CN104220454B

CN104220454B - 人源化的嵌合抗因子Bb抗体及其用途

Info

Publication number: CN104220454B
Application number: CN201380018990.5A
Authority: CN
Inventors: R·班萨尔
Original assignee: Novelmed Therapeutics Inc
Current assignee: Novelmed Therapeutics Inc
Priority date: 2012-04-03
Filing date: 2013-04-02
Publication date: 2018-09-07
Anticipated expiration: 2033-04-02
Also published as: AU2013243570B2; CN104220454A; WO2013152020A1; JP2015514111A; US9243070B2; CA2869473A1; US20150093390A1; AU2013243570A1; JP6244350B2; CA2869473C; EP2834271A4; EP2834271B1; EP2834271A1

Abstract

本发明提供了一种在受试对象中抑制由Bb抑制剂介导的补体激活的方法，该方法向所述的受试对象给药Bb抑制剂，从而抑制Bb与因子B和备解素的结合，抑制C3的切割，抑制嗜中性粒细胞、单核细胞、血小板和内皮细胞的激活，或者抑制C3a、C5a和Mac的形成中的至少一种。

Description

人源化的嵌合抗因子Bb抗体及其用途

相关申请

本申请要求2012年4月3日提交的美国临时申请No.61/619,858的优先权，该申请的主题内容以引用方式全文并入本文。

技术领域

本发明涉及效应器功能和免疫源性降低的、人源化嵌合抗体及其抗原结合片段。本申请进一步涉及因子B的抗体用于抑制C3bBb或PC3bBb复合物的活性的用途，这将进一步抑制因子B在C3/C5转化酶中的蛋白水解活性。本发明的人源化嵌合单克隆抗体选择性地阻断因子Bb与PC3bB复合物的结合，而不会抑制经典途径的激活。这些抗体不会抑制C3b与因子Bb的相互作用，因此具有独特的功能。此类抗体为疾病指征(其中补体旁路途径起致病作用)的有用疗法。

背景技术

补体***是通过3条不同的途径激活的：经典途径、凝集素途径和补体旁路途径(AP)。经典途径是通过抗原-抗体复合物激活的。凝集素途径是经典途径的改变，旁路途径是通过外来物质、人工表面、死亡组织、细菌、死亡酵母细胞来激活的。

经典途径的激活产生C3a、C4a、C5a和C5b-9分子，它们响应于宿主防御而激活多种细胞。在致病条件下，作为旁路途径的激活结果，形成过敏毒素C3a、C5a，它们激活细胞和还被称为膜攻击复合物(MAC)C5b-9分子(其破坏组织)。总体而言，这些分子通过细胞激活而介导炎症并释放炎症介质。除了C5b-9作为细胞溶解性孔隙形成复合物的作用，强有力的证据表明亚溶解MAC的沉积在炎症中可以起到重要的作用。

经典的补体途径对于宿主防御对抗病原体是重要的。补体旁路途径在病理学炎症中被激活。发现C3a、C5a和C5b-9水平的升高与多种急性和慢性疾病状况有关。因此，抑制疾病诱导的AP激活在疾病中(其中补体激活在疾病病理学中起作用)对于临床益处而言是重要的。

补体***除了在免疫防御中的基本作用以外，其在许多临床状况中会促使组织损伤。补体生物化学级联中所包括的活性对宿主组织呈现潜在的威胁。实例包括不加选择地释放可能导致宿主细胞溶解的破坏性的酶。因此，迫切需要研发防止这些不利作用的治疗有效性的补体抑制剂。

在其中AP激活有助于疾病病理学的疾病状况下，在血清、血浆、血液或代表了疾病的其他体液中发现C3a、C5a和C5b-9的水平升高。这些分子的每一种分子通过不同机制的生产和抑制对于疾病都是重要的。用于抑制PC3bBb复合物形成的一种可能的机制是通过使用抗Bb抗体。因此，通过耗尽Bb、中和Bb或使Bb失活来阻断/抑制或阻止AP激活仍为重要的治疗策略。

本发明涉及研发得到的人源化的嵌合抗体序列，该抗体序列是新型的，并且提供与因子Bb的靶向结合。此类人源化的/嵌合抗体与因子Bb的结合会阻止转化酶的激活。此外，此类抗体还通过与PC3bB复合物的因子B上的因子D切割位点结合而阻止PC3bB转化为PC3bBb。这些抗体不能抑制备解素与C3b的结合。与Bb结合、阻止PC3bBb激活并且阻止新的C3转化酶形成的抗因子Bb剂包括但不限于单克隆和多克隆的抗体，嵌合的、人源化的、全人类、及纳米抗体，全长的及它们的片段，包括IgG、Fab、Fab'、F(ab’)2和IgGs。本发明的抗体可以抑制C3a、C5a和C5b-9的形成，这些因子会驱使发炎，还会放大AP激活过程。

