)提取样品；
d)任选地将样品进行液相色谱；
e)通过质谱检测CoQ10、CoQ10-d6、CoQ10H2和CoQ10H2-d6；
f)通过将其与已知量的检测到的CoQ10-d6相比较来测定检测到的CoQ10的量；和
g)通过将其与已知量的检测到的CoQ10H2-d6相比较来测定检测到的CoQ10H2的量。
在一些实施方式中，步骤c包括向样品中加入提取缓冲液，例如，第一提取缓冲液。在一个具体的实施方式中，该提取缓冲液，例如，第一提取缓冲液含有1-丙醇。在其它实施方式中，提取缓冲液包含异丙醇、甲醇、乙醇、乙腈或丙酮。在一个实施方式中，用提取缓冲液例如1-丙醇提取后通过质谱分析用于提取的溶剂。
在进一步的实施方式中，步骤c还包括加入第二提取缓冲液，其导致样品的相分离。在一个实施方式中，步骤c包括：
i.向样品中加入第一提取缓冲液和第二提取缓冲液；
ii.混合样品；和
iii.将第二提取层用于后续步骤。
在一个实施方式中，步骤c包括：
i.向样品中加入第一提取缓冲液；
ii.加热并混合样品；
iii.向样品中加入第二提取缓冲液，其导致样品的相分离；
iv.加热并混合样品；
v.冷却样品至环境温度；和
vi.将第二提取缓冲液层用于后续步骤。
在一些实施方式中，在减弱的光下实施步骤b-d。在一些实施方式中，使用预冷的溶剂实施步骤b-d。在一些实施方式中，使用预冷的低温模块实施步骤b-d。在一些实施方式中，将该低温模块预冷却约1小时至约48小时，例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约28小时、约32小时、约36小时、约40小时、约44小时或约48小时。
在某些实施方式中，该样品是生物样品。在一个具体的实施方式中，所述生物样品是血浆。在另一个具体的实施方式中，所述生物样品是血清。在另一个具体的实施方式中，所述生物样品是组织。而在另一个实施方式中，所述生物样品是体液，如血液、尿液、唾液或鼻粘液。在一个实施方式中，所述生物样品是人类样品。
在一些实施方式中，本发明还提供了用于实施本发明的质谱方法的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包含提取缓冲液，例如，1-丙醇。在一些实施方式中，所述试剂盒包含CoQ10-d6。在另一个实施方式中，所述试剂盒包含CoQ10-d6和一种或多种还原剂。在一个具体的实施方式中，还原剂是硼氢化钠。在进一步的实施方式中，所述试剂盒包含提取缓冲液(例如1-丙醇)、CoQ10-d6和还原剂(例如硼氢化钠)。
以下提供了其它的实施方式。
附图简要说明
图1显示了在乙腈、2-丙醇和己烷每一个中OD275值针对指示浓度的CoQ10绘制的代表性标准曲线。提供了用于每条线的方程。
图2显示了在己烷中OD275值针对指示浓度的CoQ10绘制的代表性标准曲线。
图3A-E显示了(A)未处理的HepG2细胞；(B)用丙醇中50μM的CoQ10处理的HepG2细胞；(C)用丙醇中100μM的CoQ10处理的HepG2细胞；(D)用CoQ10递送制剂中50μM的CoQ10处理的HepG2细胞；或(E)用CoQ10递送制剂中100μM的CoQ10处理的HepG2细胞的一式三份CoQ10浓度(pM/细胞)和平均值的代表性结果的图表；所述细胞在CoQ10的存在下培养指示的时间并使用本发明的方法进行提取。
图4显示了CoQ10-和CoQ10H2的标准曲线，样品用作为稀释剂的己烷样品和己烷重构的CoQ10-和CoQ10H2储备液制备。
图5显示了CoQ10-和CoQ10H2的标准曲线，样品使用作为稀释剂的水和甲醇重构的CoQ10-和CoQ10H2储备液制备。
图6显示了血浆样品中总CoQ10的标准曲线和代表性色谱图。
图7显示了细胞上清液中总CoQ10的代表性色谱图。
图8显示了洗鼻液中总CoQ10的标准曲线和代表性色谱图。
图9显示了组织样品中总CoQ10的标准曲线和代表性色谱图。
图10显示了血清样品中CoQ10-和CoQ10H2的标准曲线。
图11显示了血清样品中CoQ10-和CoQ10H2的代表性色谱图。
图12显示了血浆样品中CoQ10-和CoQ10H2的标准曲线。
图13显示了血浆样品中CoQ10-和CoQ10H2的代表性色谱图。
详细说明
本发明涉及用于从生物样品，优选基于细胞的样品，快速和有效地提取CoQ10以(优选定量地)检测样品中CoQ10的方法。该方法可以容易地适应用于高通量和/或自动化的筛选方法。
为了优化可读性并帮助理解本文所述的本发明，也许考虑一下本文中所使用的术语和短语的下列定义是有益的。
I.定义
本发明提供的检测方法可用于检测辅酶Q10(CoQ10)和它的结构变体。例如，CoQ10可能以完全氧化的形式(泛醌)、部分氧化的形式(泛半醌)和完全还原的形式(泛醇)存在。此外，虽然如上所示的CoQ10有10个类异戊二烯单元，本文提供的方法可用于检测具有大约8-12个(例如，8、9、10、11、12)个类异戊二烯单元的结构上类似于CoQ10的化合物，因为环结构是使用本发明优选的分光光度法进行检测的。
如本文所使用的总“CoQ10”指的是样品中存在的氧化的和还原的CoQ10的总量。
如本文使用的“溶剂”通常理解为一种液体，其溶解固体或液体而产生溶液。在指定的温度下，溶质可溶解于一定体积的溶剂中。如本文所使用的，溶剂不必完全溶解所有样品，只要不溶解的成分不干扰样品中CoQ10的提取和检测。例如，当使用基于全细胞的样品时，可以形成包括蛋白质和/或核酸的沉淀物。
基于化学特性、溶剂化/反应机制、总电荷、电荷分布等，溶剂可以细分为各种不同的组。例如，溶剂可以分为非极性溶剂和极性溶剂的组，极性溶剂可进一步细分为极性非质子溶剂和极性质子溶剂。
下面阐述的溶剂是按照增加的极性排序的，如通过介电常数所定义的。高于水的溶剂性质以粗体显示。
表1.有机溶剂
“非极性溶剂”是在其中(几乎)没有键的极性，或者其中键对称地排列的溶剂，从而导致在所有方向上平衡的电荷引力。例如，氯仿具有相对强的极性键，然而，偶极矩相等的三个极性键的三角形平面排列使得该分子是非极性的。可选地，在烷烃中，键具有弱偶极矩并且几乎没有键极性，使得它们是非极性的。非极性溶剂包括，但不限于，链烷烃、苯、甲苯、二甲苯、己烷、庚烷、辛烷、环己烷、1,4-二氧六环、氯仿、***、二异丙醚和二异丁基醚。
烷烃(也称为链烷烃或饱和烃)是仅由元素碳(C)和氢(H)组成的化合物(即，碳氢化合物)，其中这些原子仅由单键连接在一起(即它们是饱和化合物)。烷烃属于其成员相差14的恒定相对分子质量的同系有机化合物。每一个碳原子必须有4个键(不管是C-H或C-C键)，并且每个氢原子必须连接到一个碳原子(H-C键)。其结果是，烷烃通常是非常稳定的，并且几乎没有生物活性。一系列相连的碳原子被称为碳骨架或碳主链。在一般情况下，碳原子的数目通常被用来定义烷烃的大小(例如，C2烷烃)。
最简单的烷烃是甲烷，CH4。在理论上对于可以被连接在一起的碳原子的数目是没有限制的，唯一的限制是该分子是饱和的，并且是烃。饱和的油和蜡是较大的烷烃的例子，其中碳骨架中的碳数目往往是大于10的。如本文所用的，低级烷烃具有1至6个碳原子。高级烷烃具有至少7个碳原子，优选7至12个碳原子。如本文中所使用的，中级烷烃具有4-8个碳原子，或在某些实施方式中，5、6或7个碳原子。
直链烷烃通常由前缀n-(代表正的)表示，其中存在非线性的异构体。虽然这不是严格必需的，该用法仍然在其中直链和支链异构体之间存在重要的性能差异的情况下是普遍的，例如，n-己烷或2-或3-乙基戊烷。该系列的成员(以碳原子数计)的命名如下：甲烷，CH4-一个碳和四个氢原子；乙烷，C2H6-两个碳和六个氢；丙烷，C3H8-三个碳和8个氢；丁烷，C4H10-四个碳和10个氢；戊烷，C5H12-五个碳和12个氢；和己烷，C6H14-六个碳和14个氢。如本文中所使用的，除非使用n-前缀，烷烃被理解为是指具有指定数目的碳原子的一种或多种碳化合物，且可包括所确定的烷烃的混合群体(例如，己烷被理解为包括n-己烷、2-甲基戊烷、3-甲基戊烷和环己烷中的任何一种；以及各种己烷以任何比率的任何组合)。
本文所用的“质子溶剂”通过氢键使阴离子强烈溶剂化。质子溶剂具有酸性氢，尽管它们可能是非常弱的酸。更一般地，含有可离解的H+的任何分子溶剂被称为极性质子溶剂。这类溶剂的分子可以贡献H+(质子)。质子溶剂通过使与阳离子的未共享电子对和通过与阴离子的氢键结合来稳定离子。
“极性质子溶剂”有利于SN1反应机制,因为溶剂具有结合于氧(如羟基中)或氮(如在胺基中)的氢原子。如本文所使用的极性质子溶剂往往具有高的介电常数和高的极性。极性质子溶剂包括醇类。
“醇”是其中的羟基官能团(-OH)被连接到碳原子上的任何有机化合物，其中该碳原子通常连接其它碳原子或氢原子。醇分子中的羟基(OH)官能团(具有-OH基团中的可离解质子)使得醇成为极性质子溶剂。
醇包括，例如，具有通式CnH2n+1OH的非环状醇，其中n≥1。后缀-ol出现在其中羟基基团是具有最高优先级的官能团的所有的物质的IUPAC化学名称中；在其中存在更高优先级的官能团的物质中，前缀羟基-(hydroxy-)将出现在IUPAC命名中。在非***性的名称(例如对乙酰氨基酚或胆固醇)中的后缀-ol通常也表示该物质包括羟基官能团，并因此可以被称为醇，但许多物质(如柠檬酸、乳酸或蔗糖)含有一个或多个羟基官能团。如本文所用的，醇可以通过存在的碳数目而表征，低级醇具有1-6个碳(即在上式的非环状醇中n＝1-6)，中级醇具有4-8个碳，和高级醇具有至少7个碳，优选具有7-12个碳。一些醇包括，但不限于，甲醇(CH3OH)、乙醇(C2H5OH)、丙醇(C3H7OH)和戊醇(C5H11OH)。除非使用n-前缀，如本文中所使用的，醇应被理解为是指具有指定数目的碳的一种或多种碳化合物，并且可以包括所确定的醇的混合群体。
“极性非质子溶剂”是具有与质子溶剂相同的离子离解力，但缺乏酸性氢的溶剂。因此，极性非质子溶剂不使阴离子溶剂化，这可能抑制后续的化学反应。这些溶剂通常具有中间介电常数和极性。典型的非质子溶剂不显示氢键结合和不具有酸性氢，但能够稳定离子。亲核试剂在非质子溶剂中比在质子溶剂中更具反应性。
“有机溶剂”是其中包括至少一个碳原子的溶剂。
如本文中所使用的“去垢剂”是易于在水中形成胶束的两性小分子。通常去垢剂根据它们的亲水/疏水特性和离子性基团被归类。去垢剂通过限制聚集及溶解脂质和其他疏水性分子可用于膜的透化作用/溶解作用，器官或组织的去细胞化，保持纯化蛋白质的稳定性。去垢剂的实例可以在例如，2010McCutcheon's Emulsifiers&Detergents NorthAmerican edition(McCutcheon's Emulsifiers and Detergents)中找到，其通过引用并入本文。“温和的去垢剂”通常被认为是不破坏溶液中蛋白质的结构的去垢剂。这使得可以测定蛋白质的功能。“温和的去垢剂”通常具有有利于一个或另一个(如大的头基，短脂族链)的极性/非极性侧链比率。在一般情况下，非离子型和两性离子型去垢剂比离子型去垢剂更加温和。在离子型去垢剂中，胆汁酸和胆汁盐被认为是温和的去垢剂。阴离子去垢剂不是温和的去垢剂。
离子型去垢剂的特征在于它们的带电的亲水性头基。离子型去垢剂可以是阴离子型或阳离子型的。离子型去垢剂倾向于破坏分子间和分子内的蛋白质-蛋白质相互作用。阳离子去垢剂包括，但不限于，包含所选择的季胺的阳离子表面活性剂溶液。所选择的季胺通过季胺氢氧化物和磷酸、硫酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸和柠檬酸组成的组中的酸的反应产生，例如，烷基三甲基铵或烷基苄基二甲基铵，其中所述的烷基含有12、14、16或18个碳。离子型去垢剂包括脱氧胆酸、十二烷基硫酸钠(SDS)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
非离子型(或两性离子)去垢剂的特征在于它们不带(净)电荷的亲水性头基。它们是基于聚乙二醇(即和系列)，糖苷(如辛基硫代葡萄糖苷、麦芽糖苷)，胆汁酸如脱氧胆酸(DOC)，脂类()或膦氧化物(例如，无机磷化合物如磷酰三氯(CL3P＝O)或具有式OPR3的有机磷化合物，其中R＝烷基或芳基)。其他的非离子型去垢剂包括乙氧基化脂肪醇醚和月桂基醚、乙氧基化烷基酚、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、改性的乙氧基化和/或丙氧基化直链醇、聚乙二醇单油酸酯化合物、聚山梨酯化合物和酚类脂肪醇醚。
本文所用的“表面活性剂”被理解为是降低液体的表面张力的化合物，其使得更容易扩散并且降低两种液体间或者液体和固体之间的界面张力。表面活性剂还可以充当去垢剂、润湿剂、乳化剂、发泡剂和分散剂中的一种或多种。
术语表面活性剂是表面活性试剂的混合。表面活性剂通常是两性的有机化合物，这意味着它们同时含有疏水性基团(尾)和亲水性基团(头)。因此，表面活性剂分子中同时含有水不溶性(或油溶性)成分和水溶性成分。表面活性剂分子迁移到水表面，其中不溶性的疏水性基团可以延伸到整体水相的外面，或者进入空气或者(如果水与油混合的话)进入到油相中，而水溶性的头基保留在水相中。这种表面活性剂分子在表面处的排列和聚集起到改变水在水/空气或水/油界面处的表面性质的作用。
