CN104215761B - 检测血清中抗gp73抗体的试剂盒 - Google Patents

检测血清中抗gp73抗体的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测血清中抗GP73抗体的试剂盒，属于医药生物技术领域。所述试剂盒包括GP73蛋白抗原、封闭液、酶标的GP73蛋白抗原、兔抗人GP73多克隆抗体标准品、包被缓冲液、显色液、洗涤液、终止液、稀释液，其中，所述GP73蛋白抗原具有序列表SEQ？ID？NO:1所示的氨基酸序列。本发明可以准确计算出患者血清内的抗GP73抗体的浓度，真实反应出血清中抗GP73抗体的存在水平，可以应用于临床对原发性肝癌进行诊断，通过对抗GP73抗体水平进行检测，还能反映肿瘤自身分子变化的过程，从而判断患病机体的自身免疫反应能力。本发明的试剂盒还具有特异性良好，灵敏度、准确性和精密度高的优点。

Description

检测血清中抗GP73抗体的试剂盒
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体地说，是涉及一种检测血清中抗GP73抗体的试剂盒，以及使用该试剂盒检测肝癌患者血清标记物抗GP73抗体的检测方法。
背景技术
肝癌发病率在全世界是位列第四位、中国位列第二的恶性肿瘤，且在世界范围内呈逐年上升趋势，现总发病率已超过56万。肝癌发病之初较为隐匿，临床难以检出，临床诊断检出一般多为晚期，治疗效果差，如若早期发现肝癌并且及时治疗可以提高患者的5年存活率，因此肝癌的早期发现具有重要的临床意义。
目前肝癌的检测手段包括肝超声影像分析和血清学标志物检测，其中最常使用的血清学标志物是甲胎蛋白(AFP)，但是AFP在早期肝癌诊断中灵敏度不高，只有50％～60％的肝癌患者AFP呈阳性，并且慢性肝炎、肝硬化患者等肝癌高危人群也可引起甲胎蛋白的升高。因此临床上需要获得比甲胎蛋白(AFP)特异性和灵敏度更高的新血清学指标，或者能与AFP进行互补的指标。
近年来，蛋白组学技术的发展使得高通量筛选新的肿瘤标志物成为可能，各种有前景的新肿瘤标志物被相继发现，其中高尔基体蛋白GP73最有可能成为更好的肝癌诊断，尤其是早期肝癌诊断的血清标志物。
目前已经有多个研究组验证了GP73是一种新的肝癌标志物，并有用ELISA方法检测血清中肿瘤相关标记物GP73蛋白含量的报道。专利申请号为200910041621的中国专利还公开了一种高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法及其检测试剂盒，提高了检测GP73的灵敏度和特异性。
虽然针对肝癌病人血清中GP73自身蛋白的检测已有相关报道，但当肝癌组织释放肿瘤相关标记物GP73蛋白到血液后，机体对该蛋白产生免疫反应产生抗体的情况如何，机体针对该蛋白产生抗体对肝癌的诊断有何作用还未见报道。检测抗体不仅反映的是肿瘤自身分子变化的过程，更重要的是反映患病机体的自身免疫反应能力，对后期的诊断和治疗都具有重要意义。
发明内容
本发明的发明目的在于：利用ELISA技术建立一种检测患者血清中抗GP73抗体的试剂盒，通过检测抗体的水平可以了解患者自身的免疫能力，对肝癌的诊断和治疗具有重要意义，以弥补现有技术的研究空白。
本发明实现上述目的采用的技术方案如下：
提供一种检测血清中抗GP73抗体的试剂盒，包括GP73蛋白抗原、封闭液、酶标的GP73蛋白抗原、兔抗人GP73多克隆抗体标准品(320ng/ml)、包被缓冲液、显色液、洗涤液、终止液、稀释液，其中，所述GP73蛋白抗原具有序列表SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。
其中，上述GP73蛋白抗原的制作方法为：通过构建GP73基因工程重组载体，利用基因工程技术表达、纯化his-GP73蛋白抗原片段而制得GP73蛋白抗原，其具体步骤如下：