此外，适体、小分子和SiRNA还可以中和与PC3bB复合物结合的Bb，并阻止AP诱导生产的C3a、C5a和C5b-9的生产。结果，细胞激活、炎症和炎症介质的释放也都被阻止。由于AP激活与多种急性和慢性人类疾病关联，所以使用抗Bb剂进行阻断还将阻断炎症的过程，这可以为使用抗Bb单克隆抗体治疗的哺乳动物提供临床益处。

补体是与发病机理有关的多种因子之一，并且可以为临床控制提供有效点的重要的病理机制。越来越多地认识到补体介导的组织损伤在多种疾病状态中的重要性，意味着需要有效的补体抑制药品。尽管如此，目前完全缺乏人类用途的、特异性地靶向及抑制补体激活的批准药品。

因子B在旁路途径的放大环中起到重要作用，这是因为其提供用于C3转化酶(PC3bBb)的催化亚基Bb。已经研发出抑制C3b与Ba结合的抗体，但是它们都不具有抑制Bb的活性。因子B本身为不具有已知的催化活性的酵素原。在因子B与PC3b复合物结合后，其被因子D切割，从而释放Ba。已经显示因子B通过在Ba和Bb各个亚基中发现的区域而与C3b结合。因子Bb结合剂的抑制剂会导致选择性地抑制因子B的功能，由此阻止C3a、C5a和C5b-9的形成，这会导致许多有害的结果。

根据本专利申请中所述的结果，我们研发了人源化的嵌合抗体，该抗体结合因子B的催化结构域，阻止PC3bBb的活性，结合Bb上因子D的切割位点，并阻止其他的PC3bBb分子的形成。这些抗体不能抑制C3b与因子B的结合，因为这种结合事件显示为是通过因子B的Ba结构域介导的。本申请研发出人源化的嵌合抗Bb特异性抑制剂或抑制方法，这种抑制剂或抑制方法将(a)通过阻断PC3bBb活性而阻断因子B功能，和/或(b)抑制因子B的切割，这种切割会阻止Bb的生成。这些抑制剂似乎是C3转化酶的酶活性的灭活剂，而不破坏因子B与C3b的相互作用。针对抗因子Bb抗体在阻断AP激活中的潜在作用，我们已经评价了抗因子Bb抗体的抑制活性。这些抗体在体外和全血中阻止了因子B的功能。此外，还研发了其他的抗因子Ba的单克隆抗体，并且在疾病的动物模型中进行了测试，但是并未构成本发明的一部分。这些抗Ba抗体阻断了因子B与C3b的结合，因此阻断了补体级联的激活。

本发明计划通过使用抗Bb抗体来抑制Bb在病理学状况中的功能活性及其的程序性作用。

发明概述

本发明涉及通过阻断PC3bBb和C3bBb上的Bb位点并限制因子D介导的因子B的切割来抑制Bb依赖的补体激活的方法。与Bb结合并且仅抑制旁路途径的激活但不会抑制经典途径的抗体被涵盖在本发明的范围内。因子B依赖的补体激活可以通过因子B抑制剂分子(除了诸如适体和SiRNA以外的抗体)来抑制。因子B抑制剂分子抗体可以包含全部的或片段的抗因子B抗体。片段的抗因子B抗体可以为Fa、F(ab)2、Fv或单链Fv。抗因子B抗体可以为单克隆、多克隆、嵌合或去免疫化的，并且具有与因子B及其片段结合的能力。本发明公开了Bb抗体但并不是抗Ba抗体用于治疗通过补体激活调节的多种炎症紊乱的用途。

在一个方面中，本发明涉及抑制Bb依赖的补体激活在受试对象中的不利作用的方法。该方法包括向受试对象给予有效抑制Bb依赖的补体激活的、一定量的Bb抑制剂。就这一点而言，短语“Bb依赖的补体激活”是指所有3种补体途径的激活。在本发明的一些方面中，Bb抑制剂为抗因子Bb抗体或其片段，而在其他的方面中，抗因子Bb抗体具有降低的效应器功能。在其他的方面中，Bb抑制剂为Bb抑制肽。本发明所述的方法、组合物和药剂用于在哺乳动物的受试对象中体内抑制Bb依赖的补体激活的不利作用，期中所述的哺乳动物受试对象包括遭受急性或慢性病理学状况的人类，其中在疾病的病理学中，涉及不适的补体激活。

在另一个方面中，本发明创建了抗因子Bb抗体，该抗体包含互补性决定区1至3(CDR1至3)与构架区(FR1至FR4)的多种组合。CDR包含轻链与重链的组合。CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3及构架区可用于治疗上述提及的疾病状况，在该疾病状况中，补体起到一定的作用。包含CDR(其在可变区的氨基酸序列内为任何顺序)的抗体被涵盖在本发明的范围内。这样，本发明涵盖了所讨论的序列，以及CDR或构架区中任何的序列变化，只要保持90％的序列一致性即可。此类抗体仅以化学计量比为1:1与Bb分子结合，这意味着通过使用该抗体，人类可以评价血浆样品中的百分比活性。

