CN104224781B - 一组2-酰胺基-3-烷氧基取代的吡啶类化合物及其新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了2‑酰胺基‑3‑烷氧基取代的吡啶类化合物制备方法及其在治疗和/或预防动脉粥样硬化心血管疾病中的应用。实验证明，本发明所述化合物或药物组合物具有上调或稳定ABCA1、SR‑BI/CLA‑1，能够抑制巨噬细胞泡沫化或增强巨噬细胞胆固醇流出。表明该类化合物具有降脂、降胆固醇作用，具有成为治疗降血脂、动脉粥样硬化和心血管病等疾病药物的应用前景。

Description

一组2-酰胺基-3-烷氧基取代的吡啶类化合物及其新用途

技术领域

本发明涉及一类2-酰胺基-3-烷氧基吡啶类化合物，应用于动脉粥样硬化心血管疾病的治疗和/或预防，属于制药领域；本发明涉及所述化合物在上调或稳定ABCA1、SR-BI/CLA-1，降脂、降胆固醇药物的用途；本发明又涉及所述化合物的制备方法；本发明还涉及所述化合物的药物组合物。

背景技术

心血管疾病在发达国家和大多数发展中国家是危害人类健康的主要杀手，近年来随着人们物质生活水平的提高，心脑血管疾病的发病率呈明显上升趋势，心脑血管疾病死亡占全球人口死亡的构成已达1/3。动脉粥样硬化(Atherosclerosis)是多种严重心血管疾病(如冠心病、心绞痛、心肌梗塞、脑卒中等)的病理基础。

外周细胞内胆固醇代谢障碍是动脉粥样硬化的重要发病机制，过量胆固醇从肝外组织中的清除是预防和治疗动脉粥样硬化的关键步骤。高密度脂蛋白(HDL)将外周组织中的胆固醇转运到肝脏再次代谢或以胆酸的形式***，这一过程被称为胆固醇逆转运(RCT)【1，2】。RCT及胆固醇排除途径是治疗动脉粥样硬化的有效手段。

临床上目前应用的动脉粥样硬化药物治疗包括扩张血管药物、调整血脂药物、抗血小板药物等。目前广泛应用的他汀类是治疗相关疾病的一线药物，其作用机制是抑制体内羟甲戊二酰辅酶A还原酶活性，抑制胆固醇的生物合成和增强外周细胞对胆固醇摄取的LDL受体调节通路来实现抗动脉粥样硬化的，但仅可以降低20％～40％的心血管事件，长期服用还会导致胃肠功能紊乱综合症、皮疹、精神抑郁、横纹肌溶解以及肝脏损伤等严重不良反应。因此，迫切需要开发新的心血管药物【3-5】。

清道夫受体BI(scavenger receptor class B type I，SR-BI)为功能性的HDL受体，人的高密度脂蛋白受体亦被称作CLA-1。SR-BI/CLA-1是HDL代谢的主要调节者之一，在RCT过程中起着关键作用，被认为是发现新型心血管药物潜在的新靶标【6】。RCT的增强将有利于AS病灶积蓄的胆固醇减少和病变的逆转，因此可以通过升高SR-BI/CLA-1表达水平来加速RCT，促进机体富余胆固醇酯的清除。

ATP结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)是ATP结合盒转运体超家族成员之一，是一种重要的以ATP为能源转运各种离子、脂类等细胞代谢物的膜转运蛋白。ABCA1可介导细胞内磷脂和游离胆固醇转运至贫脂或无脂的载脂蛋白A-I(apoA-I)，从而促进高密度脂蛋白(HDL)生成，启动胆固醇逆转运过程，在机体清除多余脂质的过程中发挥重要作用。ABCA1基因突变可导致严重的HDL缺乏综合症-Tangier Disease(TD)，患者以血浆HDL及apoA-I严重缺乏和组织巨噬细胞内胆固醇酯增多为主要特征，常伴有高胆固醇血症、心血管疾病和AS【7】。对转基因小鼠的研究表明ABCA1过度表达使apoA-I介导的胆固醇流出明显增加，血浆HDL水平显著升高，而且ABCA1蛋白水平与胆固醇流出增加 及HDL水平升高明显相关。因此，SR-BI/CLA-1和/或ABCA1可以作为治疗高血脂以及动脉粥样硬化为基础的心脑血管疾病的新靶点。能增加SR-BI/CLA-1和/或ABCA1基因表达或功能的化合物有希望成为有效治疗高血脂以及动脉粥样硬化等心血管疾病新型药物先导物。