胆汁酸是通过形成胶束使脂肪溶剂化的类固醇酸。胆汁酸可用作去垢剂和表面活性剂。胆汁酸是指质子化(-COOH)的形式。胆汁盐指的是去质子化的或离子化(-COO-)的形式，并且通常与甘氨酸或牛磺酸偶联。偶联的胆汁酸在中性pH下对乳化油脂更有效，因为它们比未偶联的胆汁酸更加离子化。胆汁盐常用作去垢剂以在蛋白质纯化和组织化学方法中使脂质溶剂化。胆汁盐也可以用作表面活性剂。除非上下文中另有明确说明，如本文使用的胆汁酸被理解为包括胆汁酸盐。胆汁酸包括，但不限于，胆酸、鹅脱氧胆酸、乙醇酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和石胆酸。在研究中脱氧胆酸用作去垢剂以用于分离膜结合蛋白。脱氧胆酸钠(脱氧胆酸的钠盐)经常被用来作为生物去垢剂来裂解细胞及增溶细胞和膜成分。
“临界胶束浓度”或“CMC”指的是能够形成胶束的两亲性分子如表面活性剂或去垢剂的内在特性，以及起到自发和动态形成胶束的功能所需的胆汁酸量的溶液中两性分子的内在特性。表面活性剂(或能够形成胶束的任何两亲分子)一旦引入到***中，他们开始分配成界面，从而通过a)降低界面能量(按面积×表面张力计算的)和b)通过从水的接触中除去表面活性剂的疏水部分降低***的自由能。随后，当表面活性剂的表面覆盖率增加和表面自由能(表面张力)减小时，表面活性剂聚集成胶束，从而通过减小表面活性剂的疏水部分与水的接触面积降低***的自由能。当达到CMC时，表面活性剂的任何进一步增加会提高胶束的数目。在本文所提供的方法中，表面活性剂使用的典型浓度使得在样品中达到临界胶束浓度。
如本文所用的“盐”是离子化合物，其中离子的比例使得电荷抵消，从而使总体化合物是电中性的。“无机盐”包括，例如包括氧化物、碳酸盐、硫酸盐和卤化物的盐。卤化物包括氟化物(F-)、氯化物(Cl-)、溴化物(Br-)、碘化物(I-)和砹化物(At-)。无机卤化物盐包括，例如，氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、碘化钾(KI)、氯化锂(LiCl)、氯化铜(II)(CuCl2)、氯化银(AgCl)和氟化氯(ClF)。如本文所用的，“盐水溶液”是无机盐溶液。
本文中所使用的“饱和溶液”通过其物理化学性的典型定义理解为不能溶解更多的物质且其额外量将呈现为沉淀的物质溶液。这种最大浓度点(饱和点)取决于液体的温度以及所涉及的物质的化学性质。如本文中所使用的，饱和度将在环境温度下测定。
如本文所使用的“第一提取缓冲液”包括极性质子溶剂和/或有机溶剂。用于第一提取缓冲液的极性质子溶剂包括，但不限于，醇类，其包括非环状醇，如丁醇、丙醇(即，异丙醇和/或正-丙醇)、乙醇、甲醇、己醇、辛醇等；甲酸、乙酸和水。如本文所使用的，第一溶剂促进蛋白质的结构破坏，细胞结构破坏(例如，通过在细胞膜中产生孔)，促进至少蛋白质的有限提取和促进蛋白质沉淀中的至少一种。如本文所使用的，第一溶剂促进蛋白质的结构破坏，细胞结构破坏(例如，通过在细胞膜中产生孔)，促进至少蛋白质的有限提取和促进蛋白质沉淀中的至少两种。如本文所使用的，第一溶剂促进蛋白质的结构破坏，细胞结构破坏(例如，通过在细胞膜中产生孔)，促进至少蛋白质的有限提取和促进蛋白质沉淀中的至少三种。如本文所使用的，第一溶剂促进蛋白质的结构破坏，细胞结构破坏(例如，通过在细胞膜中产生孔)，促进至少蛋白质的有限提取和促进蛋白质沉淀中的全部。第一提取缓冲液与第二提取缓冲液不同。在某些实施方式中，所述第一提取缓冲液不是甲醇。
如本文所使用的“第二提取缓冲液”包括非极性溶剂，例如有机溶剂。第二提取缓冲液可包括，但不限于，苯、甲苯、二甲苯、己烷、庚烷、辛烷、己烷类、环己烷、1,4-二氧六环、氯仿、***、异丙醚、二异丁基醚。第二提取缓冲液也可包括烷烃，例如己烷。在某些实施方式中，第二提取缓冲液是极性非质子溶剂，如乙腈。如本文中所使用的，所述第二溶剂促进CoQ10从第一提取缓冲液分离。第二提取缓冲液与所述第一提取缓冲液不同。
在本文中使用的术语“样品”以其最广泛的含义使用。如本文使用的“生物样品”包括，但不限于，可以溶解在任选地含有表面活性剂或去垢剂的第一提取缓冲液中的来自活体生物或先前的活物的任何量的物质。此种活体生物包括但不限于，哺乳动物、人、非人灵长类、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和其他动物；植物；单细胞生物，如酵母和细菌。这样的物质包括，但不限于，血液(例如，全血)、血浆、血清、尿、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、***和脾，例如，来自切除的组织或活检标本；和如通过离心从任何体液收集的细胞；和原代的和永生化的细胞和细胞系。样品可以包括新鲜样品和历史样品。如本文中所使用的“基于细胞的样品”被理解为其中用于检测的样品中存在的基本上所有CoQ10(例如，至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)存在于样品的细胞内(即，不是在血清、细胞外液、细胞培养介质中)的样品。在某些实施方式中，本文提供的方法用于检测基于细胞的样品中的CoQ10。
如本文中所使用的和化学中理解的“分光光度法”或“光谱分析”是材料的反射或透射性能随波长变化的定量测量。如本文所用，分光光度法涉及可见光、近紫外光和近红外光的透射和检测。优选地，分光光度方法用于测定在特定波长下吸收光的混合物组分的浓度，而不必将被检测的成分与混合物中的其他组分分离(例如，通过大小分离或沉淀)。优选地，本文所提供的分光光度测定方法不包括或需要使用基于大小的排除或分离方法(例如，色谱法或质谱法)从细胞裂解物中分离CoQ10，以允许检测样品中的CoQ10。
光谱分析选自于吸收光谱法、荧光X射线光谱法、火焰光谱法、可见光谱法、紫外光谱法、红外光谱法、近红外光谱法、拉曼光谱法、相干反斯托克斯拉曼光谱法(CARS)、核磁共振光谱法、光子发射光谱法和穆斯堡尔光谱法。优选地在波长接近或等于275纳米(如270-280纳米；272-278纳米；274-276纳米)处采用紫外光谱法检测CoQ10。在一些实施方式中，在270纳米和280纳米之间的任何波长处检测CoQ10，例如270纳米、271纳米、272纳米、273纳米、274纳米、275纳米、276纳米、277纳米、278纳米、279纳米或280纳米。
如本文所用的，本文所用的CoQ10的“分离”理解为是指在溶剂中，CoQ10不含至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的天然与CoQ10一起存在的物质(例如，细胞组分，生物样品组分)。
如本文使用的“测定…量”是执行检测在样品中分析物(例如，CoQ10)的存在或不存在的步骤。在某些实施方式中，样品中被测定的分析物的量可以为没有或低于方法的检测限度。在某些实施方式中，CoQ10的量可以大于方法的线性检测范围。在这种情况下，可在分光光度分析之前将样品稀释在适当缓冲液中。
如本文所使用的术语“对照样品”是指任何临床相关的对比样品，包括，例如，来自未患癌症或其他疾病的健康受试者的样品，来自具有比待评估受试者较轻或较慢进展的癌症或其他疾病的受试者的样品，来自具有一些其他类型的癌症或疾病的受试者的样品，来自治疗前的受试者的样品，非病变组织(例如，非肿瘤组织)的样品，来自相同的来源且接近肿瘤部位的样品，等等。对照样品可以包括源自一个或多个受试者的样品。对照样品也可以是在较早的时间点从待评估的受试者获得的样品。例如，对照样品可以是在癌症或其他疾病发作之前，在疾病的早期阶段或者在施用治疗或者一部分治疗前从待评估的受试者获取的样品。对照样品可以是纯化的样品、化学化合物(例如，CoQ10)、试剂盒提供的蛋白质和/或核酸。这样的对照样品可以被稀释，例如，系列稀释以允许对试验样品中的分析物定量测量。对照样品也可以是来自动物模型或者来自从疾病的动物模型中得到的组织或细胞系的样品。由于组织之间CoQ10的水平不同，对照可以是组织特异性的对照。由一组测量值组成的对照样品的CoQ10水平可以例如，根据任何适当的统计量度确定，诸如，例如，包括平均值、中位数或常见值的中心趋势量度。
术语“对照水平”指的是CoQ10的公认的或预先确定的水平，可以是临界值或用于生成标准曲线的一系列值，其用于与用于测定样品(如来自受试者的样品)的CoQ10水平的分光光度读数进行比较。例如，在一个实施方式中，CoQ10的对照水平是基于来自患有或疑似患有特定疾病的受试者的样品中CoQ10的水平。在另一个实施方式中，CoQ10的对照水平是基于来自具有特定疾病进展速率的受试者的样品中的水平。在另一个实施方式中，CoQ10的对照水平是基于来自未受影响(即非疾病)的受试者(也就是说，其没有被诊断或没有预计会具有特定疾病的受试者)的样品中的CoQ10水平。在再另一个实施方式中，CoQ10的对照水平是基于来自施用治疗之前的受试者的样品中的CoQ10水平。在另一个实施方式中，CoQ10的对照水平是基于来自未接触测试化合物的患有疾病或病症的受试者的样品中的CoQ10水平。在一个实施方式中，对照是标准化的对照，诸如，例如，使用来自未患特定疾病或病症的、或诊断患有特定疾病或病症的受试者群体的或者在临近异常组织的正常组织(例如，邻近肿瘤组织的正常组织)中的CoQ10水平平均值预先确定的对照。对照水平也可以是范围，例如，通常在正常或对照组织中检测到的水平；或者对照值可以包括在正常范围的端部的值，例如，相对于正常的上限或正常的下限检测的量。
“基线”是指当患者进入研究时或在治疗开始时的CoQ10水平并用于与在治疗过程中或治疗后患者可能具有的CoQ10水平相区分。基线水平可以用作对照水平。
如本文所用的“与对照样品或受试者相比的改变”被理解为被检测到的CoQ10的水平为与正常的、未处理的或对照样品的样品有统计学差异的水平。对照样品包括，例如，培养中的细胞(特别是未处理或介质处理的细胞)、一个或更个实验室试验动物或一个或多个人类受试者。选择和测试对照样品的方法在本领域技术人员的技术能力范围之内。分析物可以是天然存在的物质，其典型地是由细胞或生物体表达或产生的(例如，CoQ10、抗体、蛋白质)，或由报道构建体产生的物质(例如，β-半乳糖苷酶或荧光素酶)。根据用于检测的方法，变化的量和量度可以不同。与对照的参照样品相比的改变也可以包括与疾病(如癌症)相关的或诊断该疾病的一种或多种体征或症状的变化。统计显着性的确定在本领域技术人员的能力范围内，例如，构成阳性结果的与平均值的标准偏差的数量。
如本文所使用的，“混合”等理解为合并或掺混多种组分，例如，两种或多种液体。混合可以是连续的或间断的。混合可以，例如，通过搅动其中含有组分的容器(即，机械搅拌)、通过磁力搅拌器、通过超声处理、通过涡旋或者其导致组分有效混合的任何其他方法进行。在优选的实施方式中，优选的是不产生干扰随后检测方法的气泡的混合方法，特别是存在表面活性剂或去垢剂的情况中。在某些实施方式中，可以包括消泡剂以减少或防止发泡，只要消泡剂不干扰CoQ10的检测。
如本文所使用的，“环境温度”应理解为在实验室中的环境温度，例如，通常为约15℃至约30℃，优选约18℃到约25℃。如本文所用的，冷却至“环境温度”是冷却到允许本发明的处理样品的含水层和有机层相分离的温度。可以采用水浴、温度模块、鼓风机或其他设备进行冷却；或简单地通过允许样品达到环境温度进行冷却。
如本文所使用的，“加热”样品被理解为将样品温度增加至约50℃至约100℃、约55℃至约90℃、60℃至约80℃、约60℃至约70℃、约62℃至约68℃、约63℃至约67℃或约65℃；或任何所提供的值包括的范围。加热可以使用水浴、温度模块、鼓风机、孵育器或其它装置来执行。
提取效率被确定为使用本发明的方法提取的CoQ10量相对于使用单独甲醇提取的CoQ10量的效率，单独甲醇提取常规地在使用质谱方法检测CoQ10之前用于CoQ10提取。在某些实施方式中，提取后，用分光光度法检测CoQ10。在某些实施方式中，提取后，用LC/MS/MS检测CoQ10。在某些实施方案中，提取后，用分光光度法检测一个样品的CoQ10，和将LC/MS/MS用于其它样品。提取效率表示为比使用单独甲醇的提取方法提高的效率倍数，例如，效率提高约2-、3-、4-、5-、7-、10-、15-、20-、25-、30-、40-、50-、75-或100倍或更高。
如本文所使用的“自动化”被理解为由机器所进行的，并不需要手工的样品或试剂处理的过程。可以理解，需要某些样品和设备的准备以允许通过机器处理样品，例如，确定分析的样品的适当量、将样品置于适当的容器中以进行处理、将试剂载入仪器中、对机器编程和数据分析。如本文中所使用的，如果所有要求保护的步骤是自动的，则该过程是自动化的。
如本文所用，辅酶Q10氧化形式的同位素标记的类似物(CoQ10-d6)是具有下述结构式的化合物：