附图简述

图1示出了2种补体途径；经典途径和补体旁路途径。该图示将2种途径分开，并且2种途径没有在C3b处汇合。

图2示出了人源化的抗Bb抗体与B蛋白质的结合亲和力。

图3示出了人源化的抗Bb抗体与Bb蛋白质的结合亲和力。

图4示出了人源化的抗Bb抗体未抑制因子B与C3b的结合。

图5示出了人源化的抗Bb抑制了新的C3b分子的形成，其中所述的新的C3b分子形成了新的C3/C5转化酶。

图6示出了人源化的抗Bb抑制了新的PC3b复合物的形成。

图7示出了人源化的抗Bb抑制了新的因子B/Bb分子的形成，其中所述的新的因子B/Bb分子与C3/C5转化酶有关。

图8示出了人源化的抗Bb抑制了红细胞溶解和组织损伤所需形成的C5b-9的形成。

图9示出了人源化的抗Bb抗体抑制的旁路途径依赖的红细胞溶解。

图10示出了人源化的抗Bb抗体不抑制经典激活途径。

图11示出了人源化的抗体抑制了兔红细胞在PNH血清中的溶解。

图12示出了鼠抗Bb抗体的序列(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。呈现出人源化的抗体(SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:12)的序列。

图13至图17示出了CDR和构架区的序列ID NO。

图18示出了在Bb蛋白质中造成鼠与人源化抗Bb结合的肽基元。

发明详述

标准的术语(包括本领域的技术人员使用的那些)是普通的且标准的，并且已经无条件地在整个申请中使用。

为了描述本发明，提供以下定义以便就在说明书和权利要求书中使用的术语提供清晰度。

如本文所用，术语“旁路途径”是指补体激活，其在传统上被认为产生于对补体因子C3的蛋白水解产生的C3b，其是通过例如真菌和酵母菌细胞壁的酵母聚糖、革兰氏阴性外膜的脂多糖(LPS)和兔红细胞，以及由许多纯多糖、兔红细胞、病毒、细菌、动物肿瘤细胞、寄生虫和破损细胞刺激的。

如本文所用，术语“抗体”涵盖抗体和抗体片段，其特异性地与Bb或者其多肽或部分结合，其中所述的抗体衍生自任何生产该抗体的哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔或灵长动物，包括人类)。示例性的抗体包括多克隆、单克隆和重组抗体；多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人源化的抗体；鼠抗体、嵌合(即，小鼠-人、小鼠-灵长动物、灵长动物-人)、单克隆抗体，和抗独特性抗体；以及去免疫化的抗体；并且可以为它们任何完整的分子或片段。

如本文所用，术语“抗体片段”是指由全长的抗因子Bb抗体衍生的或者与全长抗因子Bb抗体相关的部分，通常包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的示例性实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab’)₂和Fv片段；scFv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所用，术语“Bb抑制剂”是指与Bb结合或相互作用的、并且有效抑制Bb依赖的补体激活的任何试剂，包括抗Bb抗体及其Bb结合片段，天然和合成的肽。在本发明的方法中使用的Bb抑制剂可以将Bb依赖的补体激活(由此降低其所有的激活)降低超过20％。在一个实施方案中，Bb抑制剂将补体激活降低90％。

如本文所用，“嵌合抗体”是指包含可变结构域和互补性决定区的重组蛋白质，其中所述的可变结构域和互补性决定区衍生自非人类物种(例如啮齿动物)的抗体，同时抗体分子的剩余部分衍生自人类抗体。

如本文所用，术语“经典途径”是指(1)由与外来粒子结合的抗体所引发的C1复合物的补体激活，该过程需要结合识别分子C1q；还指(2)通过抗原-抗体复合物的形成所发生的补体激活。

如本文所用，“人源化的抗体”为嵌合抗体，其包含符合特异性互补性决定区的最小序列，其中所述的互补性决定区衍生自被移植到人类抗体构架中的非人类免疫球蛋白。人源化的抗体通常为重组蛋白质，其中仅抗体的互补性决定区是非人类起源的。

如本文所用，“膜攻击复合物”(“MAC”)是指5种终末补体成分(C5-C9)的复合物，其中该复合物***并破坏膜。此外，MAC还可以称为C5b-9和SC5b-9。

如本文所用，“受试对象”包括所有哺乳动物，包括但不限于狗、猫、马、绵阳、山羊、奶牛、兔、猪、人类、非人类灵长动物、和啮齿动物。此外，旁路途径除了在补体激活中作为独立途径而被广泛认可的作用以外，其还为最初通过经典途径和凝集素途径所引发的补体激活提供放大环。

如本文所用，“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域以单链多肽形式呈现。通常，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽连接体，其能够使scFv形成用于抗原结合所需的结构。

本发明的抗体为用于治疗人类疾病的人源化的嵌合抗Bb单克隆抗体(mAb)，和抗原结合片段。本发明的抗体可以提供用于满足这种需要的高亲和力抗体。本发明的抗Bb单克隆抗体中和了PC3bBb复合物中的Bb的催化活性，并保护了PC3bB复合物中因子B的因子D切割位点。