总之，临床上使用的他汀类治疗药物也存在较重的副作用，目前尚缺乏治疗动脉粥样硬化的特效药物。为获得组织特异性更强、通过调节RCT关键受体从而促进胆固醇外排、减少脂质聚积，从而起到预防和/或治疗动脉粥样硬化新型药物，利用中国医学科学院医药生物技术研究所国家新药(微生物)筛选实验室构建的ABCA1和SR-BI/CLA-1上调剂筛选模型进行广泛筛选，发现一组2-酰胺基-3-烷氧基取代的吡啶类化合物具有明显上调ABCA1和SR-BI/CLA-1的活性，并且在体外测定了确认其有抗动脉粥样硬化心血管疾病活性。2-酰胺基-3-烷氧基取代的吡啶类化合物在抗动脉粥样硬化作用方面未见有文献报道，系本专利申请的首次发现。这组2-酰胺基-3-烷氧基取代的吡啶类化合物与临床上使用的他汀类药物相比，结构没有相似性，并且发挥抗动脉粥样硬化作用机制不同，有望成为特异性调节RCT关键受体、降低脂质、降低胆固醇，从而成为抗动脉粥样硬化乃至心血管作用的治疗药物。因此，这组2-酰胺基-3-烷氧基取代的吡啶类化合物有可能是具有新作用机制的抗动脉粥样硬化化合物，具有广阔的开发应用前景。

发明内容

本发明所述的2-酰胺基-3烷氧基取代的吡啶类化合物在制备具有上调人ATP结合盒转运体A1(ABCA1)和/或清道夫受体BI(CLA-1/SR-B1)表达活性的药物中的应用，其结构如通式(I)所示：

其中，n=0-4，代表包含杂原子在内的原子个数在0-4之间的直链烷烃基；R1代表H原子或C1-C4的烷基；R2，R3，R4独立的代表C1-C3的烃基，C1-C3的烃氧基，卤原子或H原子；R5独立的代表包含有H，C1-C4烃基，C1-C3烷氧(硫)基，卤原子，1，3-二氧(硫)环戊烷基取代的苯环、吡啶环、嘧啶环、哌啶环、哌嗪环、C3-C6的环烷烃、1，2，3-三氮唑、1,2,4-三氮唑、吡咯环、呋喃环、噁唑环、咪唑环、噻吩环、噻唑环及苯并咪唑、苯并噻唑、苯并噁唑、苯并呋喃、苯并噻吩或吲哚环。

式(I)所示化合物中，R1优选的是H，烷基优选为甲基或叔丁基，烷氧(硫)基优选为三氟甲氧基或三氟甲硫基，R5所代表的环系优选的是苯环、呋喃环、吡咯环、咪唑环或苯并咪唑环；n优选的是0，即代表苯甲酸类结构片段。

制备所述化合物的采用酰胺类化合物的通用方法。主要步骤是，用不同环系取代的羧酸 (III)和取代的2-氨基-3-烷氧基吡啶类化合物(II)作为原料，以EDCI作为缩合剂，在适当的溶剂和温度条件下，最终合成得到通式(I)中相应的化合物，通式合成路线如下：

按照以上所述路线和方法，能够稳定、可重复性地合成得到本发明所述所有化合物。

本发明所述上调人ATP结合盒转运体A1(ABCA1)和/或清道夫受体BI(CLA-1/SR-B1)表达药物为治疗和/或预防心血管疾病的药物。

本发明所述上调人ATP结合盒转运体A1(ABCA1)和/或清道夫受体BI(CLA-1/SR-B1)表达活性的药物为降低脂质药物或降低胆固醇的药物。

本发明所述上调人ATP结合盒转运体A1(ABCA1)和/或清道夫受体BI(CLA-1/SR-B1)表达活性的药物为抗动脉粥样硬化的药物。

本发明还提供所述化合物的组合物在制备具有上调人ATP结合盒转运体A1(ABCA1)和/或清道夫受体BI(CLA-1/SR-B1)表达活性的药物中的应用。

本发明所述化合物的组合物上调人ATP结合盒转运体A1(ABCA1)和/或清道夫受体BI(CLA-1/SR-B1)表达或增加稳定活性的药物为降低脂质药物或降低胆固醇的的药物。

本发明所述化合物的组合物上调人ATP结合盒转运体A1(ABCA1)和/或清道夫受体BI(CLA-1/SR-B1)表达活性的药物为抗动脉粥样硬化的药物。

本发明所述化合物的组合物上调人ATP结合盒转运体A1(ABCA1)和/或清道夫受体BI(CLA-1/SR-B1)表达活性的药物为治疗和/或预防心血管疾病药物。

本发明所述药物组合物的各种剂型，可以按照药学领域的常规生产方法制备，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明所述化合物的药物组合物，其特征在于它以含有治疗有效量的所述化合物为活性成分，并含有一种或多种药学上可接受的载体。

