CN104219463B - 基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法 - Google Patents

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Abstract

本案为基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，包括以下步骤：1)用激光扫描共焦显微镜中的光电倍增管逐像素采集待成像样本的信号数据；2)所述光电倍增管将扫描得到的各像素的信号数据放大后，通过积分器进行积分，其中首先对扫描至第一像素得到的信号数据和扫描时间进行积分，然后对扫描至第二像素得到的信号数据和扫描时间进行积分，直到对扫描至第N像素得到的信号数据和扫描时间进行积分，N大于等于1；3)将扫描至第一像素的积分作为第一像素的亮度值，而将扫描至第二像素的积分与扫描至第一像素的积分的差值作为第二像素的亮度值，依次计算相邻两次积分的差值，直到得到第N像素的亮度值。本案增强了LSCM的成像质量。

Description

基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法
技术领域
本发明涉及一种激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，具体涉及基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据采集与处理方法。
背景技术
激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Mi croscopy，LSCM)是研究亚微米细微结构的有效技术手段。它是国内外从事生物医学和材料科学研究的科技工作者必备的大型科研仪器。
在LSCM***中，扫描振镜反射出扫描光斑，通过X-Y扫描机构驱动扫描光斑运动并遍历样本上的成像区域，从样本返回的荧光信号通过光路后到达光电倍增管(Photomultiplier Tube，PMT)，PMT的输出为在扫描时间内的连续模拟电压信号。若待成像物体反射回的是极弱光信号，PMT输出信号呈现脉冲信号输出特性；若待成像物体反射回的是微弱光信号，PMT输出信号呈现出脉冲信号和直流信号叠加的输出特性。由于PMT在弱光下的输出随机分布特性，如果直接对这个信号进行模数转换，并由此重建图像，则一个恒定光强的样本采样也会得到一个像素点随机明暗强烈变化的图像。一般地，PMT输出信号含有高频噪声分量，输出图像质量较差。
对于LSCM***，改善图像质量的传统方式是过采样的方法，即对PMT输出的同一个像素点信号进行多次采样，然后取平均来获得一个像素点信号的数据。这种方法能在一定程度上提高信噪比，但是对提高图像的信噪比作用有限，且要求有数十倍或数百倍正常采样率的AD转换模块，以及需要配套合适的宽带放大电路，增加了成本；而且对于PMT的宽带输出，该方法不可能对输出信号进行完全采集。
此外，由于在现有技术中，PMT将扫描到的像素点信号数据放大后，首先对扫描第一像素得到的信号数据和扫描时间t进行积分，采用模数转换器读出积分值，即第一像素亮度值，扫描完第一个点，对积分器清零；因此在扫描 第二个点的时候，积分器的电容上重新加载的是第二个像素产生的电压信号，积分时间是从t到2t，因此，是用第二个像素的电压信号与时间间隔t进行积分，才能得到第二个像素的亮度值，扫描完第二个点，对积分器清零；依此，在扫描第n个点的时候，是用第n个像素的电压信号与时间间隔t进行积分，得到第n个像素的亮度值，扫描完第n个点，对积分器清零。对像素驻留时间内PMT输出信号进行模拟积分后采样的的方式，每扫描一个点，就要对积分器清零，即在一个像素时间内涉及对积分器充电、采样、和放电，虽然对图像信噪比增强作用较强，但是受其机构中开关装置的工作频率和运放的电压变化率等参数的限制，其最终的工作频率也受到限制。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像检测方法，旨在减小控制开关的数字信号对采样电压的电磁干扰，提高采样的工作频率，同时提高采样电压输出值，降低模数转换***的设计难度，提高用于点成像信号的信噪比，增强最终的成像质量。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其中，包括以下步骤：
步骤1)用激光扫描共焦显微镜中的光电倍增管逐像素采集待成像样本的信号数据；
步骤2)所述光电倍增管将扫描得到的各像素的信号数据放大后，通过积分器进行积分，其中首先对扫描至第一像素得到的信号数据和扫描时间进行积分，然后对扫描至第二像素得到的信号数据和扫描时间进行积分，直到对扫描至第N像素得到的信号数据和扫描时间进行积分，N大于等于1；
步骤3)将扫描至第一像素的积分作为第一像素的亮度值，而将扫描至第二像素的积分与扫描至第一像素的积分的差值作为第二像素的亮度值，依次计算相邻两次积分的差值，直到得到第N像素的亮度值。
优选的是，所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其中，
在所述步骤2)之后，还包括用模数转换器读取积分器得到的积分值；