具有特征性CDR的动物和植物衍生的抗Bb单克隆抗体被涵盖在本发明的范围内，其中所述的特征性CDR结合Bb并抑制Bb与PC3bB复合物的结合。与本发明的抗体的CDR之间同源性超过60％的CDR被涵盖在本发明的范围内。用于生成人源化的嵌合抗Bb抗体的小鼠单克隆抗体被涵盖在本发明的范围内。

本发明的抗体与现有技术的不同之处在于：本发明的抗体a)不抑制因子B与C3b的结合；b)与因子B上的因子D切割位点结合；c)不影响经典的补体途径；以及d)以1:1的摩尔当量与Bb结合。

人源化的鼠抗Bb抗体能在得自正常和疾病的血清中，抑制兔红细胞的溶解。

人源化的鼠抗Bb抗体能抑制C3a、C5a、C5b-9和TNFα的生产。这些抗体对抗Bb，并由此不与Ba发生交联反应，其中所述的Ba为完整Ba分子的片段。

本发明的抗体能抑制新的B3b、PC3b、PC3bB和PC3bBb的形成。这些抗体特定地抑制旁路途径，而不影响经典途径的放大环。

可以根据抗因子Bb抗体中和由旁路途径的激活而产生的Bb的能力来选择抗因子Bb抗体。摩尔当量为1:1表明所有的Bb都被抗Bb抗体中和。

本发明的抗体不影响经典途径的激活。因此，本发明的单克隆抗体不影响经典途径。旁路途径(放大环)的抑制应该影响经典途径，但是所述的这些抗体甚至在2种途径通常都被激活的情况下，仍未显示对经典途径的激活有任何影响。

本发明的另一个方面涉及包含mAb的重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3，或者它们的组合的抗体。重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:14,16和18中。轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:21,23和25中，其中所述的抗体特异性地结合人类Bb和B。

所述的抗体可以为嵌合抗体、人源化的抗体、人类抗体、人源化的抗体或嵌合抗体。可变区内的CDR可以具有90％的相似性至99％的相似性。

本发明的抗体、本发明的CDR和本发明的构架列于图12-17中。

本发明的抗体可以用于在遭受急性或慢性病理学损伤的受试对象(包括人类)中体内抑制通过旁路途径的补体激活。本发明可以关乎以下疾病、紊乱、损伤和治疗来使用，包括但不限于：

体外循环疾病和紊乱：心肺转流术后的炎症、手术后的肺功能紊乱、心肺转流术、血液透析、白细胞清除术、血浆置换、血小板去除法、肝素诱导的体外LDL沉淀(HELP)、灌注后综合征、体外膜式氧合(ECMO)、心肺转流术(CPB)、灌注后综合征、全身炎性反应综合征和多器官衰竭。

心血管疾病和紊乱：急性冠脉综合征、Kawaski病(动脉炎)、多发性大动脉炎、过敏性紫癜性肾炎、血管渗漏综合征、经皮冠状动脉介入治疗(PCI)、心肌梗死、急性心肌梗死后缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化、脉管炎、免疫复合物脉管炎、与类风湿性关节炎有关的脉管炎(也称为恶性类风湿性关节炎)、***性红斑狼疮相关性脉管炎、脓毒病、动脉瘤、心肌病、扩张型心肌病、心脏手术、外周血管疾病、肾血管疾病、心血管疾病、糖尿病血管病、静脉气栓(VGE)、Wegener肉芽肿、肝素诱导的体外膜肺氧合和Behcet综合征。

骨/肌骨骼疾病和紊乱：关节炎、炎性关节炎、非炎性关节炎、类风湿性关节炎、儿童类风湿性关节炎、全身发病型幼年类风湿性关节炎、骨关节炎、骨质疏松症、***性红斑狼疮(SLE)、Behcet综合征和Sjogren综合征。

移植疾病和紊乱：移植排斥反应、异种移植排斥反应、移植物抗宿主病、器官或移植物的异种移植、器官或移植物的同种移植和超急排斥反应。

眼/眼科疾病和紊乱：干、湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜神经血管病(CNV)、视网膜损伤、糖尿病视网膜病、糖尿病视网膜微血管病变、眼的组织胞浆菌病、葡萄膜炎、糖尿病黄斑水肿、糖尿病视网膜病、糖尿病视网膜微血管病变、病理性近视、网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、视网膜色素上皮细胞(RPE)、眼的组织胞浆菌病和Purtscher视网膜病。

溶血/血液病和紊乱：脓毒病、全身炎症反应综合征(SIRS)、失血性休克、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、灾难性抗磷脂抗体综合征(CAPS)、冷凝集素病(CAD)、自身免疫性血小板减少性紫癜(TTP)、内毒素血症、溶血性尿毒综合征(HUS)、非典型溶血尿毒综合征(aHUS)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、脓毒病、感染性休克、镰状细胞血症、溶血性贫血、高嗜酸性粒细胞综合征和抗磷脂抗体综合征(APLS)。