本发明人利用本实验室建立的人ABCA1、CLA-1/SR-B1和CLAp-3′UTR筛选模型对专利化合物的活性进行评价，选用0.1％DMSO为阴性对照，9CRA为阳性对照，测定所有化合物在10μg/ml浓度下在模型(ABCA1、CLA-1、CLAp-3′UTR)中的上调率。多次活性测定实验结果证明，本发明所有化合物在ABCA1CLAp-3′UTR模型上均有上调作用，部分化合物的活性和测定结果如表1所示。表1仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明发现通式(I)中LX-1，3，5，7，10，19，20，22，23等具有上调ABCA1和CLA-1的作用。其中，尤其LX-1、LX-3、LX-5、LX-7显示出良好的上调ABCA1和CLA-1的活性，并提供了它们在治疗动脉粥样硬化方面的应用，为该类衍生物发展成为一类新型抗 动脉粥样硬化药物奠定了基础。LX-1在ABCA1、CLA-1、CLAp-3′UTR三个模型上均能剂量依赖性上调ABCA1、CLA-1、CLAp-3′UTR的表达，EC50分别为0.089、0.027和3.5μg/ml(图1)。将LX-1(0.24、1.2、6.0和30.0μg/ml)作用于RAW264.7或HepG2细胞18-24h，western blot结果显示，这两个化合物能在蛋白(图2)水平明显上调RAW264.7细胞中ABCA1和SR-BI的表达。由此证明，本发明所述化合物或组合物可以作为上调ATP结合盒转运子ABCA1或高密度脂蛋白受体CLA-1/SR-B1表达活性的药物。

在本发明中，所述抑制巨噬细胞泡沫化是指利用人或小鼠初生代或永生单核细胞经诱导变性形成巨噬细胞后，在摄取大量的变性脂蛋白或负电性磷脂后形成的大量中性脂质的蓄积，油红O染色后形成的大量的红色脂滴显著减少。当LX-1、LX-3、LX-5、LX-7(化合物浓度均为10μg/ml)分别作用于富脂的小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7后，油红O染色结果表明，所述化合物能明显减少脂质在巨噬细胞内的聚积，具有显著的抑制巨噬细胞泡沫化(图3)的活性，降低脂质含量。由此证明，本发明所述化合物或组合物可以作为减少脂质聚积的降脂药物。

将LX-1、LX-3、LX-5、LX-7(化合物浓度均为10，μg/ml)分别作用于胆固醇蓄积的小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7后，以apoA-I或者HDL作为胆固醇接受体，闪烁仪分别测定细胞内和细胞外胆固醇的含量，计算胆固醇流出率(细胞内和细胞总的胆固醇的量的比值，总胆固醇是胞内和胞外的和)。与空白对照相比，LX-1、LX-3、LX-5、LX-7均能促进胆固醇流出到细胞外，且能增加胆固醇外流量到150％以上，说明LX-1、LX-3、LX-5、LX-7具有促进胆固醇外排的作用(图4)，降低胆固醇含量。由此证明，本发明所述化合物或组合物可以作为减少胆固醇的降低胆固醇药物。

ApoE-/-小鼠高脂饮食两个月，构建动脉粥样硬化模型，LX-1给药2个月，血脂结果显示，LX-1能显著降低血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度的蛋白胆固醇(LDL-C)水平(表2)。由此证明，本发明所述化合物或组合物可以在动物体内降低胆固醇，可以作为抗动脉粥样硬化心血管药物。

发明的有益效果

1)作用靶点的新颖性：目前研究表明ABCA1和CLA-1是抗动脉粥样硬化的新靶点，在动脉粥样硬化的发生、发展具有重要影响，但尚未有作用于此靶点的药物出现。

2)化合物的新颖性：本发明第一次阐述了2-酰胺基-3-烷氧基取代的吡啶类化合物在动脉硬化心血管方面的确切作用，并且从首次从分子机制阐述其抗动脉硬化作用的原因，这在国内外属首次，这对于我国开发具有自主知识产权的抗动脉粥样硬化药物具有重要的意义。同时，本发明也说明以ABCA1和CLA-1为靶点可以筛选到新的、有效的抗动脉粥样硬化的先导化合物。

3)动脉硬化心血管疾病的预防和治疗：血管疾病尤其是动脉粥样硬化已严重威胁到人类的生命健康，已有的药物早己不能满足临床的需求，不能从根本上治疗。本发明发现的化 合物在动物体内具有良好的抗动脉粥样硬化效果，为开发抗动脉硬化药物提供了很好的先导化合物，具有广阔的应用前景。

表1部分化合物在10μg/ml浓度对CLAp-3’UTR、ABCA1和CLA-1/SR-B1的改变率

表2LX-1对高脂饮食的高脂饮食apoE-/-小鼠血脂的影响(mg/dL)