如本文所用的，辅酶Q10还原形式的同位素标记的类似物(CoQ10H2-d6)是具有下述结构式的化合物：
在一些实施方式中，CoQ10H2-d6是通过CoQ10-d6与一种或多种还原剂反应而合成的。在一些实施方式中，还原剂是硼氢化钠(NaBH4)。
如本文使用的，“内标”应理解为是以已知量直接加入含分析物的每个样品中的化学物质。分析物的存在量然后相对于作为校准物的内标测定。
在一些实施方式中，内标是同位素标记的内标，并且是分析物分子的同位素标记的形式。由分析物所产生的质谱信号不同于由同位素标记的标准产生的质谱信号，该差异依赖于掺入分析物的同位素标记形式中的同位素原子的数目。在一些实施例中，CoQ10-d6是起到内标功能的CoQ10的同位素标记形式。在一些实施例中，CoQ10H2-d6是起到内标功能的CoQ10H2的同位素标记形式。
如本文使用的术语“质谱法”或“MS”指的是通过其质量来鉴定化合物的分析技术。MS是指基于其质荷比或“m/z”过滤、检测和测量离子的方法。MS技术一般包括：(1)电离化合物以形成带电荷的化合物；和(2)检测带电荷的化合物的分子量，和计算质荷比。可以通过任何合适的手段离子化和检测该化合物。“质谱仪”一般包括离子发生器和离子检测器。在一般情况下，一种或多种目的分子被电离，且离子随后被引入质谱仪，在其中，由于磁场和电场的组合，离子遵循取决于质量(“m“)和电荷(”z“)的空间路径。参见，例如，6,204,500号美国专利，题为“Mass Spectrometry From Surfaces”；6,107,623，题为“Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry”；6,268,144，题为“DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry”；6,124,137，题为“Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For DesorptionAnd Detection Of Analytes”；Wright等，Prostate Cancer and ProstaticDiseases 1999,2:264-76；以及Merchant和Weinberger,Electrophoresis2000,21:1164-67。
如本文使用的术语“在负离子模式下操作”指的是其中生成和检测负离子的质谱方法。在本文中使用的术语“在正离子模式下操作”指的是在其中生成和检测正离子的质谱方法。
如本文使用的术语“离子化”或“电离”是指产生具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是那些具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而正离子是那些具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。
如本文使用的术语“电子电离”或“EI”是指其中在气相或蒸汽相的目的分析物与电子流相互作用的方法。电子与被分析物的冲击产生分析物离子，其然后可进行质谱分析。
如本文使用的术语“化学电离”或“CI”是指其中试剂气体(例如氨)经受电子碰撞，以及分析物离子通过试剂气体离子与分析物分子的相互作用而形成的方法。
本文所用的术语“快速原子轰击”或“FAB”是指其中高能原子(通常是氙或氩)束撞击非挥发性样品的方法，从而解吸和电离样品中包含的分子。测试样品被溶解在粘性液体基质中，如甘油、硫代甘油、间硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯基辛基醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。化合物或样品的合适基质的选择是经验的过程。
如本文使用的术语“基质辅助激光解吸电离”或“MALDI”是指其中非挥发性样品被暴露于激光照射的方法，其通过各种电离途径(包括光致电离、质子化、去质子化和群集衰变)解吸和电离在样品中的分析物。对于MALDI，将样品与能量吸收基质混合，其有利于分析物分子的解吸。
本文使用的术语“表面增强激光解吸电离”或“SELDI”指的是其中非挥发性样品被暴露于激光照射的另一种方法，其通过各种电离途径(包括光致电离、质子化、去质子化和群集衰变)解吸和电离样品中的分析物。对于SELDI，样品通常是结合于优先保留一个或多个目的分析物的表面。如MALDI中一样，这个过程也可以采用能量吸收材料以促进离子化。
如本文使用的术语“电喷雾电离”或“ESI”是指其中将溶液沿短的毛细管的长度传递到施加有高的正或负电势的端部的方法。到达管的末端的溶液被气化(雾化)成在溶剂蒸气中的非常小的溶液液滴的喷射或喷雾。这种液滴的轻雾流经被稍微加热以防止冷凝和蒸发溶剂的蒸发室。随着液滴变得更小，电表面电荷密度增加直至相同电荷之间的自然斥力引起离子以及中性分子被释放。
如本文所用的术语“大气压化学电离”或“APCI”指的是类似于ESI的质谱方法；然而，APCI通过在大气压力下等离子体内发生的离子分子反应产生离子。等离子体通过喷雾毛细管和反电极之间的放电维持。然后离子通常通过使用一组差异抽吸排气阶段被提取到质量分析器中。干燥和预热的N2气体的逆流可以用于改善溶剂的除去。在APCI中的气相电离用于分析低极性物质可能比ESI更有效。
如本文所用的术语“大气压光致电离”或“APPI”是指其中用于分子M光电离的机制是光子吸收和电子喷射而形成分子离子M+的质谱形式。因为光子能量通常仅高于电离电势，分子离子不容易发生离解。在许多情况下，可以不需要色谱分析而分析样品，从而节省很多时间和费用。在水蒸汽或质子溶剂存在下，分子离子可以提取H以形成MH+。如果M有很高的质子亲和力，这往往会发生。这并不影响定量精度，因为M+和MH+的总和是恒定的。在质子溶剂中的药物化合物通常被观察为MH+，而非极性化合物如萘或睾酮通常形成M+。参见，例如，Robb等，Anal.Chem.2000,72(15):3653-3659。
如本文使用的术语“感应耦合等离子体”或“ICP”是指其中样品在足够高的温度与部分电离的气体相互作用以使得大多数元素被雾化和电离的方法。
如本文所用的术语“场解吸”是指其中非挥发性测试样品被放置在电离表面上和强电场被用于产生分析物离子的方法。如本文所使用的“解吸”是指分析物从表面除去和/或分析物进入气相中。激光二极管热解吸(LDTD)是其中含有分析物的样品由激光脉冲热解吸到气相中的技术。激光打击具有金属基底的特制96孔平板的背面。激光脉冲加热基底且热量导致样品转移到气相中。气相样品然后可吸入到电离源中，其中所述气相样品电离以备用于质谱仪中的分析。当使用LDTD时，可通过本领域已知的任何合适的技术来实现气相样品的电离，例如通过电晕放电电离(例如通过APCI)。
如本文使用的术语“选择性离子监测”是用于质谱仪的检测模式，其中只检测在相对窄的质量范围内的离子，通常为约一个质量单位。
如本文所用的“多反应模式”有时被称为“选择反应监测”或“多反应监测”，是用于质谱仪的检测模式，其中前体离子和一种或多种碎片离子被选择性地检测。
如本文使用的术语“量化的下限”、“定量的下限”或“LLOQ”指的是其中测量变成为有定量意义的点。在该LOQ处的分析物反应是可识别的，离散的和可重复的，具有小于20％的相对标准偏差(RSD％)和80％至120％的准确度。
如本文使用的术语“检测限”或“LOD”是测量值大于与之相关联的不确定性的点。LOD是其中值超出与其测量相关的不确定性的点，并且被定义为在零浓度下的平均值RSD的三倍。
如本文使用的“琥珀色小瓶”是由琥珀色玻璃制成的小瓶。在一些实施例中，琥珀色小瓶用于使包含在其中的样品避光。
如本文使用的“低温模块”是可以保持试管持续冷却长时间段的试管架。
如本文所用的“试剂盒”包括以在合适的包装内用于实施本发明方法的两种或更多种试剂。例如，试剂盒可包括液体或冻干形式的裂解缓冲液、第一提取缓冲液、第二提取缓冲液和去垢剂或表面活性剂中的任何一种或多种。在某些实施方式中，所述试剂盒可包括表面活性剂和/或用作对照的CoQ10，例如，以允许生成标准曲线。试剂盒还可以包括用于执行本发明方法的说明书。
如本文所用的“获得”在本文中理解为制造、购买或以其他方式拥有。
除非本文另有定义，与本公开结合使用的科学和技术术语应当具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。该术语的含义和范围应当是清楚的；然而，在存在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。
此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。“一”、“一个”和“该”应当理解为包括复数和单数，除非另有说明或从上下文中显而易见。如本文中所使用的“或”应被理解为包括的，除非另有说明或从上下文中显而易见。
此外，如“元件”或“组分”的术语涵盖包含一个单元的全部元件和组分，而且涵盖包括多于一个子单元的元件和组分，除非另有特别声明。
术语“包括”和“包含”等不是限制性的，且应该被理解为允许包括其它成分或步骤。术语“如”在本文中用于指短语“诸如但不限于”，并且可以与之互换使用。
如本文使用的“基本上由......组成”等应理解为是将化合物、方法或试剂盒限制至指定的材料或步骤“以及那些不实质性影响本发明的基本和新颖特性”的材料或步骤。例如，提取方法可以基本上由使用第一提取缓冲液、第二提取缓冲液、去垢剂以及任选的盐的提取组成而没有进一步的提取或纯化步骤。然而，也可以包括其它步骤，例如转移或混合样品。
除非上下文另有说明，本文的所有值可以理解为由术语“约”来修饰。可接受的变异量取决于特定的值，但通常被认为是在平均值的两个标准差之内。“约”可被理解为最高10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％或0.01％的变异。本文所提供的范围应理解为包括范围内的所有值，或者该范围内的范围或值的任意子集。例如，1-10应理解为包括1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，或这些值的任何范围或子集，以及适当时的分数值。类似地，如“高达”某一值所提供的范围被理解为包括从零至该范围的上端的值；且“小于”应理解为包括从该数至零的值，例如，小于5被理解为5、4、3、2、1或0或者5至0的范围内的值的分数部分。“一个或多于一个”被理解为包括一个和大于1的所有值，例如，1、2、3、5、6、7、8等，或从1开始的任何特定值。
“至少一部分”应理解为时间、体积或从其中获得该部分的其他实体的某些分数(例如，至少约1％)至基本上其全部(例如，约100％)或其全部。例如，在孵育期中混合或加热的样品不需要在整个孵育期中混合或加热。同样地，通常少于全部第二提取缓冲液的部分被分析以测定在从样品所提取的CoQ10的浓度。
当提供了液体的比率或液体物质的百分溶液/悬浮液时，除非另外说明，该比率是体积-体积比。当提供了固体物质的百分溶液时，除非另有说明，该比率是重量-体积比。
本文的变量的任何定义中的化学基团列表的记载包括该变量作为所列基团的任何单一基团或组合的定义。本文的变量或方面的实施方向的记载包括该实施方式作为任何单一实施方式或与任何其他实施方式或其部分的组合。当没有提供立体化学时，所有立体异构体、外消旋混合物或单一立体异构体均包括在术语中。当提供了结构和该结构的名称两者时，在不一致的情况下，该结构优于名称。
本文所提供的任何实施方式、方法或试剂盒可与本文所提供的任何其它实施方式、方法或试剂盒组合。
II.方法和用途
提取方法
本文提供了用于测定生物样品中CoQ10的量的方法和试剂盒。本文提供的提取方法也可与非分光光度的检测方法一起使用，包括其中在检测之前辅酶Q10基于大小与样品中的其它成分分离的方法。
本发明提供了快速、有效的检测样品中CoQ10的方法。本文提供的方法可以适应于自动化的高通量筛选方法，例如，用于临床实验室中。这通过使用本文提供的方法获得高水平的CoQ10提取并且通过使用不需要基于分子量分离CoQ10或检测CoQ10的光谱学方法检测CoQ10而成为可能，这使得该方法能够适用于高通量筛选方法。本文所提供的提取方法也可与包括在检测之前通过大小(例如，液相色谱法)分离CoQ10的CoQ10检测方法一起使用。在一些实施方式中，液相色谱之后是存在于样品中的CoQ10的质谱分析。然而，本发明的优选方法不包括基于大小将CoQ10与样品中存在的其它成分分离的步骤。
在某些实施方式中，提供的方法包括向样品(如组织样品或细胞样品)加入第一提取缓冲液和第二提取缓冲液。然后使得相分离，并且CoQ10被保留在第二提取缓冲液层中。然后光谱分析第二提取层以测定存在于样品中的CoQ10量。