呼吸/肺疾病和紊乱：哮喘、Wegener肉芽肿、输血相关急性肺损伤(TRALI)、抗肾小球基底膜疾病(Goodpasture疾病)、嗜酸性粒细胞性肺炎、过敏性肺炎,过敏性支气管炎、支气管扩张瘀血、反应性气道病综合征、呼吸道合胞体病毒(RSV)感染、副流感病毒感染、鼻病毒感染,腺病毒感染、变应性支气管肺曲菌病(ABPA)、肺结核、肺寄生虫病、成人呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺疾患(COPD)、肉状瘤病、肺气肿、支气管炎、囊性纤维化、间质性肺病、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、输血相关急性肺损伤、缺血/再灌注急性肺损伤、棉纤维吸入性肺炎、肝素诱导的体外膜肺氧合、过敏性休克和石棉诱导的炎症。

中枢和外周神经***/神经性疾病和紊乱：多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、重症肌无力、多发性硬化、格林-巴利综合征、Miller-Fisher综合征、中风、中风后再灌注、Alzheimer疾病、多灶性运动神经病(MMN)、脱髓鞘作用、Huntington疾病、肌萎缩(ALS)、Parkinson疾病、视***变性疾病(DDD)、脑膜炎、脑膜炎颅神经损伤、变异型克雅氏病(vCJD)、急性特发性犬类多神经病、脑/脑床上(包括但不限于大出血、炎症和水肿)和神经性疼痛。

创伤诱导的损伤和紊乱：失血性休克、血量减少性休克、脊髓损伤、神经元损伤、脑创伤、脑缺血再灌注、挤压伤、伤口愈合、严重的烧伤和冻伤。

肾脏疾病和紊乱：肾缺血再灌注损伤、肾丝球肾炎(PSGN)、Goodpasture疾病、膜性肾炎、Berger疾病/IgA肾病、系膜增生性肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎、膜增生性肾小球肾炎(肾小球膜毛细血管性肾小球肾炎)、急性感染后肾小球肾炎、肾小球肾炎、狼疮性肾炎、过敏性紫癜性肾炎和肾皮质坏死(RCN)。

器官的再灌注损伤和紊乱：包括但不限于心、脑、肾和肝。

繁殖和泌尿生殖器疾病和紊乱：膀胱疼痛的疾病和障碍、感觉膀胱疾病和紊乱、自然流产、男性和女性的***不育疾病、妊娠疾病、母胎耐受、先兆子痫、泌尿生殖道炎症性疾病、胎盘功能不全的疾病和紊乱、流产的疾病和紊乱、慢性膀胱炎和间质性膀胱炎。

皮肤/皮肤病学的疾病和紊乱：烧伤、牛皮癣、特应性皮炎(AD)、嗜酸细胞性海绵层水肿、荨麻疹、热伤害、类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、自身免疫性大疱性皮肤病、大疱性类天疱疮、硬皮病、血管性水肿、遗传性血管水肿(HAE)、多形性红斑、妊娠疱疹、Sjogren综合征、皮肌炎和疱疹样皮炎。

胃肠疾病和紊乱：Crohn疾病、Celiac疾病/乳糜泄、Whipple疾病、肠缺血、炎性肠病和溃疡性结肠炎。

内分泌疾病和紊乱：桥本氏甲状腺炎；幼淋巴细胞性甲状腺炎；压力和焦虑；影响催乳素、生长或***、促肾上腺皮质激素释放的其他疾病；胰腺炎；Addison疾病；糖尿病状况，包括但不限于1型和2型糖尿病；1型糖尿病；肉状瘤病；糖尿病视网膜微血管病变；非肥胖型糖尿病(IDDM)；血管病；IDDM或2型糖尿病的神经病或视网膜病并发症；和胰岛素抵抗。

恶性病的治疗：由化疗和放疗引起的疾病和紊乱。

本发明的抗体可以是治疗性的。鼠、嵌合的、人源化的和灵长源抗体目前被认为是治疗性的。但是，在科学的最新进展中，所述的抗体还可以被其他类型的抗体替代，其中如同分子的抗体的相互作用可以在低的pMole至高的pMole，直至低的nMole范围内。

嵌合抗体和人源化的抗体都具有人类构架恒定区。人源化的和人类的构架区是天然人类构架区或改变的人类构架区，以便增加所述的CDR区的亲和力和效力。恒定区可以存在或不存在于所述的抗体中。可以利用多种方法在植物、细节和哺乳动物细胞***中生产具有和不具有恒定区的抗体。

抗Bb抗体的功能活性被定义为抗Bb抗体在不影响经典途径的放大环的条件下仅抑制AP激活的能力。这些抗体能够(1)抑制PC3bB复合物的催化活性；(2)减少PC3bBb形成和/或C3bBb形成；(3)降低游离C3b的浓度；(4)减少C3b的形成；(5)减少C3a、C5a和C5b-9的形成；(6)减少单核细胞CD11b的表达；(7)减少嗜中性粒细胞CD11b的表达(8)减少血小板CD62P的表达；(9)减少白细胞-血小板缀合物的形成；(10)减少肿瘤坏死因子α(TNF)；以及(11)减少嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的形成。