附图说明

图1为LX-1在ABCA1、CLA-1、CLAp-3′UTR筛选模型中的量效关系曲线。

图2为LX-1增加HepG2细胞中ABCA1和SR-BI/CLA-1表达，其中LX-1浓度分别为0.24、1.2、6.0和30.0μg/ml。

图3化合物抑制巨噬细胞泡沫化，其中a：空白对照;b：阳性对照(Ox-LDL)；c-f依次为：LX-1、LX-3、LX-5、LX-7(化合物浓度均为10μg/ml)。

图4化合物促进胆固醇流出，其中LX-1、LX-3、LX-5、LX-7诱导RAW264.7细胞中胆固醇流出至ApoA-I，化合物浓度均为10.0μg/ml。

具体实施方式

以下部分化合物的制备实施例可以使专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明，所有化合物的结构均经1H NMR和MS(ESI)所确定。

实施例1N-(3-羟基-2-吡啶基)-4-(1，3-二硫代-2-环戊烷基)苯甲酰胺(LX-1)的制备

按照实施例1的操作方法，以0.23g(0.001mol)4-(1，3-二硫代-2-环戊烷基)苯甲酸和0.11g(0.001mol)2-氨基-3-吡啶醇投料，得LX-1纯品0.31g白色固体，产率97％。MS(ESI， m/z)：319[M]+，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：10.568(s，1H，NH-CO)，9.856(s，1H，-OH)，7.977(m，2H，Ph-H)，7.655(m，2H，Ph-H)，7.341(dd，1H，J=8.0Hz，1.5Hz,Py-6H)，7.224(dd，1H，J=8.0Hz，5.0Hz，Py-4H)，5.843(s，1H，SCHS)，5.337(t，1H，J=5.0Hz，Py-5H)，3.57(m，2H，CH2)，3.396(m，2H,CH2)

实施例2N-(3-羟基-2-吡啶基)-4-三氟甲氧基苯甲酰胺(LX-3)的制备

按照实施例1的操作方法，以0.21g(0.001mol)4-三氟甲氧基苯甲酸和0.11g(0.001mol)2-氨基-3-吡啶醇投料，得LX-3纯品0.25g黄色固体，产率84％。MS(ESI，m/z)：299[M]+，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：8.151(m，1H，Ph-H)，7.960(d，1H，J=5.0Hz，Py-6H)，7.530(m，1H，Ph-H)，7.326(d，1H，J=7.5Hz，Py-4H)，7.203(m，1H，NH-CO)，6.654(s，1H，-OH)，5.337(t，1H，J=5.0Hz，Py-5H)，

实施例3N-(3-羟基-2-吡啶基)-4-碘苯甲酰胺(LX-5)的制备

按照实施例1的操作方法，以0.25g(0.001mol)4-碘苯甲酸和0.11g(0.001mol)2-氨基-3-吡啶醇投料，得LX-5纯品0.36g白色固体，产率90％。MS(ESI，m/z)：341[M]+，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：7.957(s，1H，NH)，7.924(m，2H，Ph-2H)，7.650(s，1H，Py-6)，7.323(m，2H，Ph-2H)，7.199(s，1H，OH)，5.337(m，2H，Py-4,5H)，

实施例4N-(3-羟基-2-吡啶基)-4-三氟甲硫基苯甲酰胺(LX-7)的制备

将4-三氟甲硫基苯甲酸0.25g(0.0011mol)溶于30mL二氯甲烷中，继续加入0.23g(0.0012mol)EDCI，在室温搅拌30分钟后，加入2-氨基-3-吡啶醇0.11g(0.001mol)，室温反应12h，TLC检测反应完全，停止反应。反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。蒸除溶剂后经硅胶层析柱分离洗脱得LX-7纯品0.27g白色固体，产率96％。MS(ESI，m/z)：315[M]+，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：8.126(m，2H，Ph-H)，7.968(d，1H，J=5.0Hz，Py-6H)，7.885(m，2H，Ph-H)，7.340(d，1H，J=8.0Hz，Py-4H)，7.223(m，1H，NH-CO)，6.654(s，1H，-OH)，5.337(t，1H，J=5.0Hz，Py-5H)

实施例5N-(3-羟基-2-吡啶基)-5-甲基呋喃-2-甲酰胺(LX-9)的制备

按照实施例1的操作方法，以0.13g(0.001mol)5-甲基呋喃-2-甲酸和0.11g(0.001mol)2-氨基-3-吡啶醇投料，得LX-9纯品0.32g褐色固体，产率89％。MS(ESI，m/z)：357[M]+，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：10.239(s，1H，NH)，7.951(d，1H，J=4.5Hz)，7.381(d，1H，J=3.0Hz，Py-4H)，7.319(d，1H，J=8.0Hz，Py-6H)，7.202(d，1H，J=4.5Hz，3-H)，7.186(d，1H，J=4.5Hz，4-H)，6.657(s，1H，OH)，6.354(d，1H，3.0Hz，Py-5H)，5.342(m，2H,)，2.383(s，3H，CH3)，