(1)根据GP73蛋白抗原基因设计引物，包括上游引物5'-GGAACGGTACCCACCATCATCATCATCATCAGGCTGCCCTGTCAGTGAGCCAGGAAAA-3'，下游引5'-GGAACGTCGACTCAGAGTGTATGATTCCGCTTTTCACGCTGATCAAGTAAATT-3'，RT-PCR扩增GP73基因，步骤是：取无菌PCR管，依次加入2×TaqMasterMix25μl，上游引物和下游引物各2μl，HepG2细胞总RNA的逆转录产物1μl，ddH2O补足至50μl；将加好的各PCR管轻微离心混匀，放至PCR仪进行反应，目的片段大小为330bp；反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃终延伸5min，反应完毕，取3μlPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定；
(2)将扩增的GP73基因和表达质粒pColdIII经过限制性内切酶后，用T4DNA连接酶构建重组质粒；
(3)重组子筛选与鉴定：重组子经蓝白斑筛选、菌落PCR、双酶切鉴定、测序后，测序后与GenBank中序列比对确认基因序列是否正确；
(4)GP73目的蛋白表达及鉴定：将pColdIII-GP73重组质粒转化E.coli.BL21，诱导表达条件为37℃过夜培养菌液，OD600达到0.4-0.5时，冷却到15℃并放置45min，加入终浓度0.5mM的IPTG，15℃诱导24h；SDS-PAGE鉴定GP73蛋白是否成功表达；
(5)GP73目的蛋白纯化：将IPTG诱导表达的基因工程菌超声破菌，离心，收集上清过Ni-NTA亲和层析柱，电泳鉴定目的蛋白纯度，Bradford法测定蛋白浓度。
进一步地，上述酶标的GP73蛋白抗原的制作方法具体过程如下：
(1)HRP标记试剂盒(商品化试剂盒，武汉三鹰公司产品，-20℃贮存)，室温条件下平衡30分钟，使反应启动液和反应终止液充分解冻后混匀；
(2)向每10μl待标记抗原溶液中加入1μl反应启动液，用移液枪反复吹打若干次以充分混匀，避免产生气泡；
(3)打开辣根过氧化酶管盖，将上述已启动抗原溶液直接加到该管中，用移液枪反复吹打若干次以充分混匀，避免产生气泡，室温放置3小时；
(4)向辣根过氧化酶反应管中加入反应终止液，比例为每10μl抗原溶液加入1ml反应终止液，充分混匀，室温放置1小时；
(5)终止完成后，加入与反应管内反应液等体积的甘油，充分混匀，置于-20℃保存。
优选地，所述包被缓冲液为pH9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液。
优选地，所述显色液包括A液和B液，A液是称取3,3',5,5'-四甲基联苯胺17.2mg，加二甲基亚砜1ml溶解，然后加0.1mol/L，pH5.5的醋酸钠缓冲液66ml制得；B液是取双蒸水100ml，加30％H2O217微升制得，显色液使用时将A液和B液等体积混匀即可。
所述洗涤液包含0.02mol/LpH7.4的PBS，0.05％Tween-20。
所述稀释液为0.01mol/lPBS，终止液为2MH2SO4溶液。
本发明还提供了使用上述试剂盒检测血清中抗GP73抗体含量的检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将兔抗人GP73多克隆抗体标准品(320ng/ml)用0.01mol/lPBS稀释液稀分别释成160ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL五个浓度，或将待测病人血清稀释5倍；
(2)制作吸光度与抗体浓度关系标准曲线：
①包被：用包被缓冲液0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)将GP73蛋白抗原稀释到4ng/ml，4℃包被过夜。
②封闭：洗涤液洗板，拍干，用封闭液0.5％牛血清白蛋白BSA封闭1h。
③加入标准品蛋白或样品：洗涤液洗板，拍干，向包被板的微孔中加入上述不同稀释浓度的兔抗人GP73多克隆抗体标准品50μl或稀释的病人血清50μl，重复2孔，用封板膜封板后置37℃温育30min。