可以形成双特异性抗体，该抗体可以包含：(i)2种抗体，一种对Bb具有特异性，另一种缀合在一起的抗体对第二分子具有特异性；(ii)单一抗体，其具有对Bb具有特异性的一条链，以及对第二分子具有特异性的第二条链；或者(iii)对Bb和其他分子具有特异性的单链抗体。此类双特异性抗体可以使用本领域公知的技术来形成。

抗Bb抗体或其片段可以用于治疗方法中，该方法用于预防性和治疗性治疗由补体旁路途径的成分和/或补体旁路途径激活后所产生的因子直接或间接介导的疾病。

此外，本发明提供了这样的方法，该方法用于抑制由旁路途径衍生的Bb依赖的补体激活的不利作用。Bb抑制剂可以作为主要疗法单独使用，或者作为增强其他治疗的益处的补体与其他方法结合使用。

抑制剂可以为小分子、适体、DNA片段、代表了CDR结构域的小肽、SiRNA。这些抑制剂抑制了PC3bBb与C3、C5、C9和C5b-9的结合。

Bb抑制剂可以通过动脉内、颅内、静脉内、皮下、肌肉内或其他肠胃外给药的不同方式给药。对于非肽能的抑制剂潜在地以口服形式给药，最合适的是通过动脉内或静脉内给药。给药可以周期性地重复，这可以由医生根据最佳治疗效果来确定。

实施例

除非另作说明，所有试剂均以高品质使用。所有的补体蛋白质、旁路途径和经典途径的缓冲液、检测抗体和红细胞均得自Complement Technologies(Tyler,TX)或QuidelCorporation(San Diego,CA)。流式细胞术抗体得自BD Biosciences,San Jose,CA。TMB底物得自Kirkegaard&Perry Limited,Gaithersberg,MD。所有二级抗体均得自AmericanQualex,San Clemente,CA,BSA，而其他的试剂均得自Sigma-Aldrich,St Louise,MO。

ELISA平板读取器(SpectraMax190和250)得自Molecular Devices，流式细胞仪为FACS Calibur。Varity3D程序用于数据分析。使用MicroCal Origin程序进行曲线拟合。溶血的动力学测试使用SectraMax,Molecular Devices来运行。ELISA平板得自CorningCostar,Lowell,MA。

人源化的嵌合抗体包含亲代鼠单克隆抗体的CDR，序列为SEQ ID No 1和SEQ IDNo2，其呈现于本申请中。对小鼠注射人类Bb(Complement Technology,Tyler,TX)，并针对Bb的结合和AP抑制活性来筛选小鼠血清。使用标准的程序，将由备解素阳性小鼠得到的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。使用有限稀释技术，将融合细胞克隆成单一的细胞群。使96孔板中的细胞生长，并利用备解素的结合和旁路途径的抑制来测试上清液。识别阻断AP激活的细胞，并使用抑制C5b-9形成的那些细胞进一步筛选。根据抑制红细胞溶解的1D3，将这些克隆分类。对细胞系分泌的抗体测序，从而形成SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。将由重链和轻链得到的CDR接枝到人类的构架中，从而形成多种人源化的抗体序列SEQ IDNO:3至SEQ ID NO:12。在哺乳动物CHO细胞中生产、表达、分泌和纯化SEQ ID NO:3至SEQ IDNO:12的抗体，从而生产全部的IgG1k。抗体可按如下所示来表征。

实施例1：人源化的抗Bb抗体以高亲和力与因子B和Bb蛋白质结合

抗Bb IgG1及其抗原结合片段与人类因子B和Bb的亲和力为低的pM抗体范围。抗体与Bb结合会中和PC3bBb(C3/C5转化酶)的催化活性。抗Bb与人类因子B的结合会阻断因子B上的因子D切割位点。为了进行这些试验，在4℃下，将聚苯乙烯微量滴定板过夜涂覆处于磷酸盐缓冲液(PBS)中的人类因子B和Bb(2.0μg/50μl/孔)。在吸入备解素溶液后，将孔用包含1％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)的PBS在室温下封闭1小时。不具有肽或备解素涂料的孔作为背景对照。将人源化的抗因子Bb的等分液加入到B和Bb涂覆的孔中，并将其温育1小时以便发生结合。在室温下温育1小时时间后，使用PBS将平板冲洗5次，并与以1:2000稀释的用于检测的、过氧化物酶缀合的山羊抗人单克隆抗体温育。温育后，冲洗平板，并使用TMB试剂识别结合的过氧化物酶。