在所述步骤3)中，以模数转换器读取到的积分值作为第一像素的亮度值，以及计算差值的基础。
优选的是，所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其中，所述积分值为电压值。
优选的是，所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其中，
在所述步骤1)中还包括将待成像样本中的像素以行为单位分成若干组；
所述N等于一行中的像素数；
所述光电倍增管分组进行扫描；
当对一行像素执行完所述步骤2)和步骤3)之后，对积分器执行清零操作，然后重复执行步骤2)，所述光电倍增管对下一行像素执行扫描操作，以此循环直到执行完所有行的扫描和所有像素亮度估值。
优选的是，所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其中，所述激光扫描共焦显微镜中的扫描振镜反射出扫描光斑，且所述扫描振镜通过可沿X方向和Y方向移动的驱动机构的驱动，以遍历待成像样本上的所有成像区域，所述扫描光斑照射到所述待成像样本上，使得所述待成像样本返射回微弱荧光，所述光电倍增管接收到所述微弱荧光信号。
优选的是，所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其中，
所述待成像样本中的每个像素均返回微弱荧光供所述光电倍增管采集，且所述光电倍增管将采集到的微弱荧光信号转换成脉冲电压信号和/或直流电压信号。
优选的是，所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其中，
所述积分器包括运算放大器和设置在所述运算放大器的负极输入端和输出端之间的充电电容，所述充电电容的电压容量设置为大于任一行像素的微弱荧光信号转换成的电压值之和。
优选的是，所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方 法，其中，还包括与所述充电电容相并联的开关S，当所述开关S打开，积分器对光电倍增管输出信号进行积分，当所述开关S闭合，对积分器清零。
优选的是，所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其中，
所述模数转换器的精度位数n为n＝图像灰度值位数+log2(像素点数)，其中像素点数为每行的像素点数。
优选的是，所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其中，所述光电倍增管对任一行进行扫描时，所述积分器中的充电电容随着扫描像素点的增加而电量逐步增加，直到所述光电倍增管扫描完该行中的最后一个像素，对充电电容执行清空操作，即积分器清零。
本发明的有益效果是：1)相对像素驻留时间积分的方式仅需在一行像素点扫描结束后闭合开关，对积分器清零，不需要频繁的对电容器进行充放电控制，不但可以避免控制开关的数字信号对积分值的电磁干扰，还能提高模数转换器的采样工作频率；2)对LSCM成像中PMT输出信号进行连续积分，能够表示完整的光电信号探测器在若干个像素驻留时间内的光信号累加，提高了信号的幅值，输出了更高的采样电压，降低了模数转换***的设计难度；3)通过计算相邻两次积分值的差值，得到当前像素的亮度值，可更有效的滤除PMT输出信号的高频噪声分量，显著提高用于点成像信号的信噪比，增强了最终的成像质量。
附图说明
图1为本发明一实施例所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像检测方法的工作流程图；
图2为本发明一实施例所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像检测方法中积分采样器的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，参阅图1，包括以下步骤：
步骤1)用激光扫描共焦显微镜中的光电倍增管逐像素采集待成像样本的信号数据；
步骤2)首先对扫描第一像素得到的信号数据进行积分，积分时间是从0到T，得到第一像素的亮度值U(T)，其中T为每个像素的扫描时间；在扫描第二个点的时候，积分器的电容上加载的是第二个像素与第一个像素叠加的电压信号，其中包含了两个T时间间隔，对扫描第一像素与第二像素叠加的信号数据进行积分，积分时间是从0到2T，得到U(2T)，因此U(2T)-U(T)为第二像素的亮度值；因为像素必然是有亮度的，如果完全没有亮度，那么这个电压值也就是0，而绝不可能是负值，因此，这个电压值是一直在正向叠加的；
步骤3)直到对扫描前n像素得到的累加信号数据和扫描时间nT进行积分，积分值为U(nT)，第n像素的亮度值为U(nT)-U((n-1)T)，其中，n为图像样本中一行像素点数，n大于等于1。
在以上本发明原理基础上，还可以有许多变形。
例如，本发明还可以包括模数转换器，这样就可以将积分值进行模数转换，将数字信号作为亮度值，并且方便计算差值。
进一步的，还包括积分值是一种电压信号。
本发明还可以包括以下情况，通常的图像都不会是几个像素，而是很多个像素，如果累计很多个像素进行扫描，则积分器的电容上的电压阈值过大，因此，将待成像样本中的像素以行为单位分成若干组，所述光电倍增管分组进行扫描，这样积分器的电容上的电压阈值只要大于像素点最多的那一行像素电压；当一行像素扫描结束后，对积分器执行清零操作，然后所述光电倍增管对下一行像素执行扫描操作，以此循环直到执行完所有行的扫描和所有像素亮度估值。