在某些实施方式中，同时向样品中加入第一提取缓冲液和第二提取缓冲液(例如，作为乳液，依次添加，在添加之间没有预定的孵育时间，例如，在彼此的30秒内、在彼此的20秒内、在彼此的10秒内；没有定义的步骤，例如，其间的混合和/或在加热)。在某些实施方式中，在通过例如机械搅拌、超声处理或用磁力搅拌器将各组分充分混合在一起之前将所述第一和第二提取缓冲液加入到样品中。在某些实施方式中，在加入第二提取缓冲液之前，将样品与第一次提取缓冲液一起孵育。在某些实施方式中，将表面活性剂或去垢剂加入到样品中。在某些实施方式中，在向样品中加入第一提取缓冲液之前，将表面活性剂或去垢剂与所述第一提取缓冲液混合。在某些实施方式中，与第一提取缓冲液同时将所述表面活性剂或去垢剂加入到样品中，并任选地与第二提取缓冲液同间添加。在某些实施方式中，在加入第二提取缓冲液后将无机盐加入到样品中。在某些实施方式中，无机盐是氯化物盐，如氯化钠。在某些实施方式中，盐以饱和盐溶液(优选在水中)的形式加入。在某些实施方式中，所述盐存在的终浓度为约1mM至约50mM(例如，约5mM至约45mM、约10mM至约35mM、约1mM至约10mM、约1mM至约25mM、约10mM至约50mM、约25mM至约50mM、约20mM至约30mM、约15mM至约35mM；或由提供的值所包括的任何范围)。
在某些实施方式中，在与第一提取缓冲液的孵育期的至少一部分期间内将样品加热，并且任选地与表面活性剂或去垢剂一起，在孵育期的至少一部分期间。在某些实施方式中，在孵育期的至少一部分期间内将样品混合。在某些实施方式中，在加入第二提取缓冲液后将样品混合和/或加热。在某些实施方式中，样品在加入所述第一和第二提取缓冲液及任选的表面活性剂或去垢剂后孵育。在某些实施方式中，在第一提取缓冲液的存在下加热样品。在某些实施方式中，在第二提取缓冲液的存在下加热样品。在某些实施方式中，在第一和第二提取缓冲液的存在下加热样品。在某些实施方式中，在第一缓冲液或第二缓冲液或者第一和第二缓冲液两者中将样品加热至少5秒、至少10秒、至少15秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少60秒、至少75秒、至少90秒、至少105秒或至少120秒。在某些实施方式中，与在提取过程中不加热的样品相比，所述加热步骤将提取的CoQ10量提高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少50％，或更多。
第一提取缓冲液与第二提取缓冲液的物理性质的差异导致第一和第二提取缓冲液的自发相分离。在某些实施方式中，可通过主动地或被动地将加热的样品冷却至环境温度(即，标准的实验室温度、自动化的高通量分析装置内的温度)来促进分配。在相分配时，CoQ10存在于所述第二提取相中，也就是说，在非极性溶剂中。
在某些实施方式中，分配后，从样品中移除至少一部分第二提取相以利于光谱分析。在某些实施方式中，将第二提取相移到石英容器(例如，小池，适当形状的管)中用于在275纳米的波长下读取以定量检测CoQ10的存在。本发明提供了优于其他用于检测CoQ10的定量方法的优势，其中所述其他方法需要基于大小将CoQ10与样品的基本上所有的其它组分分离以使其能够进行检测，例如，使用色谱方法或质谱方法，其需要从混合物中分离分子物质，例如通过柱或电喷雾，然后检测和鉴定混合物中物质的各种成分。本文提供的提取方法使得能够定量检测样品中的CoQ10，而不基于分子量而检测CoQ10。结果，该方法很容易适应于高通量方法，并且可以快速地进行(例如，在约10分钟或更少时间内；在约5分钟或更少时间内；在约2分钟或更少时间内；在约1分钟或更少时间内；在大约30秒或更少时间内)。
本文提供的提取方法在从样品材料(例如，典型的生物材料，例如在培养中生长的或来自受试者样品的细胞)中提取CoQ10中是高效的。提取效率被测定为使用本发明的方法提取的CoQ10的量相对于使用单独甲醇提取的CoQ10的量，单独甲醇提取是在检测之前使用液相色谱法之后是质谱方法常规用于CoQ10提取的方法。提取效率表示为相对于使用单独甲醇的提取方法和优选地使用单独甲醇的提取方法随后用液相色谱分离和质谱检测方法的效率倍数提高。使用本发明的方法，提取的效率为至少2-、3-、4-、5-、7-、10-、15-、20-、25-、30-、40-、50-、75-或100倍或更高。在某些实施方式中，提取的效率是至少或约5-、11-、14-、28-、82-、545-或1863-倍或更高。
使用的样品量和提取的体积取决于许多因素，其中包括，但不限于，可用样品量、用于分光光度分析的提取小瓶和比色池的体积。例如，当样品被人工处理时，通常使用较大的体积，而当使用自动方法时，可以使用较小的样品体积。
第一提取缓冲液与第二提取缓冲液的比例优选为约5:1至约1:1(v/v)(例如，5:1、4:1、3:1、2:1、1:1，或者在该任何值所包括的范围内的分数值，如4.5:1、3.3:1、2.1:1)。当存在时，表面活性剂或去垢剂与所述第一提取缓冲液的比例优选为约1:50至约1:1(体积/体积)(1:50、1:45、1:40、1:35、1:30、1:25、1:20、1:15、1:10、1:5、1:1)。表面活性剂或去垢剂的浓度优选为约0.01mM至约10mM(例如，约0.01mM至约1mM、约1mM至约10mM、约0.1mM至约5mM、约0.01mM至约2mM、约0.1mM至约7.5mM、约1mM至约10mM或由所提供的任何值所包括的范围)。可以理解，某些去垢剂和表面活性剂是具有近似分子量的混合的聚合物，并因此可以只提供近似的摩尔浓度。
利用CoQ10-d6和CoQ10H2-d6作为内标
本文还提供了使用质谱如LC-MS/MS检测和定量样品中氧化和还原形式的CoQ10的方法。可以分别地检测和定量样品中氧化和还原形式的CoQ10或者它们可在单一分析运行中被同时检测和定量。在一个具体实施方式中，可以使用本发明的方法定量样品中存在的还原的CoQ10(CoQ10H2)的量。这些方法允许CoQ10H2被精确和可靠的量化，这是重要的，因为CoQ10H2是CoQ10的生物活性形式。
在一些实施方式中，检测和定量氧化和还原形式的CoQ10的方法可以与本文中描述的样品提取方法或与其它提取方法相结合。例如，在一些实施方式中，可以通过使用一种提取缓冲液，例如，1-丙醇，提取样品来检测和定量样品(例如，生物样品)中的氧化和还原形式的CoQ10。在其他实施方式中，可以通过根据本文描述的方法使用第一和第二提取缓冲液提取样品来检测和定量样品(例如，生物样品)中的氧化和还原形式的CoQ10。
氧化和还原形式的CoQ10的定量通过使用其相应的同位素标记的形式作为内标实现，例如，氧化的和还原的氘化CoQ10。在一些实施方式中，CoQ10-d6作为内标用于测定样品中CoQ10的量。在一些实施方式中，CoQ10H2-d6被用作内标用于测定样品中CoQ10H2的量。在一些实施方式中，将CoQ10-d6和CoQ10H2-d6都加入到样品中用于同时测定样品中所含的CoQ10和CoQ10H2的量。可以根据加入到样品中的已知量的CoQ10-d6和根据由CoQ10和CoQ10-d6产生的相对质谱信号计算样品中CoQ10的量。类似地，可以根据加入到样品中的已知量CoQ10H2-d6和根据由CoQ10H2和CoQ10H2-d6产生的相对质谱信号计算样品中CoQ10H2的量。
使用CoQ10-d6作为内标用于定量样品中的CoQ10以及使用CoQ10H2-d6用于定量样品中的CoQ10H2提供了优于使用CoQ10-d6或类似物如CoQ9或CoQ11作为内标用于同时定量CoQ10和CoQ10H2的已知方法的优势。具体而言，本文所描述的定量方法提供了CoQ10H2定量的更高精确度，因为在该方法中用作内标的CoQ10H2-d6具有与CoQ10H2非常相似的性质，例如，提取回收率、电离反应和色谱保留时间，但还产生不同的质谱信号。与此相反，使用CoQ10-d6、CoQ9或CoQ11作为内标定量CoQ10H2导致量化偏差和较低的精度。
可以在样品处理过程中的任何点，将内标例如CoQ10-d6或CoQ10H2-d6添加到样品中。在一些实施方式中，在样品处理的开始(例如，提取时)将内标添加到各样品。在一些实施方式中，所述样品包含血液，和在血浆提取之前将内标添加到样品中。
将被添加到各样品中的内标例如，CoQ10-d6或CoQ10H2-d6的量不应干扰由分析物CoQ10或CoQ10H2产生的质谱信号。在一些实施方式中，被添加到各样品的CoQ10-d6或CoQ10H2-d6的量应导致在剂量反应曲线的线性范围内的CoQ10-d6或CoQ10H2-d6浓度。在一个优选实施方式中，被添加到各样品的CoQ10-d6或CoQ10H2-d6的量应产生20至2500ng/mL之间的浓度(例如，50至2000ng/mL，或100至1500ng/mL或100至1000ng/mL)。
在一些实施方式中，本发明提供用于测定在样品处理(例如，样品提取)过程中或者作为其结果发生的CoQ10H2降解的程度的方法。CoQ10H2降解的例子是CoQ10H2的氧化以产生部分氧化的形式(泛半醌，CoQ10H)或完全氧化形式(泛醌，CoQ10)。暴露于发生在样品处理过程中和将样品引入质谱仪中以检测CoQ10和/或CoQ10H2之前发生的光和高温可以加重CoQ10H2的降解。在一些实施方式中，可以基于样品处理前加入到样品中的已知量CoQ10H2-d6和基于测得的由氧化导致的剩余CoQ10H2-d6与CoQ10H-d6和CoQ10-d6的相对信号计算CoQ10H2氧化的程度。在一个优选的实施方式中，通过成为氧化的CoQ10H2-d6的量和在样品处理过程中所产生的CoQ10-d6的量调整在样品中测得的CoQ10和CoQ10H2的量。
使用质谱和内标检测CoQ10和CoQ10H2的方法
在某些实施方式中，本发明提供了一种用于测定CoQ10和CoQ10H2的量的LC-MS/MS方法。对于两种形式，这种方法在20-2500ng/mL的临床相关范围内是线性的，r2>0.99。这两种形式的％CV及批间和批内分析的检测精度/准确度值在10％以下。
在一些实施方式中，本发明提供了用于测定样品中CoQ10和/或CoQ10H2的量的方法，所述方法包括：
a)提供样品；
b)任选向样品添加已知量的CoQ10-d6和/或CoQ10H2-d6；
c)处理样品；
d)任选地将样品进行液相色谱法；
e)通过质谱检测CoQ10和/或CoQ10H2及(如适用)CoQ10-d6和CoQ10H2-d6；和
f)通过将其与已知量的检测到的CoQ10H2-d6比较来测定样品中检测的CoQ10和/或CoQ10H2的量。
在一些实施方式中，整个方法是在降低的光下并使用琥珀色小瓶进行的以尽量减少CoQ10H2的降解。在一些实施方式中，使用预冷却的收集管进行样品采集以尽量减少温度引起的CoQ10H2降解。在进一步的实施方式中，可以将收集管预先冷却至0℃至-20℃的温度。在优选的实施方式中，可以将收集管预先冷却至-20℃。在另一个实施方式中，可以将收集管预先冷却至约-20℃至约-80℃，例如约-20℃、约-25℃、约-30℃、约-35℃、约-40℃、约-45℃、约-50℃、约-55℃、约-60℃、约-65℃、约-70℃、约-75℃或约-80℃。
在一些实施方式中，样品是血液，例如，在含肝素锂作为抗凝剂的预冷BD管中收集并立即使用本领域已知的可用于从血液中提取血浆的标准方法处理的人血。在进一步的实施方式中，在收集血液样品30分钟内，优选地15分钟内分离血浆。在可选的实施方式中，样品是血液，例如，人的血液，其被收集在预冷却的肝素化小瓶中并保持在低温下。
在一些实施方式中，其中血液样品没有在采集后的30分钟内处理以提取血浆，步骤c可包括使用在本领域中已知的任何血浆提取方法提取血浆。
在一些实施方式中，步骤c可以包括蛋白质沉淀以从样品除去大部分蛋白质，从而在上清液中留下CoQ10、CoQ10H2和他们的同位素标记的类似物(如适用)。可将样品离心以从沉淀的蛋白质分离液体上清液；可选地，样品可以被过滤以除去沉淀的蛋白质。然后可将得到的上清液或滤液直接用于质谱分析；或者可选地，用于液相色谱法和随后的质谱分析。
在其它实施方式中，步骤c可以包括使用单一溶剂提取的蛋白质沉淀。在一些实施方式中，用于提取的溶剂被选择以使得分析物分子，例如CoQ10和CoQ10H2，放置在溶剂中一段时间时是稳定的，例如，没有显著程度的降解。在一些实施方式中，该时间长度可以长达6小时，如5分钟、10分钟、30分钟、60分钟、2小时、4小时或6小时。在一些实施方式中，所述溶剂可以是己烷、甲醇或1-丙醇。在一些实施方式中，使用预冷却的试管、预冷却的低温模块和预冷却的溶剂进行步骤c以尽量减少温度引起的CoQ10H2的降解。在进一步的实施方式中，可以将试管、低温模块和溶剂预冷却到约0℃至约-20℃的温度，例如，约-2℃、约-5℃、约-10℃、约-12℃、约-15℃或约-20℃。在优选实施方式中，可以将试管、低温模块和溶剂预冷却到约-20℃的温度。在另一个实施方式中，可以将试管、低温模块和溶剂预冷却至约-20℃至约-80℃，例如约-20℃、约-25℃、约-30℃、约-35℃、约-40℃、约-45℃、约-50℃、约-55℃、约-60℃、约-65℃、约-70℃、约-75℃或约-80℃。