实施例6N-(3-羟基-2-吡啶基)-4-叔丁基苯氧乙酰胺(LX-11)的制备

按照实施例1的操作方法，以0.21g(0.001mol)4-叔丁基苯氧乙酸和0.11g(0.001mol)2-氨基 -3-吡啶醇投料，得LX-11纯品0.27g浅黄色固体，产率90％。MS(ESI，m/z)：301[M]+，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：7.674(d，1H，J=7.0Hz，Ph-H)，7.445(d，1H，J=7.0Hz，Ph-H)，7.353(d，1H，J=5.0Hz，Py-6H)，7.251(m，2H，Ph-2H)，7.201(m，1H，NH)，7.036(d，1H，J=5.0Hz，Py-4H)，6.953(d，1H，J=5.0Hz，Py-5H)，6.558(s，1H，OH)，3.524(s，2H，CH2O)，2.006(m，9H，CH3*3)

实施例7N-(3-羟基-2-吡啶基)呋喃-3-甲酰胺(LX-13)的制备

按照实施例1的操作方法，以0.11g(0.001mol)呋喃-3-甲酸和0.11g(0.001mol)2-氨基-3-吡啶醇投料，得LX-13纯品0.18g粉色固体，产率88％。MS(ESI，m/z)：205[M]+，1HNMR(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：10.556(s，1H，NH)，8.494(s，1H，Fu-2H)，7.977(d，1H，J=3.5Hz，Fu-5H)，7.824(s，1H，OH)，7.351(dd，1H，J=8.0Hz，1.5Hz，Py-4H)，7.226(dd，1H，J=5.0Hz，1.5Hz，Py-6H)，7.085(d，1H，J=1.0Hz，Fu-4H)，5.337(t，1H，J=5.0Hz，Py-5H)

实施例8N-(3-羟基-2-吡啶基)-2-氯-5-溴苯甲酰胺(LX-15)的制备

按照实施例1的操作方法，以0.25g(0.0011mol)2-氯-5-溴苯甲酸和0.11g(0.001mol)2-氨基-3-吡啶醇投料，得LX-15纯品0.31g黄色固体，产率94.5％。MS(ESI，m/z)：327[M]+，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：7.910(s，1H，Py-6H)，7.815(s，1H，6-H)，7.705(d，1H，J=8.5Hz，4-H)，7.514(d，1H，J=8.5Hz，3-H)，7.320(d，1H，J=7.5Hz，Py-4H)，7.201(m，1H，NH-CO)，6.654(s，1H，-OH)，5.337(t，1H，J=5.0Hz，Py-5H)

实施例9N-(3-羟基-2-吡啶基)-2,4-二溴苯氧乙酰胺(LX-18)的制备

按照实施例1的操作方法，以0.31g(0.001mol)2,4-二溴苯氧乙酸和0.11g(0.001mol)2-氨基-3-吡啶醇投料，得LX-18纯品0.37g浅黄色固体，产率92％。MS(ESI，m/z)：401[M]+，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：7.809(d，1H，J=2.5Hz，3-H)，7.515(dd，1H，J=9.0Hz，2.5Hz，5-H)，7.201(br-s，1H，Py-6H)，7.106(br-s，1H，Py-4H)，6.985(d，1H，J=9.0Hz，6-H)，6.656(s，1H，-OH)，5.336(t，1H，J=5.0Hz，Py-5H)，4.822(s，2H，CH2)

实施例10N-(3-羟基-2-吡啶基)4-氯-3-(N-烯丙基磺酰胺基)苯甲酰胺(LX-20)的制备

按照实施例1的操作方法，以0.28g(0.001mol)4-氯-3-(N-烯丙基磺酰胺基)苯甲酸和0.11g(0.001mol)2-氨基-3-吡啶醇投料，得LX-20纯品0.35g白色固体，产率95％。MS(ESI,m/z)：368[M]+，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：9.847(s，1H，NH-SO2)，8.538(s，1H，OH)，8.254(t，1H，J=5.0Hz，Py-6H)，8.209(d，1H，J=9.0Hz，Py-4H)，7.964(d，1H，J=4.0Hz，2-H)，7.838(d，1H，J=8.0Hz，6-H)，7.343(d，1H，J=8.0Hz，5-H)，7.229(m，1H，NH-CO)，5.680(m，1H，=CH)，5.337(t，1H，J=5.0Hz，Py-5H)，5.145(d，1H，J=15.0Hz，=CH)，5.007(d，1H，J=10.0Hz，=CH)，3.182(d，2H，J=5.0Hz，CH2)