如图2和3所示，人源化的抗Bb以皮摩尔的亲和力与因子B(图2)和Bb(图3)结合。

实施例2：人源化的抗Bb单克隆抗体不能抑制因子B与C3b的结合

以前发明的抗因子B抗体通常会抑制B与C3b的相互作用。本新型的抗体不能抑制因子B与C3b的结合。在典型的试验中，在4℃下，将聚苯乙烯微量滴定板孔(96孔中结合力平板，Corning Costar,Cambridge,Mass.)过夜涂覆处于磷酸盐缓冲液pH7.4(PBS)中的C3b(2μg/50μl/孔，complement technology,Tyler,Tx)。在吸入C3b溶液后，将孔用包含1％牛血清白蛋白(BSA；Sigma Chemical)的PBS在室温下封闭1小时。不具有C3b涂料的孔作为背景对照。将人源化的抗Bb的等分液加入到包含固定浓度的因子B的溶液中。在室温下温育1h后，使用PBS充分冲洗孔。使用多克隆抗B抗体检测全部结合的“B”。人源化的抗Bb浓缩物均不能抑制因子B与C3b的结合，如图4所示。

实施例3：人源化的抗因子Bb能够抑制补体旁路途径中C3/C5转化酶(PC3bBb)的形成

通过得自伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhosa)的脂多糖在正常人类血清中激活补体旁路途径。我们使用这种范例来证明本发明的抗备解素抗体是否能抑制PC3bBb的形成。在人源化的抗Bb抗体存在和缺乏下，我们测量P、C3b、Bb和C5b-9的沉积情况。使用合适的抗体检测沉积的P、C3b、Bb和C5b-9。在人源化的抗Bb抗体存在下，注意到C3和C5转化酶的形成以剂量依赖的方式受到抑制，这可通过对P、C3b、Bb和C5b-9各分子沉积的抑制来表明。

在典型的测试中，将聚苯乙烯微量滴定板孔用处于PBS中的2μg/50μl的LPS(得自伤寒沙门氏菌的脂多糖)过夜涂覆。将孔与处于PBS中的1％BSA温育，以封闭孔中未占据的位点。在室温下封闭2小时并使用PBS冲洗后，将处于AP缓冲液中的正常人类血清(10％)与浓度改变的抗体和片段混合。将混合物在LPS涂覆的孔上温育。将平板在37℃下温育2小时，从而使补体AP激活发生。温育后，使用PBS充分冲洗平板，并使用合适的抗体检测C3转化酶的成分。我们使用在封闭溶液中1:2000稀释的C3b和兔抗人C3c，在封闭溶液中1:2000稀释的山羊抗人P，在封闭溶液中1:500稀释的山羊抗人因子Bb，以及在封闭溶液中1:2000稀释的HRPO缀合的抗人C5b-9检测C3b。在室温下，将平板与各自的抗体温育1小时。在温育后，使用PBS冲洗平板，并使用在封闭溶液中1:2000稀释的过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(用于检测C3b)和在封闭溶液中1:2000稀释的过氧化物酶标记的兔抗山羊抗体(用于检测P)来检测结合的抗体。所有的平板在使用PBS充分洗涤后，使用TMB显色。使用1M正磷酸淬灭蓝色。C3b、P、Bb和MAC的共同存在表明C3/C5转化酶形成。

图5示出了对C3b沉积的剂量依赖性抑制，图6示出了对P沉积的剂量依赖性抑制，图7示出了Bb形成的剂量依赖性沉积，图8示出了由人源化的抗Bb抗体沉积C5b-9的剂量依赖性沉积。这些数据提供了抗Bb单克隆抗体阻止转化酶形成并抑制AP激活的直接证据。

实施例4：人源化的抗Bb抗体能够兔红细胞(rRBC)的旁路途径(AP)依赖的溶解

本红细胞溶解的测试是基于rRBC表面上终末补体复合物的形成。结果，rRBC溶解。在700nm下光散色的程序性降低是红细胞溶解的直接量度。通常，rRBC在包含5mM MgCl₂的凝胶巴比妥缓冲液中与正常人类血清温育。在这些条件下，rRBC的表面会引发正常人类血清中旁路途径的激活。旁路途径的激活导致C5b-9复合物在rRBC的表面上形成。预计抑制C5b-9复合物形成的试剂会抑制细胞的溶解。为了评价抗备解素抗体及其片段的作用，将各种浓度的IgG、F(ab’)₂和Fab在37℃下，在具有固定浓度的兔红细胞的AP缓冲液中与正常人类血清(10％NHS)在温度受控的ELISA平板读取器(能够在700nm下读数)中温育。测量700nm下光散色的程序性降低(由于完整细胞的溶解)作为时间的函数。使用SpectraMax 190平板读取器和SoftMax软件记录并分析数据。就计算而言，在各浓度的IgG、F(ab’)₂和Fab下计算总的抑制情况，并将结果表示为未溶解对照的％。使用MicroCal Origin软件，在反曲线图中绘制各浓度下的数据。

如图9所示，在抑制红细胞溶解的正常人类血清中，人源化的抗Bb IgG能够在正常的人类血清中以大约79nM的IC₅₀抑制AP依赖的rRBC溶血。抗体能够以大约79nM的IC₅₀抑制溶解。

使用由阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者得到的血清实施类似的试验。不使用10％最终血清浓度，我们使用40％的最终血清浓度。如图11所示，人源化的抗Bb能够阻止PNH血清中红细胞的溶解。