在一些实施方式中，步骤c可以包括，如在本申请其它地方描述的，使用第一提取缓冲液和第二提取缓冲液的样品提取。
在一些实施方式中，可在步骤d中将所提取的样品进一步进行液相色谱以分离CoQ10和CoQ10H2及他们的同位素标记的类似物(如适用)。传统的色谱分析依赖于柱填充，其中通过该柱的样品的层流是从样品分离目的分析物的基础。本领域技术人员将能够选择适合用于CoQ10和CoQ10H2的LC，包括HPLC、仪器和柱。色谱柱通常包括介质(即，填充材料)以利于化学成分的分离(即分馏)。该介质可包括微小颗粒，或可包括具有多孔通道的单片材料。该介质的表面通常包括与各种化学部分相互作用的键合表面以促进化学成分的分离。一种合适的键合表面是疏水性键合表面，如烷基键合、氰基键合的表面或高纯度的二氧化硅表面。烷基键合的表面可以包括C-4、C-8、C-12或C-18的键合烷基。在优选的实施方式中，柱是C18微粒填充柱(例如Agilent C18 Zorbax柱)。层析柱包括用于接收样品的入口端口和用于排出包括分馏的样品的流出物的出口端口。
可使用导致CoQ10和CoQ10H2有效分离的任何层析方法。在一些实施方式中，使用等度洗脱模式(即，其中流动相的组成保持恒定)完成CoQ10和CoQ10H2从反相柱的洗脱。在一些实施方式中，流动相的组成为30:70至90:10A:B，其中A为5mM的甲酸铵和B为1-丙醇。流动相的组成可通过用任何其它具有相似极性的溶剂来替代5mM甲酸铵和1-丙醇来改变，其包括，但不限于乙醇、2-丙醇、丙酮或乙腈。在一个优选实施方式中，流动相的组成为80:20A:B，其中A为5mM的甲酸铵和B为1-丙醇，和色谱分离进行5分钟。
在一些实施方式中，可以在色谱过程中检测到CoQ10和CoQ10H2及他们的同位素标记的类似物(如适用)。在一些实施方式中，检测可以包括光谱检测。优选采用紫外光谱法在接近或等于275纳米(如270-280纳米；272-278纳米；274-276纳米)的波长处检测CoQ10。
在优选的实施方式中，在色谱分离后直接将洗脱的CoQ10和CoQ10H2及他们的同位素标记的类似物(如适用)进样到质谱仪中。在一个可选的实施方式中，可首先收集含有洗脱的CoQ10和CoQ10H2及他们的同位素标记的类似物(如适用)的色谱级分，然后在单独步骤中将其引入到质谱仪中。
在步骤e中，使用质谱检测CoQ10和CoQ10H2及他们的同位素标记的类似物(如适用)。在质谱分析过程中，可通过本领域技术人员已知的任何方法对CoQ10和CoQ10H2进行电离。优选使用包括用于电离分馏的样品并产生带电分子进行进一步分析的离子源的质谱仪进行质谱分析。例如，可以通过电子电离、化学电离、电喷雾电离(ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCI)、光致电离、大气压光电离(APPI)、激光二极管热解吸(LDTD)、快速原子轰击(FAB)、液体二次电离(LSI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷射/等离子喷雾电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)和粒子束电离进行样品的电离。本领域技术人员将理解，可以基于待测定的分析物、样品类型、检测器类型、正与负模式的选择等确定电离方法的选择。
CoQ10和CoQ10H2及他们的同位素标记的类似物可在正或负模式中电离。在一个优选实施方式中，使用ESI在正离子模式下中电离CoQ10和CoQ10H2及他们的同位素标记的类似物。
一般在质谱技术中，在样品被电离后，可以分析由此产生的带正或负电荷的离子以测定质荷比。用于测定质荷比的合适的分析仪包括四极杆分析仪、离子阱分析仪和飞行时间的分析仪。示例性的离子阱方法被描述于Bartolucci，等，Rapid Commun.Mass Spectrom.2000,14:967-73中。
可以使用几种检测方式来检测离子。例如，所选的离子可以被检测到，即使用选择性离子监测模式(SIM)，或可选地，可以监测由碰撞诱导的解离或中性损失所得的质量转变(mass transition)，例如，多反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)。在一些实施方式中，使用四极杆分析仪测定质荷比。例如，在“四极”或“四极离子阱”仪器中，振荡射频场中的离子经受与电极之间施加的直流电压、RF信号幅度和质/荷比成比例的力。可以选择电压和幅度以使得只有具有特定质/荷比的离子沿四极杆的长度移动，而所有其它离子被偏转。因此，四极杆仪器对于注入仪器中的离子可以同时作为“质量过滤器”，和作为“质量检测器”发挥作用。
通过使用“串联质谱法”或“MS/MS”可以提高MS技术的分辨率。在该技术中，从目的分子产生的前体离子(也称为母离子)可以在MS仪器进行过滤，并且随后前体离子断裂以得到一个或多个碎片离子(也称为子离子或产物离子)，然后在第二MS过程中对其进行分析。通过仔细地选择前体离子，只有由特定分析物产生的离子被传递给碎裂腔，其中与惰性气体原子的碰撞产生碎片离子。
操作串联质谱仪的可选模式包括产物离子扫描和前体离子扫描。对于这些操作模式的说明参见，例如，E.Michael Thurman等，Chromatographic-Mass Spectrometric Food Analysis for TraceDetermination of Pesticide Residues,Chapter 8(Amadeo R.Fernandez-Alba,ed.,Elsevier 2005)(387)。
通过本领域中已知的许多方法，分析物测定的结果可以与原始样品中分析物的量相关。例如，假定取样和分析参数被仔细控制，给定离子的相对丰度可以与将相对丰度转换为原始分子的绝对量的表进行比较。可选地，外标可与样品一起运行，并在由这些标准产生的离子的基础上构建标准曲线。使用这样的标准曲线，给定离子的相对丰度可被转换成原始分子的绝对量。在某些优选的实施方式中，内标被用于生成标准曲线以用于计算维生素D代谢物的量。产生和使用这种标准曲线的方法是本领域众所周知的，和普通技术人员能够选择合适的内标。例如，在优选的实施方式中，CoQ10-d6和CoQ10H2-d6可以用作内标。将离子的量与原始分子的量相关联的许多其他的方法是本领域的普通技术人员所熟知的。
可以利用自动化机器进行该方法的一个或多个步骤。在某些实施方式中，在线执行一个或多个纯化步骤，更优选地可以用在线的方式进行所有的纯化和质谱步骤。
在一些实施方式中，如MS/MS，其中前体离子分离用于进一步碎裂，碰撞活化解离(CAD)经常被用来产生碎片离子用于进一步检测。在CAD中，前体离子通过与惰性气体碰撞获得能量，并随后通过被称为“单分子分解”的过程而破裂。足够的能量必须被沉积在所述前体离子中以便使得离子内的某些键可能由于增加的振动能量而被打破。
在一些实施方式中，通过使用如下的多反应监测(MRM)的质谱法检测样品中的CoQ10和CoQ10H2。样品(例如，包含步骤d的色谱级分和溶剂的样品)进入MS/MS分析仪的喷雾器接口和在接口的加热带电管道被转变成蒸气。通过向溶剂/分析物混合物施加大电压使样品中包含的分析物(CoQ10和CoQ10H2及他们的同位素标记的类似物(如适用))电离。随着分析物离开接口的带电管道，溶剂/分析物混合物雾化和溶剂蒸发，留下分析物离子。该离子，例如前体离子，通过仪器的孔并进入第一四极。四极1和3(Q1和Q3)是质量过滤器，允许根据质荷比(m/z)选择离子(即，在Q1和Q3中分别选择“前体”和“片段”离子)。四极2(Q2)是碰撞池，离子在其中破碎。质谱仪的第一四极(Q1)选择具有衍生的目的维生素D代谢物的质荷比率的分子。具有正确的质量/电荷比的前体离子被允许传递到碰撞室(Q2)中，而具有任何其它质/荷比的不需要的离子与四极的侧面碰撞和被消除。在一些实施方式中，CoQ10的前体产物离子可以是m/z 863.4的离子，和CoQ10H2的前体产物离子可以是m/z 865.4的离子。使用本领域公知的标准方法，普通技术人员能够鉴别可以被用于在四极2(Q2)中进一步碎裂的CoQ10、CoQ10H2、CoQ10-d6和CoQ10H2-d6的特定前体离子的一种或多种碎片离子。
进入Q2的前体离子与中性氩气分子碰撞并碎裂。产生的碎片离子(即，产物离子)传送到四极3(Q3)中，其中分析物的碎片离子被选择，而其它离子被除去。在一些实施方式中，m/z 197的产物离子对于CoQ10和CoQ10H2被同时检测。
该方法可以包括在正或负离子模式下进行的MS/MS；优选正离子模式。使用本领域公知的标准方法，普通技术人员能够识别可以用于在四极3(Q3)中选择的CoQ10、CoQ10H2、CoQ10-d6和CoQ10H2-d6的特定前体离子的一种或多种碎片离子。
当离子与检测器碰撞，它们产生被转换成数字信号的电子脉冲。所获取的数据被传递到计算机，其绘出随时间收集的离子计数的图。可以测量对应于特定离子的峰下面积或这些峰值的幅度，并与目的分析物的量相关联。在某些实施方式中，测量碎片离子和/或前体离子的曲线下面积或者峰幅度以测定CoQ10或CoQ10H2的量。如上所述使用基于内标(例如，CoQ10-d6或CoQ10H2-d6)的一个或多个离子峰的校准标准曲线，给定离子的相对丰度可转换成原始分析物的绝对量。
下面的实施例用来说明本发明的方法，而不应被理解为限制本发明的范围。
实施例
实施例1--材料和方法
细胞培养
用于CoQ10定量的分析法被用来测定CoQ10处理各种不同时间后各种细胞系中的CoQ10水平。在该研究中使用的细胞系是正常的人主动脉平滑肌细胞(HASMC)，肝癌细胞系HepG2和人胰腺癌细胞系PaCa2。所有的细胞系是可商购的，并根据来自细胞系的生产商/供应商的说明保存。
制备CoQ10的标准溶液
制备500μM的CoQ10储备液：在15mL的锥形管中称取4.32mg的CoQ10，加入10ml正己烷，在65℃的水浴中加热该管直到CoQ10溶解，和轻轻摇动该管以混合溶液。通过在己烷中稀释该储备液制备100μM和50μM的CoQ10储备液。
试剂组合物
缓冲液A(第一提取缓冲液)：100％甲醇
缓冲液B(表面活性剂/去垢剂)：1mM的脱氧胆酸钠
缓冲液C(第二提取缓冲液)：100％己烷
一般方法：标准溶液的提取/分析
步骤1：如上面所描述的，在己烷中制备500μM的CoQ10储备溶液并用来在合适的缓冲液中制备100μM和50μM的CoQ10溶液以用于细胞处理或在检测分析方法中直接使用。
步骤2：将在缓冲液A中200μL的各种浓度的CoQ10或单独的缓冲液A等分到玻璃小瓶并将10μL的缓冲液B加入到每个小瓶中。在预定时间点收集用各种浓度的CoQ10处理的细胞并洗涤。将细胞团样品(例如，约105-107个细胞)与200μL缓冲液A和10μL缓冲液B相结合，并在缓冲液混合物中重新悬浮细胞团。在将缓冲液A和B与细胞混合时，样品混合物变成不透明的。然后将混合物转移到玻璃小瓶中。
步骤3：来自步骤2的玻璃小瓶被加热至65℃1分钟。加热时样品转澄清，然后当冷却至室温时又变得不透明。
步骤4：将缓冲液C的200μL等分试样加入到每个小瓶中。将小瓶再次升温至65℃。在小瓶中的溶液自发地分成两个相，具有含基本上所有的CoQ10物质的第二提取缓冲液层(上层)。
步骤5：移出50μL上部提取层的样品并在275nm处在紫外分光光度计上进行分析。通过与标准曲线相比较来测定每一个样品中的CoQ10的量。
实施例2--生成各种溶剂中CoQ10浓度的标准曲线
对各种溶剂***进行了测试以优化提取过程。为了确定使用CoQ10紫外分光检测进行分析的过程中溶剂***的最佳的光谱特性，通过光谱法生成标准曲线。使用已知浓度的CoQ10对三种不同的溶剂(2-丙醇、乙腈和己烷)进行测试。
为了制备标准曲线，在适当的溶剂中制备50μM的CoQ10储备液和进行储备液的系列稀释。在UV分光光度计中在275nm处测量来自系列稀释的各样品的OD275和在曲线图上描绘。标准曲线制备的结果列于表2和图1中。
表2-在不同溶剂中的各种不同浓度的CoQ10的OD275值
进行数据的线性回归分析以产生标准曲线。这些结果表明，2-丙醇和乙腈溶液的光谱是相同的，且己烷溶液在曲线图的上部稍微偏移。所有三种溶剂提供可以在主要浓度范围内与线性方程拟合的结果。三个标准曲线中的任何一个可被用于基于OD275确定在适当的溶剂中的CoQ10浓度。
实施例3—暴露于不同浓度的CoQ10的组织培养细胞中CoQ10 的定量
从细胞样品提取CoQ10
在实验性试验中，在6孔板的每个孔中接种约1×106个HASMC、HepG2或PaCa2细胞。在接种时，将细胞用在异丙醇中的规定浓度的CoQ10(一式三份)或专有的CoQ10递送制剂处理3、6或24小时。在规定的孵育时间后，将细胞用冷的TPBS(具有100mM Tris的PBS，pH 7.4)洗涤，通过胰蛋白酶消化收获，用1ml的TPBS洗涤(2次)，并通过1500RPM离心沉淀。胰蛋白酶消化后立即将细胞计数以确定样品中存活细胞的总数。