实施例11N-(3-羟基-2-吡啶基)-4-(N-乙酰氧基-2，6-二甲基哌啶)苯甲酰胺(LX-22)的制备

按照实施例1的操作方法，以0.29g(0.001mol)4-(N-2,6-二甲基哌啶)苯氧乙酰胺基苯甲酸和0.11g(0.001mol)2-氨基-3-吡啶醇投料，得LX-22纯品0.35g黄色固体，产率91％。MS(ESI，m/z)：384[M]+，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：10.539(s，1H，NH)，8.030(m，2H，J=8.5Hz，Ph-2H)，7.978(d，1H，J=4.5Hz，Py-4H)，7.346(d，1H，J=7.0Hz，Py-6H)，7.221(dd，1H，J=7.0Hz，4.5Hz，Py-5H)，7.028(m，2H，J=8.5Hz，Ph-2H)，6.555(s，1H，OH)，5.335(s，2H，OCH2)，2.006(m，2H，CH2)，1.561(m，2H，CH2)，1.468(t，3H，J=6.5Hz，CH3)，1.163(m，2H，CH2)，0.888(t，3H,J=6.5Hz,CH3)

实施例12N-(3-羟基-2-吡啶基)-4-(5-三氟甲基-2-吡啶氧基)苯甲酰胺(LX-25)的制备

按照实施例1的操作方法，以0.28g(0.001mol)4-(5-三氟甲基-2-吡啶氧基)苯甲酸和0.11g(0.001mol)2-氨基-3-吡啶醇投料，得LX-25纯品0.36g白色固体，产率96％。MS(ESI，m/z)：376[M]+，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：8.137(m，2H，Ph-H)，7.975d，1H，J=5.0Hz，Py-6H)，7.846(m，2H，Ph-H)，7.643(d，1H，J=8.0Hz，Py-4′H)，7.546(s，1H，Py-6′H)，7.352(d，1H，J=8.0Hz，Py-4H)，7.226(m，1H，NH-CO)，6.852(d，1H，Py-3′H)，6.654(s，1H，-OH)，5.336(t，1H，J=5.0Hz，Py-5H)

实施例13N-(3-羟基-4-氯-2-吡啶基)-4-氯苯甲酰胺(LX-27)的制备

按照实施例1的操作方法，以0.16g(0.001mol)4-氯苯甲酸和0.15g(0.001mol)2-氨基-4-氯-3-吡啶醇投料，得LX-27纯品0.25g浅绿色固体，产率88％。MS(ESI，m/z)：283[M]+，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：10.523(s，1H，NH)，7.978(m，2H，Ph-2H)，7.724(d，1H，J=5.0Hz，Py-5H)，7.656(m，2H，Ph-2H)，6.855(d，1H，J=5.0Hz，Py-6H)，6.524(s，1H，OH)

实施例14N，N-二(3-羟基-2-吡啶基)-1，4-环己二甲酰胺(LX-28)的制备

按照实施例1的操作方法，以0.17g(0.001mol)1，4-环己基二甲酸和0.22g(0.002mol)2-氨基-3-吡啶醇投料，得LX-28纯品0.32g黄色固体，产率89％。MS(ESI，m/z)：357[M]+，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：7.912(s，1H，NH)，7.294(d，1H，J=7.5Hz，Py-6H)，7.199(s，1H，NH)，7.166(m，1H，Py-5H)，6.656(s，1H，OH)，5.337(t，1H，J=6.0Hz，Py-6′H)，4.379(t，2H，J=6.0Hz，Py-4′5′H)，3.524(s，1H，OH)，3.438(m，1H，CH)，3.382(m，1H，CH)，2.006(m,4H，CH2CH2)，1.661(m，2H，CH2)1.468(m，2H，CH2)

实施例15N-(3-羟基-5-甲氧基-2-吡啶基)-4-氯苯甲酰胺(LX-30)的制备

按照实施例1的操作方法，以0.16g(0.001mol)4-氯苯甲酸和0.14g(0.001mol)2-氨基-5-甲氧基-3-吡啶醇投料，得LX-30纯品0.26g浅黄色固体，产率93％。MS(ESI，m/z)：279[M]+，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：10.521(s，1H，NH)，7.976(m，2H，Ph-2H)，7.744(d，1H， J=1.5Hz，Py-6H)，7.656(m，2H，Ph-2H)，6.823(d，1H，J=1.5Hz，Py-4H)，6.524(s，1H，OH)，3.843(s，3H，OCH3)