本发明还可以包括，LSCM中的扫描振镜反射出扫描光斑，且扫描振镜通过可沿X方向和Y方向移动的驱动机构的驱动，以遍历待成像样本上的所有 成像区域，扫描光斑照射到所述待成像样本上，使得所述待成像样本返射回微弱荧光，所述光电倍增管接收到所述微弱荧光信号。
进一步的，待成像样本中的每个像素均返回微弱荧光供所述光电倍增管采集，且光电倍增管将采集到的微弱荧光信号转换成脉冲电压信号和/或直流电压信号。
参阅图2，本发明还可以包括以下情况，所述积分器包括运算放大器和设置在所述运算放大器的负极输入端和输出端之间的充电电容，所述充电电容的电压容量设置为大于任一行像素的微弱荧光信号转换成的电压值之和。
进一步的，还包括与所述充电电容相并联的开关S，当开关S打开，积分器对光电倍增管输出信号进行积分，当开关S闭合，电容器放电，对积分器清零。
进一步的，还包括模数转换器的精度位数n为n＝图像灰度值位数+log2(像素点数)，其中像素点数为每行的像素点数。
本发明还可以包括以下情况，所述光电倍增管对任一行进行扫描时，积分器中的充电电容随着扫描像素点的增加而电量逐步增加，直到所述光电倍增管扫描完该行中的最后一个像素，对充电电容执行清空操作，即积分器清零。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)用激光扫描共焦显微镜中的光电倍增管逐像素采集待成像样本的信号数据；
步骤2)所述光电倍增管将扫描得到的各像素的信号数据放大后，通过积分器进行积分，其中首先对扫描至第一像素得到的信号数据和扫描时间进行积分，然后对扫描至第二像素得到的信号数据和扫描时间进行积分，直到对扫描至第N像素得到的信号数据和扫描时间进行积分，N大于等于1；
步骤3)将扫描至第一像素的积分作为第一像素的亮度值，而将扫描至第二像素的积分与扫描至第一像素的积分的差值作为第二像素的亮度值，依次计算相邻两次积分的差值，直到得到第N像素的亮度值。
2.如权利要求1所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其特征在于，
在所述步骤2)之后，还包括用模数转换器读取积分器得到的积分值；
在所述步骤3)中，以模数转换器读取到的积分值作为第一像素的亮度值，以及计算差值的基础。
3.如权利要求2所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其特征在于，所述积分值为电压值。
4.如权利要求1所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其特征在于，
在所述步骤1)中还包括将待成像样本中的像素以行为单位分成若干组；
所述N等于一行中的像素数；
所述光电倍增管分组进行扫描；
当对一行像素执行完所述步骤2)和步骤3)之后，对积分器执行清零操作，然后重复执行步骤2)，所述光电倍增管对下一行像素执行扫描操作，以此循环直到执行完所有行的扫描和所有像素亮度估值。
5.如权利要求1所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其特征在于，所述激光扫描共焦显微镜中的扫描振镜反射出扫描光斑，且所述扫描振镜通过可沿X方向和Y方向移动的驱动机构的驱动，以遍历待成像样本上的所有成像区域，所述扫描光斑照射到所述待成像样本上，使得所述待成像样本返射回微弱荧光，所述光电倍增管接收到所述微弱荧光信号。
6.如权利要求5所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其特征在于，
所述待成像样本中的每个像素均返回微弱荧光供所述光电倍增管采集，且所述光电倍增管将采集到的微弱荧光信号转换成脉冲电压信号和/或直流电压信号。
7.如权利要求1所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其特征在于，
所述积分器包括运算放大器和设置在所述运算放大器的负极输入端和输出端之间的充电电容，所述充电电容的电压容量设置为大于任一行像素的微弱荧光信号转换成的电压值之和。
8.如权利要求7所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其特征在于，还包括与所述充电电容相并联的开关S，当所述开关S打开，积分器对光电倍增管输出信号进行积分，当所述开关S闭合，对积分器清零。
9.如权利要求2所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其特征在于，
所述模数转换器的精度位数n为n＝图像灰度值位数+log2(像素点数),其中像素点数为每行的像素点数。
10.如权利要求1所述的基于积分采样的激光扫描共焦显微镜成像数据处理方法，其特征在于，所述光电倍增管对任一行进行扫描时，所述积分器中的充电电容随着扫描像素点的增加而电量逐步增加，直到所述光电倍增管扫描完该行中的最后一个像素，对充电电容执行清空操作，即积分器清零。
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