将细胞沉淀重悬在200μL的缓冲液A(第一提取缓冲液)和10μL的缓冲液B(表面活性剂/去垢剂)中。在添加缓冲液B时，样品变得不透明并形成沉淀。将再悬浮的细胞转移到硼硅酸盐小瓶。对于不含细胞的对照样品，将含CoQ10的溶液加入到玻璃小瓶中，并加入己烷以使体积为200μL，和然后加入10μL缓冲液B。
将小瓶在水浴中在65℃下温育2分钟，在温育进行大约一半时轻轻混合。在温育过程中，样品从浑浊变为澄清。将样品从水浴中取出，并向小瓶中添加200μL的缓冲液C(第二提取缓冲液)。样品分为两相，极性的和非极性的。顶部的非极性层是澄清的，而在小瓶的底部形成白色沉淀物。将样品再次在65℃下加热1分钟，在温育进行大约一半时轻轻混合。将溶液冷却至室温，并将75μL的上层相的部分试样放入石英比色皿中和在275nm的波长处通过紫外分光光度法分析。记录吸收值。
标准曲线的生成
对于生物样品中CoQ10的定量评估，基本上如上所述(实施例2)生成标准曲线。对于CoQ10的各个独立测定值，标准曲线是通过在己烷中制备50μM的CoQ10储备液，和对储备材料进行系列稀释产生的。在紫外线光谱仪中在275nm的波长处测定来自系列稀释的每个样品并绘制在曲线图上。代表性的标准曲线示于图2中。
使用幂级数以拟合标准品的标准曲线，并确定方程式。曲线不拟合典型的线性回归形式。这种线性的缺乏证明对于每个实验生成标准曲线的益处以及优选从落在曲线的线性部分内的OD275读数计算未知样品中CoQ10浓度的重要性。使用来自所提取的样品的OD275值，针对所生成的标准曲线来确定CoQ10的量。
数据分析
对于本研究，所有细胞样品一式三份重复。CoQ10提取和OD275测量由不参与细胞的CoQ10处理或收获的人进行。作为所使用的方法的初始基准，分析数据的再现性。
没有经过CoQ10处理的而仅仅在接种后的指定时间收获的Hep2G细胞对于所有重复的样品给出了高度可再现的结果(见图3A)。这证明了提取和检测方法的再现性。
关于再现性，在一式三份孔中用各种浓度的CoQ10进行3、6和24小时的处理后收集的细胞中看到更大的变异。如示于图3B-E中，基本上在24小时的时间点观察到Hep2G细胞中最大的CoQ10量的变异。
该结果也根据递送介质对于CoQ10摄取至细胞中的效率进行了分析。这些结果总结于下表3中。从数据中可以明显看出，基本上当用CoQ10在CoQ10专门递送制剂中递送时，与丙醇相比24小时后细胞中存在的CoQ10明显更多。根据每细胞的CoQ10的pM数计算CoQ10的量；因此，在细胞内CoQ10中观察到的差异不是细胞生存力对两种载体响应的差异或在培养中增殖时间差异的结果。虽然存在标准的统计偏差，通过使用本文所提供的方法获得的数据被证明是统计学上可靠的，并且该方法是可重复的。
表3：CoQ10处理的Hep2G细胞中CoQ10平均水平的总结(pM/细胞)
实施例4--生物样品中CoQ10定量的体外分光光度法对 LC/MS/MS(MRM)法的比较
为了进一步验证用于生物样品中CoQ10的定量评估的分光光度法的效用，使用HASMC、HepG2和PaCa2细胞系重复以上所述的实验。此外，使用用于分析的三种细胞类型中的每一种制备第二组细胞样品来使用本领域中常规使用的LC/MS/MS方法测定CoQ10水平。简言之，接种细胞，并如上所述用在异丙醇或CoQ10专门递送制剂中的CoQ10处理细胞，并在接种后3、6或24小时收获。用上述的方法对任一细胞沉淀进行提取，重悬细胞于缓冲液A和B中，并用缓冲液C提取CoQ10，或者将细胞沉淀送到诊断实验室(IriSysResearch&Development Inc)进行CoQ10的定量评估，其使用单独甲醇提取随后通过LC/MS/MS检测。
下表4中总结了来自两种分析的数据。很明显，在每一个测试样品中和所有的处理条件下，使用单独甲醇随后用LC/MS/MS检测的生物样品的CoQ10提取与本文所描述的提取方法后分光光度法检测相比产生低估的CoQ10水平。这些结果证明，本文所提供的用于生物样品中CoQ10的提取和定量的方法与目前使用的技术相比所具有的效率。这些结果也证明，使用专门CoQ10递送制剂比异丙醇更有效地将CoQ10送送至细胞。
表4--CoQ10的分光光度法和LC/MS/MS检测的比较
为了便于比较在细胞中检测到的CoQ10量，计算使用本文所提供的提取与分光光度方法检测的每细胞CoQ10浓度与使用单独甲醇提取随后LC/MS/MS检测的方法检测的每细胞CoQ10量相比较的倍数差异。其结果列于下面的表5中。
表5--使用OD275与LC/MS/MS检测的细胞中CoQ10的倍数差异
处理 细胞类型 制剂 倍数差异
未处理 HepG2 异丙醇 28
100μM HepG2 异丙醇 82
100μM HepG2 CoQ10递送制剂 5
未处理 HASMC 异丙醇 545
未处理 PaCa2 异丙醇 1863
100μM PaCa2 异丙醇 11
100μM PaCa2 CoQ10递送制剂 14
可容易地观察到，本文所提供的提取和检测方法比本领域中常规使用的LC/MS/MS方法在生物样品中检测到显著更多的CoQ10。
实施例5--用于检测CoQ10和CoQ10H 2 的质谱参数的确定
氧化的CoQ10的分析
方法：
将5.04mg的CoQ10溶于1mL丙酮中，得到5mg/mL的CoQ10浓度。将100μL等份的该溶液与900μL异丙醇混合以得到≈0.5mg/mL的CoQ10浓度。将200μL等份的该溶液与10μL甲酸混合并直接注入到质谱仪中。对于质谱分析，在正ESI模式中进行Q1扫描。
结果：
在m/z 863.4处观察到氧化形式的分子离子峰。在m/z 885.4处观察到还原形式的辅酶Q10(CoQ10H2)的可能的峰。在199.2Da观察到假峰，这可能是由质谱仪中的先前注射或分子沿内表面的累积引起的。
对于m/z 863.4在150–800Da范围内进行产物离子扫描，在m/z197.0处显示单一的主要产物离子峰。
在m/z 865.4处的峰可能对应于还原形式的CoQ10(CoQ10H2)。在Q1扫描中观察到此峰，但不如863.4Da峰一样强。在此峰上执行的产物离子扫描显示m/z 197.0作为主要产物峰。这对应于辅酶Q10的基本环结构。
进行对m/z 197的前体离子扫描，并给出863.9Da作为主要前体峰。当850-900Da的m/z范围被放大时，观察到863.9的大峰，864.7Da的低强度峰和865.8的非常低强度的峰。这些峰对应于CoQ10的完全氧化形式(CoQ10)、部分还原形式(CoQ10H)以及完全还原形式(CoQ10H2)。
还原的CoQ10的分析
方法：
将5.032mg的CoQ10溶解在1mL的己烷中以得到5mg/mL母液的储备液。取100μL等分试样加入到900μL的己烷中以得到500μg/mL浓度的第二储备液。用1.9mL己烷稀释100μL的第二储备液，然后与50μL甲醇和20mg硼氢化钠混合。将还原反应物搅拌3分钟，并在室温下黑暗中静置5分钟。接着将含100mM的EDTA的1mL水加入到反应中。CoQ10H2的最终浓度为25μg/mL。对于质谱分析，在正ESI模式中进行Q1扫描。
结果：
用于还原形式的CoQ10的Q1扫描并未发现任何一致的和可能与分子的结构相关的分子离子峰。没有观察到任何预期的峰。对于这一点的可能原因是在还原过程的最后一步中EDTA的添加。EDTA可以连接到分子离子上，并形成不一致的加合物，导致不能再现的结果。
为了解决EDTA引起的不一致结果，重复上述还原步骤，但在最后的步骤中加入1mL不含EDTA的水。然后将反应物与5mM甲酸铵的甲醇溶液混合，并注入到质谱仪中。
在该注入中观察到两组峰，一组在863.8、864.8和865.8m/z处和另一组在880.4、881.3和882.4m/z处。这些峰对应于辅酶Q10的完全氧化形式(CoQ10)、部分还原形式(CoQ10H)和完全还原形式(CoQ10H2)。
在880.4、881.4和882.4m/z也观察到峰组，其对应于在863.8、864.8和865.8m/z处的分子峰的氨化加合物。对于所有上述峰值的产物离子扫描显示197.0为主要/唯一产物离子。
197.0的前体离子扫描显示全部以上两个m/z组的峰。由于氨加合物形成的该峰组显示出更高的强度，并以此作为前体离子用于完成质谱仪的参数。
实施例6--用于检测CoQ10和CoQ10H 2 的色谱参数的确定
方法：
将1mg的CoQ10溶解在1mL己烷中，将100μL此溶液加入到900μL的己烷中，产生100μg/mL的储备溶液。
对于还原反应，用1.9mL己烷稀释100μL的储备溶液，并与50μL甲醇和20mg硼氢化钠混合。将反应物搅拌3分钟，并在室温下黑暗中储存5分钟。通过反应物颜色从黄色变到无色，在视觉上确认氧化至还原形式的完全转化。接着，加入1mL的水并混合。将反应物以13000rpm离心2分钟以分离各层。收集含有浓度5μg/mL的CoQ10H2的顶部己烷层(CoQ10H2储备液)。
在另一个管中重复上述反应而不加入硼氢化钠。收集含有浓度5μg/mL的CoQ10的顶部己烷层(CoQ10储备液)。
使用10mM的甲酸铵甲醇溶液作为流动相A，1-丙醇作为流动相B和C18Zorbax柱进行液相色谱。以1:1的比例混合含CoQ10和CoQ10H2的储备液和注入色谱仪中。使用其中流动相A和B以20:80；50:50；80:20比例混合的流动相进行三个等度的5分钟运行。80:20的比例产生CoQ10和CoQ10H2峰的最佳分离。
实施例7-标准曲线
表6--用于标准曲线的样品的制备
使用在实施例6中所述的方法，用流动相A:B 80:20通过液相色谱方法分离样品。图4所示是对于CoQ10和CoQ10H2得到的标准曲线。
当用于标准曲线的样品使用HPLC级水代替己烷作为稀释剂，采用同样的LC-MS/MS条件制备，并且被用于运行时，在对于还原和氧化形式的CoQ10的任何浓度下没有看到可检测的面积指标。
使用用于从水中提取CoQ10的不同提取溶剂重复上面的实验。所测试的提取溶剂为100％的异丙醇、100％己烷和20:80的乙醇:己烷。使用各种提取溶剂提取用于标准曲线的三组样品。据观察，用相同的提取溶剂提取的所有样品中回收的面积相似，但各提取溶剂组的面积回收不同。没有提取溶剂在面积指标和掺入浓度之间给出线性关系。经证实，HPLC级水与己烷中的标准不是一致的，这可能是由于水的高极性。
为了解决己烷和水的不混溶性的问题，在温和氮气流中蒸发己烷中的CoQ10和CoQ10H2储备液，并重新溶解在甲醇中。然后将这些重构的标准用于制备用于标准曲线的样品，用HPLC水作为稀释剂，并使用上述的LC-MS/MS方法分析标准。这些样品当针对浓度作图时得到面积响应的线性曲线，如示于图6中。
使用如上所述的相同程序，CoQ10-d6内标也还原。当用己烷蒸发并甲醇重溶解制备内标的系列稀释时，观察到类似的线性关系。
己烷中的CoQ10和CoQ10H2储备液蒸发和在甲醇中重溶解。己烷中的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6储备液也被蒸发和在甲醇中重溶解。然后将这些重构的标准用于制备用于标准曲线的样品，用HPLC水作为稀释剂。将100μL的各样品等分至新管中，并用上述三种不同的提取溶剂提取。对于相同的提取溶剂组内的所有浓度的面积响应被发现是相似的，面积响应和浓度之间没有线性关系。
将己烷中的CoQ10、CoQ10H2、CoQ10-d6和CoQ10H2-d6储备液蒸发和重溶于甲醇中。然后将重构的标准用于制备用于标准曲线的样品，用血浆作为稀释剂，以得到CoQ10和CoQ10H2的19-2500ng/mL的线性浓度范围。将20μL的25μg/mL的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6加入到每个管中。随后，用1ml的乙醇:己烷20:80提取各样品。将每个样品剧烈涡旋4-5分钟，离心，并移取150μL的顶层放入LC-MS/MS小瓶中用于分析。所有上述步骤使用冷却至-20℃的低温模块尽可能快地进行，并注入来自每个管的10μL用于LC-MS/MS分析。
在面积比率和掺入浓度之间观察到线性关系。由于氧化和还原形式的高浓度，峰之间存在重叠，且因此没有观察到基线分离。
在下面的实验中，50μL的标准被用作起始点和使用1.5mL的提取溶剂。尝试不同的注射量。注入3μL的标准给出了具有线性响应和r2值≥0.99的基线分离色谱。
实施例8--血浆样品中总CoQ10的定量
在该实验中，测定不同血浆样品中的总CoQ10的量。将各血浆样品的单一异丙醇提取用于提取CoQ10，其随后用LC-MS/MS定量。构建如图6的曲线图所示的标准曲线，其中使用含有0、3、5、10、50、100、300、500、800和1000μg/mL的CoQ10的样品，分析一式两份地进行。对于CoQ10浓度范围在5至800μg/mL内的样品，用于标准曲线的样品中CoQ10浓度测量的计算的％精度为从91.3％至113％。各自含有未知量的CoQ10的血浆样品的分析结果被列于下面的表7中。