实施例5：人源化的抗Bb不能抑制经典激活途径

本发明的单克隆抗体不能抑制宿主防御所需的经典途径。将抗体致敏的绵羊红细胞与10％正常的人类血清在包含钙(5mM CaCl₂/MgCl₂)缓冲液的凝胶巴比妥缓冲液中温育。抗体致敏的绵羊细胞会激活经典途径。结果，在被指控溶解的红细胞的表面上形成C5b-9。我们测试10％正常的人类血清。在这2种条件下，抗Bb不会抑制绵羊红细胞的溶解。在典型的测试中，将100μl抗体致敏的绵羊红细胞(Complement Technologies,Tyler,TX)在CP缓冲液中，在10％正常的人类血清中温育，从而使补体激活发生。CP激活的结果是红细胞发生溶解。在700nm下测量由于细胞溶解而导致的光散射的程序性降低，作为时间的函数。

如图10所示，人源化的抗Bb IgG在正常人类血清中不会抑制抗体致敏的绵羊细胞的溶解。这些结果表明抗Bb抗体能够选择性地抑制补体旁路途径，而不会影响经典突进的激活。

实施例6：人源化抗Bb抗体的生产

将容纳CDR的鼠单克隆抗体测序，并将CDR移植到各人类构架区中。使用本领域研发的方法在CHO细胞中克隆并表达抗体。图12至17示出了抗体CDR和构架区。

实施例7：Bb蛋白质的抗原决定簇的图谱绘制

使用clips技术，由Pepscan实施Bb蛋白质的抗原决定簇的图谱绘制。合成多个重叠肽，并使抗体在1μg/ml浓度下与所述的肽结合。产生最强信号的肽被识别为潜在的抗体的抗原决定簇。序列47和48被识别为一个抗体克隆，而序列49、50和51被识别为人源化抗Bb抗体。

Claims

1.一种分离的抗Bb抗体或其抗原结合部分，包含：重链可变结构域，由SEQ ID NO:9组成；和轻链可变结构域，由SEQ ID NO:10组成。

2.权利要求1所述的抗Bb抗体或其抗原结合部分，其中所述抗Bb抗体或其抗原结合部分与位于因子Bb上的肽区结合，所述的肽区具有选自SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的抗Bb抗体或其抗原结合部分，其中所述抗Bb抗体或其抗原结合部分通过抑制所述的PC3bBb复合物的形成来抑制C3b的形成。

4.权利要求1所述的抗Bb抗体或其抗原结合部分，其中所述抗Bb抗体或其抗原结合部分抑制新生产的C3a、C5a、SC5b-9的形成。

5.权利要求1所述的抗Bb抗体或其抗原结合部分，其中所述抗Bb抗体或其抗原结合部分抑制嗜中性粒细胞、单核细胞和血小板的激活。

6.权利要求1所述的抗Bb抗体或其抗原结合部分，其中所述抗Bb抗体或其抗原结合部分抑制红细胞溶解。

7.一种药物组合物，包含治疗有效量的权利要求1所述的抗Bb抗体或其抗原结合部分。

8.权利要求1所述的抗Bb抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗炎症紊乱的药剂中的用途，其中在所述的炎性紊乱中发现异常水平的炎症介质，包括C3a、C5a或C5b-9。

9.权利要求8所述的抗Bb抗体或其抗原结合部分的用途，其中所述的炎症紊乱为自身免疫疾病。

10.权利要求1所述的抗Bb抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗眼科紊乱的药剂中的用途，其中补体激活在眼科紊乱的病理学中起作用。

11.权利要求10所述的抗Bb抗体或其抗原结合部分的用途，其中所述的眼科紊乱选自干、湿性年龄相关性黄斑变性,脉络膜神经血管病,葡萄膜炎,糖尿病视网膜病,糖尿病黄斑水肿,病理性近视,希佩尔Lindau病,眼组织胞浆菌病,视网膜中央静脉阻塞(CRVO),角膜新生血管形成,地图样萎缩,玻璃膜疣病和视网膜新生血管形成。

12.权利要求1所述的抗Bb抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗补体相关的紊乱的药剂中的用途，其中所述的补体相关的紊乱选自哮喘,肺慢性阻塞性疾病(“COPD”),过敏性肺炎,嗜酸性粒细胞性肺炎,肺气肿,支气管炎,支气管扩张,囊肿性纤维化,肺结核,肉样瘤,反应性气道病综合征,间质性肺病,嗜酸性粒细胞增多症,鼻炎,肺寄生虫病,呼吸道合胞体病毒(“RSV”)感染,副流感病毒(“PIV”)感染,医鼻病毒(“RV”)感染和腺病毒感染。

13.权利要求1所述的抗Bb抗体或其抗原结合部分在制备用于在患有或处于发展成状况或疾病的风险中的哺乳动物中抑制旁路途径激活的药剂中的用途，其中所述的旁路途径有助于疾病病理学，或所述的旁路途径使导致所述的状况或疾病的至少一种症状恶化。