实施例16本发明化合物对ABCA1上调剂筛选模型的活性

将ABCA1-LUC HepG2细胞以5×104个/孔接种于96孔细胞培养板中，约6h待细胞贴壁后，移去含血清的培养基，用PBS轻轻漂洗细胞一次，每个实验孔加入不含血清的MEM-EBSS培养基200μl，再分别加入2μl待测的化合物样品(终浓度2.5或10μg/ml)，终浓度0.1％DMSO培养基的孔作为空白对照。继续于37℃，5％CO2条件下培养18-24h后，PBS(200μl/孔)洗板2次，弃PBS。加入细胞裂解液(20μl/孔)(Promega)，15-30min后，显微镜下观察细胞裂解完全后，加入荧光素酶(60μl/孔)，立即测定荧光素酶活性(酶标仪读数)。

用如下方程计算待测样品对荧光素酶活性的改变率：

改变率(％)=A/B×100

其中，A为加入待测样品后测定的细胞荧光素酶活性(RLU)，B为加入空白对照样品(DMSO)后测定的细胞荧光素酶活性(RLU)。

实施例17本发明化合物对CLA-1上调剂筛选模型的活性

将CLAP-LUC HepG2细胞以5104个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，约6h待细胞贴壁后，移去含血清的培养基，用PBS轻轻漂洗细胞一次，每个实验孔加入不含血清的MEM-EBSS培养基200μl，再分别加入2μl待测的化合物样品(终浓度2.5或10μg/ml)，终浓度0.1％DMSO培养基的孔作为空白对照。继续于37℃，5％CO2条件下培养18小时后，，PBS(200μl/孔)洗板2次，弃PBS。加入细胞裂解液(20μl/孔)(Promega)，15-30min后，显微镜下观察细胞裂完全后，加入荧光素酶(60μl/孔)，立即测定荧光素酶活性(酶标仪读数)。

用如下方程计算待测样品对荧光素酶活性的改变率：

改变率(％)=A/B×100

其中，A为加入待测样品后测定的细胞荧光素酶活性(RLU)，B为加入空白对照样品(DMSO)后测定的细胞荧光素酶活性(RLU)。

实施例18本发明化合物对CLA-1p-3′UTR筛选模型的活性

将CLA-1p-3′UTR HepG2细胞以5104个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，约6h待细胞贴壁后，移去含血清的培养基，用PBS轻轻漂洗细胞一次，每个实验孔加入不含血清的MEM-EBSS培养基200μl，再分别加入2μl待测的化合物样品(终浓度2.5或10μg/ml)，终浓度0.1％DMSO培养基的孔作为空白对照。继续于37℃，5％CO2条件下培养18小时后，，PBS(200μl/孔)洗板2次，弃PBS。加入细胞裂解液(20μl/孔)(Promega)，15-30min后，显微镜下观察细胞裂完全后，加入荧光素酶(60μl/孔)，立即测定荧光素酶活性(酶标仪读数)。

用如下方程计算待测样品对荧光素酶活性的改变率：

改变率(％)=A/B×100

实施例19抑制巨噬细胞泡沫化实验

小鼠的单核-巨噬细胞RAW264.7用含10％FBS的DMEM-高糖培养液贴壁培养。细胞以6×104个/孔接种于96孔细胞培养板上，于37℃，5％CO2条件下过夜培养后，换为无血清DMEM-高糖培养基(100μl/孔)。将细胞分为对照组、泡沫细胞组和加样组(各化合物终浓度10μg/ml)，加入终浓度为80mg/L的Ox-LDL到泡沫细胞组和加样组，加样组同时要加入一定浓度的待测样品。37℃，5％CO2条件下培养24h后，进行油红O染色。

将96孔板从CO2孵箱中取出，4％多聚甲醛固定(15μl/孔)10min，弃溶液，双蒸水洗两次，再加入60％异丙醇(150μl/孔)，放置5min，弃去溶液。将油红O使用液加入各孔中，150μl/孔，染色1h。弃去溶液，用60％异丙醇(150μl/孔)洗孔，然后用双蒸水(150μl/孔)洗两次，最后每孔加150μl双蒸水置于显微镜下观察、拍照。

实施例20[3H]胆固醇流出实验

小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7用含10％FBS的DMEM-高糖培养基(500μl/孔)，以2×105个/孔，接种于24孔细胞培养板上，于37℃，5％CO2条件下过夜培养。

弃细胞液，换为含0.2％(w/v)BSA的DMEM-高糖培养基(500μl/孔)，加入1，2-[3H]胆固醇并使其终浓度为1μCi/ml，37℃，5％CO2条件下孵育24h。

用PBS(1ml/孔)洗细胞2次，加入含一定浓度化合物(终浓度10μg/ml)的测定培养基(DMEM加入0.2％BSA，0.1％DMSO，25mM HEPES，pH7.4)，37℃孵育18-24h。

用PBS(1ml/孔)洗细胞2次，加入培养基(DMEM加入0.2％BSA，0.1％DMSO，25mMHEPES，pH7.4)，有或无10μg/ml的apoA-I，孵育4h。