表7-血浆样品中CoQ10
实施例9--细胞上清液中总CoQ10的定量
本实验设计用于评估培养的细胞在暴露于含有CoQ10的制剂后对CoQ10的摄取。根据已知的方案培养Caco-2细胞并暴露于含有CoQ10的制剂0、1、2、3、4和6小时。洗涤和裂解后，将细胞裂解液用异丙醇提取，并通过LC/MS测定提取物中CoQ10的量。如图7的曲线图中所示的标准曲线使用含有0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、3、5、7和10μg/mL的CoQ10的样品构建。对于具有0.5至10μg/mL的CoQ10浓度范围的样品，用于标准曲线的样品中CoQ10浓度测量的计算的％精度为从87.6％至107％。掺杂细胞培养基(未知样品A-H)和细胞上清液(未知样品的I-L)的分析结果列于下表中。
表8-在培养细胞裂解液中的CoQ10
实施例10--洗鼻液中总CoQ10的定量
本实验设计用于评估在施用专用的CoQ10鼻制剂后鼻腔内粘膜对CoQ10的摄取。将专用制剂向大鼠鼻内给药后，在30分钟和在1小时后从大鼠鼻腔收集粘液和液体，用异丙醇提取，并通过LC-MS/MS测定提取物中CoQ10的量。使用含有0、1、5、10、50、100、300、800和1000μg/mL的CoQ10的样品构建如图8的曲线图中所示的标准曲线。对于所有标准样品，计算的用于标准曲线的样品中CoQ10浓度测量的％精度是从90.5％至114％。细胞提取物的分析结果示于下表中，其中M1、M2、M3、M4和M5指不同的大鼠个体。
表9--洗鼻液中的CoQ10
实施例11--组织中总CoQ10的定量
本实验设计用于测定施用专用CoQ10制剂的小鼠的不同的组织中存在的CoQ10的量。给药后，在0.5、1、3、8、24或48小时将小鼠处死。将肺、肝脏和肾脏匀浆，并将匀浆液用异丙醇提取。通过LC-MS/MS测定提取物中CoQ10的量。图9中的曲线图所示的标准曲线用含有1、5、10、50、100、300和600μg/mL的CoQ10的样品构建。对于所有标准样品，计算的用于标准曲线的样品中CoQ10浓度测量的％精度是从90.2％至121％。组织提取物的分析结果示于下表中，其中P1和P2是指两个小鼠个体。
表10--组织中的CoQ10
实施例12--血清中氧化和还原形式的CoQ10的定量
在该实验中，对血清样品中氧化和还原形式的CoQ10的量进行测定。在样品中掺入CoQ10-d6和CoQ10H2-d6内标，使用1-丙醇的单一提取从每个血清样品提取CoQ10和CoQ10H2，用LC-MS/MS定量CoQ10和CoQ10H2。使用柱Agilent C181-Poroshell(2.1μ粒径)和具有5mM甲酸铵的甲醇:1-丙醇80:20作为流动相实施色谱分离。质谱方法包括在单次运行中同时定量还原和氧化形式的CoQ10，其对于氧化形式的CoQ10通过监测m/z 880到m/z 197的过渡和对于还原形式的CoQ10通过监测m/z 882到m/z 197的过渡而完成。所有样品均用冷却的低温模块操作以最小化CoQ10H2的氧化。标准曲线是使用含有0、20、40、158、313、625、1250和2500ng/mL的CoQ10的样品(样品L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8)构建的。还分析了来自美国国家标准与技术研究所的标准(NIST1、NIST2和NIST3)。对于所有标准样品，计算的用于标准曲线的样品中CoQ10浓度测量的％精度是从86.5％至118％。用于氧化的CoQ10和还原的CoQ10(CoQ10H2)的标准曲线和代表性色谱图分别示于图10和11中，且原始质谱数据列于下表11中。对应于标有“-ox”的样品的所有数据都为氧化形式的CoQ10，而对应于标“-red”的样品的数据与还原形式的CoQ10对应。标记QC1、QC2和QC3的样品对应于含有血清的质量对照样品，其掺入与用于制备标准曲线的样品不同批次的CoQ10。
表11--血清中氧化和还原形式CoQ10定量的原始数据
实施例13--血浆中氧化和还原形式的CoQ10的定量
在该实验中，对血浆样品中氧化和还原形式的CoQ10的量进行测定。在样品中掺入CoQ10-d6和CoQ10H2-d6内标，使用己烷和1-丙醇提取从各血浆样品提取CoQ10和CoQ10H2，用LC-MS/MS定量CoQ10和CoQ10H2。使用柱Agilent C181-Poroshell(2.1μ粒径)和具有5mM甲酸铵的甲醇:1-丙醇80:20作为流动相实施色谱分离。质谱方法包括在单一运行中同时定量还原和氧化形式的CoQ10，其对于氧化形式的CoQ10通过监测m/z 880到m/z 197的过渡和对于还原形式的CoQ10通过监测m/z 882到m/z 197的过渡而完成。所有样品均用冷却的低温模块操作以最小化CoQ10H2的氧化。标准曲线使用含有0、20、158、625、1250和2500ng/mL的CoQ10的样品(样品L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8)构建。对于所有标准样品，计算的用于标准曲线的样品中CoQ10浓度测量的％精度是从84.8％至119％。氧化的CoQ10和还原的CoQ10(CoQ10H2)的标准曲线和代表性色谱图分别示于图12和13中，和原始质谱数据列于下表12中。对应于标有“-ox”的样品的所有数据为氧化形式的CoQ10，而对应于标记“-red”的样品数据与还原形式的CoQ10对应。标记QC1、QC2和QC3的样品对应于含有血浆的质量对照样品，其掺入与用于制备标准曲线的样品不同批次的CoQ10。
表12--血浆中氧化和还原形式的CoQ10定量的原始数据
IV.等同
本领域的技术人员可以认识到或者能够只使用常规实验确定许多本文所述的具体的实施方式和方法的等同方式。这些等同方式意在被包含在以下的权利要求的范围中。
V.相关参考
在本申请中引用的所有出版物和专利文献用于所有目的在相关部分通过引用而引入，其程度就像每个单独的出版物或专利文件被单独指示一样。对于本文中各种参考文献的引用，申请人并不是承认任何特定的参考文献对于其公开内容是“现有技术”。应当理解的是，虽然本发明已结合了它们的详细说明进行描述，但前面的描述意在说明而不是限制本公开的范围，这是由所附的权利要求的范围所定义的。其它方面、优点和修改均在所附权利要求及其等同物的范围之内。
所有图形以说明的方式提供，而不是以限制的方式。虽然提供了具体的实施例，该描述是说明性的而不是限制性的。前述实施方式的任一个或多个特征可以与本发明的任何其他实施方式的一个或多个特征以任何方式进行组合。此外，本发明的许多变化对于阅读本公开内容的本领域技术人员是清楚的。

Claims (95)

1.一种用于测定样品中辅酶Q10(CoQ10)的量的方法，所述方法包括：
向所述样品中加入第一提取缓冲液和第二提取缓冲液，其导致所述样品的相分离；和光谱学地分析所述第二提取层来测定CoQ10的量。
2.一种用于测定样品中CoQ10的量的方法，所述方法包括：
向所述样品中加入第一提取缓冲液和第二提取缓冲液；
混合所述样品；和
分析所述第二提取层以测定CoQ10的量，其中所述第一提取缓冲液和第二提取缓冲液的单次提取导致比使用单独甲醇的提取检测到至少2倍的CoQ10量。
3.一种用于测定样品中CoQ10的量的方法，所述方法包括：
向所述样品中加入第一提取缓冲液；
加热并混合所述样品；
向所述样品中加入第二提取缓冲液，其导致所述样品的相分离；
加热并混合所述样品；
冷却所述样品至环境温度；及
分析所述第二提取缓冲液层以测定样品中CoQ10的量。
4.一种用于测定样品中CoQ10的量的方法，所述方法包括：
向所述样品中加入第一提取缓冲液；
加热并混合所述样品；
向所述样品中加入第二提取缓冲液，其导致所述样品的相分离；
加热并混合所述样品；
冷却所述样品至环境温度；及
通过光谱分析对第二提取缓冲液层进行光谱学分析，以测定样品中CoQ10的量，其中用提取缓冲液的单次提取导致比使用单独甲醇提取随后是液相色谱/质谱/质谱(LC/MS/MS)提取到至少2倍的CoQ10量。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在样品中检测到的CoQ10的量是通过光谱分析法光谱学地测定的。
6.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中CoQ10的量用LC/MS/MS检测。
7.如权利要求2或4中任一项所述的方法，其中所述使用第一提取缓冲液和第二提取缓冲液提取的CoQ10的量光谱学地测定，和用单独甲醇提取检测的CoQ10的量使用LC/MS/MS测定。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法是高通量筛选分析方法的部分。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中整个方法通过自动化完成。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中整个方法在短的时间段中完成。
11.如权利要求1、3-4和7-10中任一项所述的方法，其中与使用单独甲醇提取随后LC/MS/MS的CoQ10检测而检测到的CoQ10的总量相比，所述样品使用第一提取缓冲液和第二提取缓冲液提取并且CoQ10的量光谱学地测定，在样品中检测到的CoQ10的总量至少为2倍。
12.如权利要求11所述的方法，其中与使用单独甲醇提取随后LC/MS/MS的CoQ10检测而检测到的量相比，所述样品使用第一提取缓冲液和第二提取缓冲液提取并且CoQ10的量光谱学地测定，在样品中检测到的CoQ10的总量为至少5倍。
13.如权利要求11所述的方法，其中与使用单独甲醇提取随后LC/MS/MS的CoQ10检测而检测到的量相比，所述样品使用第一提取缓冲液和第二提取缓冲液提取并且CoQ10的量光谱学地测定，在样品中检测到的CoQ10的总量为至少10倍。
14.如权利要求11所述的方法，其中与使用单独甲醇提取随后LC/MS/MS的CoQ10检测而检测到的量相比，所述样品使用第一提取缓冲液和第二提取缓冲液提取并且CoQ10的量光谱学地测定，在样品中检测到的CoQ10的总量为至少15倍。
15.如权利要求11所述的方法，其中与使用单独甲醇提取随后LC/MS/MS的CoQ10检测而检测到的量相比，所述样品使用第一提取缓冲液和第二提取缓冲液提取并且CoQ10的量光谱学地测定，在样品中检测到的CoQ10的总量为至少25倍。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二提取缓冲液包含非极性溶剂。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二提取缓冲液包含有机溶剂。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二提取缓冲液包含选自于苯、甲苯、二甲苯、己烷、庚烷、辛烷、环己烷、1,4-二氧六烷、氯仿、二***、二异丙醚和二异丁基醚、四氯化碳、二甲基甲酰胺(DMF)、氯甲烷和二氯甲烷的溶剂。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二提取缓冲液包含烷烃。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二提取缓冲液包含己烷。
21.根据权利要求1-15和17中任一项所述的方法，其中所述第二提取缓冲液包含乙腈。
22.根据权利要求1-15和17中任一项所述的方法，其中所述第二提取缓冲液包含异丙醇。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液包含极性质子溶剂。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液包含有机溶剂。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液包含选自于甲酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇，乙醇、甲醇、乙酸、三氯乙酸(TCA)和水的溶剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述溶剂包含醇。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述醇是甲醇。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液包含表面活性剂。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液包含去垢剂。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述去垢剂是温和的去垢剂。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液是水性溶液。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液包含类固醇酸。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述类固醇酸是胆汁酸。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述胆汁酸包含选自于牛黄胆酸、甘氨胆酸、胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸和石胆酸的酸。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述胆汁酸包含脱氧胆酸。
36.如权利要求35所述的方法，其中脱氧胆酸是盐。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述脱氧胆酸盐包含的无机离子是I族金属。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述脱氧胆酸盐的无机离子包含作为选自于Li+、Na+和K+的盐的无机离子。
39.如权利要求34所述的方法，其中所述脱氧胆酸盐的无机离子包含作为钠离子的无机离子。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品包含生物样品。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述生物样品是基于细胞的样品。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品包含哺乳动物样品或两栖动物样品。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品包含选自于人类样品、非人灵长类动物样品和啮齿动物样品的样品。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是来自于选自小鼠、大鼠、豚鼠、兔和人的受试者的样品。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述光谱分析通过使用选自于吸收光谱法、荧光X射线光谱法、火焰光谱法、可见光谱法、紫外光谱法、红外光谱法、近红外光谱法、拉曼光谱法、相干反斯托克斯拉曼光谱法(CARS)、核磁共振光谱法、光子发射光谱法和穆斯堡尔光谱法的光谱技术进行。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述光谱技术是紫外光谱法。
47.如权利要求45或46所述的方法，其中所述紫外光谱法在270nm至280nm的一个或多个波长处进行。
48.如权利要求45或46所述的方法，其中所述紫外光谱法在273nm至277nm的一个或多个波长处进行。
49.如权利要求45或46所述的方法，其中所述紫外光谱在275nm的波长处进行。
50.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液的体积与所述第二提取缓冲液的体积之比是5:1至1:1。
51.如权利要求28至50中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂或去垢剂与所述第一提取缓冲液的体积之比为50:1至1:1。
52.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲液、第二提取缓冲液或第一和第二提取缓冲液两者后加热至50-100℃。
53.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲液、第二提取缓冲液或第一和第二提取缓冲液两者后加热至55-75℃。
54.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲液、第二提取缓冲液或第一和第二提取缓冲液两者后加热至60-70℃。
55.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲液、第二提取缓冲液或第一和第二提取缓冲液两者后加热至65℃。
56.如权利要求52至55中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲液和所述第二提取缓冲液后加热至相同的温度。
57.如权利要求52至55中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲液和所述第二提取缓冲液后加热至不同的温度。
58.如权利要求52至57中任一项所述的方法，其中所述的加热持续至少5秒、至少10秒、至少15秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少60秒、至少75秒、至少90秒、至少105秒或至少120秒的时间。
59.如权利要求52至58中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲液和所述第二提取缓冲液后加热相同的时间量。
60.如权利要求52至58中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲液和所述第二提取缓冲液后加热不同的时间量。
61.如权利要求52至60中任一项所述的方法，其中与没有被加热的对照样品相比，加热样品提高CoQ10的提取至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少50％。
62.如权利要求2-61中任一项所述的方法，其中所述样品通过机械搅拌混合。
63.如权利要求2-61中任一项所述的方法，其中所述样品通过超声处理混合。
64.如权利要求2-61中任一项所述的方法，其中所述样品通过磁力搅拌混合。
65.如权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述样品在加入所述第一提取缓冲液后混合。
66.如权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述样品在加入所述第二提取缓冲液后混合。
67.如权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述样品在加入所述第一提取缓冲液和所述第二提取缓冲液后混合。
68.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在加入所述第二提取缓冲液后向所述样品中加入无机盐。
69.如权利要求68的方法，其中所述无机盐包括NaCl。
70.根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中在加入所述第二提取缓冲液后，向所述样品中添加饱和盐水溶液。
71.如权利要求68至70中任一项所述的方法，其中所述盐被添加至约1mM至约50mM的终浓度。
72.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述第二提取缓冲液的光谱分析前过滤所述样品。
73.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中整个方法在10分钟内完成。
74.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中整个方法在5分钟内完成。
75.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中整个方法在1分钟内完成。
76.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中整个方法在30秒内完成。
77.一种用于实施前述权利要求中任一项所述的方法的试剂盒。
78.如权利要求77所述的试剂盒，包含如下的至少两种：第一提取缓冲液、第二次提取缓冲液和CoQ10。
79.一种用于测定样品中辅酶Q10(CoQ10)的量的方法，所述方法包括：
a)向所述样品中加入已知量的氘化辅酶Q10(CoQ10-d6)；
b)通过质谱检测CoQ10和CoQ10-d6；和
c)通过与已知量的检测到的CoQ10-d6相比较来测定检测到的CoQ10的量。
80.一种用于测定样品中还原形式的CoQ10(CoQ10H2)的量的方法，所述方法包括：
a)向所述样品中加入已知量的还原的氘化辅酶Q10(CoQ10H2-d6)；
b)通过质谱检测CoQ10H2和CoQ10H2-d6；和
c)通过与已知量的检测到的CoQ10H2-d6相比较来测定检测到的CoQ10H2的量。
81.一种用于同时测定样品中CoQ10和CoQ10H2的量的方法，所述方法包括：
a)向所述样品中加入已知量的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6；
b)通过质谱检测CoQ10、CoQ10H2、CoQ10-d6和CoQ10H2-d6；和
c)通过与已知量的检测到的CoQ10H2-d6相比较来测定检测到的CoQ10的量；和
d)通过与已知量的检测到的CoQ10H2-d6相比较来测定检测到的CoQ10H2的量。
82.一种用于测定样品中CoQ10H2氧化程度的方法，所述方法包括：
a)向所述样品中加入已知量的CoQ10H2-d6和/或CoQ10-d6；
b)通过质谱测量所述样品中CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相对量；和
c)将CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的理论相对量与在步骤b中测量的CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相对量相比较。
83.如权利要求80-82所述的方法，其中通过将CoQ10-d6与一种或多种还原剂进行反应而获得CoQ10H2-d6。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述还原剂是硼氢化钠。
85.如权利要求81-84所述的方法，其中在样品收集后立即将CoQ10-d6和/或CoQ10H2-d6加入到所述样品中。
86.如权利要求81-85所述的方法，其中所述样品是生物样品。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述生物样品是血浆或血清。
88.如权利要求86或87所述的方法，其中所述生物样品是人类样品。
89.一种用于测定样品中CoQ10的量的方法，所述方法包括：
a)提供所述样品；
b)向所述样品中加入已知量的CoQ10-d6；
c)提取所述样品；
d)任选地将所述样品进行液相色谱；
e)通过质谱检测CoQ10和CoQ10-d6；和
f)通过与已知量的检测到的CoQ10-d6相比较来测定检测到的CoQ10的量。
90.一种用于测定样品中CoQ10H2的量的方法，所述方法包括：
a)提供所述样品；
b)向所述样品中加入已知量的CoQ10H2-d6；
c)提取所述样品；
d)任选地将所述样品进行液相色谱；
e)通过质谱检测CoQ10H2和CoQ10H2-d6；和
f)通过与已知量的检测到的CoQ10H2-d6相比较来测定检测到的CoQ10H2的量。
91.一种用于测定样品中CoQ10和CoQ10H2的量的方法，所述方法包括：
a)提供所述样品；
b)向所述样品中加入已知量的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6；
c)提取所述样品；
d)任选地将所述样品进行液相色谱；
e)通过质谱检测CoQ10、CoQ10-d6、CoQ10H2和CoQ10H2-d6；
f)通过与已知量的检测到的CoQ10-d6相比较来测定检测到的CoQ10的量；和
g)通过与已知量的检测到的CoQ10H2-d6相比较来测定检测到的CoQ10H2的量。
92.如权利要求89-91所述的方法，其中步骤c包括加入提取缓冲液。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述提取缓冲液包含1-丙醇。
94.如权利要求92所述的方法，其中所述提取缓冲液包含异丙醇。
95.如权利要求89-94所述的方法，其中步骤b-d使用预冷的低温模块实施。
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