收集培养基，10000×g离心5min，取上清待测。

用0.1M NaOH0.5ml室温裂解细胞30min，收集裂解液待测。

测定：将待测样品分别转移至3MM滤纸上，75℃烘干，将纸片放在液闪杯中，加入10ml液闪液(质量浓度为0.5％PPO(2，5-二苯基恶唑)和0.05％POPOP(1，4-双-2-15-苯基恶唑苯)与体积分数为55％二甲苯和45％乙二醇二甲醚的溶剂混合配制，置于棕色容器内存放，过夜使用)，液闪计数仪计数。整个实验细胞分为对照组(不加胆固醇但是加apoA-I、加胆固醇)和加样组(同时加入胆固醇、apoA-I和一定浓度的待测样品[15,20])。

胆固醇流出率％=培养液cpm值/总cpm值×100％

＝培养液cpm值/(培养液cpm值+细胞cpm值)×100％

实施例21LX-1在apoE-/-小鼠体内的药效学评价

apoE-/-小鼠，7周龄，普通饲料喂养一周；

将apoE-/-小鼠称体重，随机分组，共分为5组(模型组、高剂量组(10mg/Kg)、中剂量组(30mg/Kg)、低剂量组(90mg/Kg)、阴性对照组、阳性药组(5mg/Kg))，每组6-8只；

从8周龄开始，模型组和给药组喂养高脂饲料，阴性对照组继续喂养普通饲料；灌胃给药；

将给药或者羧甲基纤维素8周的apoE-/-小鼠禁食6h；摘眼球取血，用肝素润洗过的EP管收集 血，上下颠倒，置于冰上，4000rpm/min，4℃离心3min，将分离的血清按照世界和说明测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量。以上检测试剂盒均为北京中辰北控临床试剂公司产品。

参考文献

[1]Fielding CJ and Fielding PE：Molecular physiology of reversecholesterol transport.J Lipid Res1995；36：211-228.

[2]Oram JF and Yokoyama S：Apolipoprotein-mediated removal of cellularcholesterol and phospholipids.J Lipid Res1996；37：2473-2491.

[3]Alan D.Attie，John P.Kastelein and Michael R.Hayden.Pivotal role ofABCA1in reverse cholesterol transport influencing HDL levels and susceptibitoatherosclerosis.J Lipid Res2001；42：1717-1726.

[4]S Soumian，C Albrecht，AH Davies and RGJ Gibbs.ABCA1andatherosclerosis.Vascular Medicine2005；10：109-119.

[5]John F.Oram and Jay W.Heinecke.ATP-binding cassette transporterA1：a cell cholesterol exporter that protects against cardiovasculardisease.Physiol Rev2005；85：1343-1372.

[6]Silver DL，Tall AR.The cellular biology of scavenger receptor classB type I.Curr Opin Lipidol2001；12(5)：497-504.

[7]Miller NE：Associations of high-density lipoprotein subclasses andapolipoproteins with ischemic heart disease and coronary atherosclerosis.AmHeart J1987；113：589-597。

Claims (6)

1.结构如通式(I)所示化合物在制备具有上调人ATP结合盒转运体A1和/或清道夫受体B1表达活性的药物中的应用，

（I）

通式(I)中，

R1代表：H原子；

R2，R3，R4独立的代表： H原子；

n=0，1，2；

并且n=0时，R5为：

（1）4-三氟甲氧基苯；

（2）4-碘代苯；

（3）4-三氟甲硫基苯；

（4）5-甲基-2-呋喃；

（5）3-呋喃基；

（6）2-氯-5-溴苯基；

（7）4-氯-3-烯丙胺基磺酰胺基苯；

（8）N-苯氧乙酰基-2，6-二甲基哌啶；

（9）4-(5-三氟甲基-2- 吡啶氧基)苯；

（10）4-氯代苯；

n=1时，R5为：

（11）4-(1，3-二硫环戊烷基)苯氧基；

n=2时，R5为：

（12）4-叔丁基苯氧甲基；

（13）2，4-二溴苯氧甲基；

（14）N-（3-羟基-2-吡啶）环己基甲酰胺。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为：

（1）治疗和/或预防心血管疾病的药物；

（2）降低脂质或降低胆固醇的药物；

或（3）抗动脉粥样硬化的药物。

3.包含权利要求1中通式(I)所述的化合物的组合物在制备具有上调人ATP结合盒转运体A1和/或清道夫受体B1表达活性的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物为：

（1）降低脂质或降低胆固醇的药物；

（2）抗动脉粥样硬化的药物；

或（3）治疗和/或预防心血管疾病药物。

5.权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述组合物各种剂型按照药学领域的常规生产方法制备。

6.权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述组合物含有治疗有效量的权利要求1中通式(I)所述的化合物为活性成分，以及一种或多种药学上可接受的载体。