④加入酶标GP73抗原：洗涤液洗板，拍干，每孔加入酶标GP73蛋白抗原50μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育30min。
⑤显色：洗涤液洗板，拍干，每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
⑥终止：每孔加终止液50μl，终止反应。
⑦测定OD值：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
⑧绘制浓度和吸光度标准曲线:以吸光度为横坐标，GP73多抗浓度为纵坐标,绘制吸光度随GP73多抗浓度变化的标准曲线，将待测样品吸光度值代入标准曲线即可求出病人血清标本中的抗GP73抗体浓度值。
本发明人在研究过程中，为了确定血清中抗GP73抗体的水平与肝癌发病的关系，用该试剂盒检测了100例正常对照组、100例肝炎、肝硬化组(即良性肝病组)、127例原发性肝癌组血清的GP73抗体，结果这三组抗体浓度分别为46.36±13.18ng/ml，140.34±18.38ng/ml，259.23±86.72ng/ml。原发性肝癌患者血清中GP73抗体浓度显著高于正常组和肝炎、肝硬化组(P＜0.05)，因此GP73抗体可以作为原发性肝癌诊断和筛查的指标，测试GP73抗体水平为肝癌的诊断和筛查提供了一种新的可靠和有效的方法。
由于采用上述技术方案，本发明的有益效果为：
(1)利用基因工程技术成功表达GP73蛋白抗原，并成功对GP73抗原进行HRP标记，所得GP73蛋白抗原与抗His鼠源单克隆抗体和抗GP73抗体都能特异性结合，将其运用于抗GP73抗体的检测，具有很高的医学价值。
(2)提供了一种检测患者血清中抗GP73抗体的试剂盒，弥补了现有技术的空白。使用本发明的抗GP73抗体检测试剂盒可以准确计算出患者血清内的抗GP73抗体的浓度，能真实地反应出血清中抗GP73抗体的存在水平，可以应用于临床对原发性肝癌进行诊断，通过对抗GP73抗体水平进行检测，还能反映肿瘤自身分子变化的过程，从而判断患病机体的自身免疫反应能力。本发明的试剂盒特异性良好，灵敏度达77.4％、准确性达84.58％，相比于AFP的敏感性50-60％，本发明的试剂盒有显著提高。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
图1为纯化的GP73蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白；1：没有经柱层析纯化的样品溶液；2:样品上层析柱后，未结合在层析柱上的杂蛋白流出液；3:用不含咪唑的洗脱液洗脱出来的蛋白；4-9:分别用含有20mM,40mM,60mM,80mM,100mM,150mM咪唑的洗脱液洗脱出来的蛋白。
图2为基因工程表达的GP73蛋白与抗GP73抗体结合的WesternBlot分析结果，其中，M：蛋白标记物；
1：pColdIII-GP73基因重组质粒转染Transetta(DE3)工程菌，未经IPTG诱导的蛋白分析；
2：pColdIII-GP73基因重组质粒转染Transetta(DE3)工程菌，经IPTG诱导后的蛋白分析；
3:pColdIII-GP73基因重组质粒转染BL21工程菌，未经IPTG诱导目的蛋白分析；
4:pColdIII-GP73基因重组质粒转染BL21工程菌，经IPTG诱导后目的蛋白分析；
5:空质粒pColdIII转染Transetta(DE3)工程菌，未经IPTG诱导的蛋白分析；
6:空质粒pColdIII转染Transetta(DE3)工程菌，经IPTG诱导后的蛋白分析；
7:空质粒pColdIII转染BL21工程菌，未经IPTG诱导的蛋白分析；
8:空质粒pColdIII转染BL21工程菌，经IPTG诱导后的蛋白分析。
图3为吸光度随兔抗人GP73多克隆抗体标准品浓度变化的标准曲线。
图4为GP73自身抗体在正常组、良性肝病组、原发性肝癌组的表达值(ng/ml)。
具体实施方式
本发明提供了一种检测血清中抗GP73抗体的试剂盒，包括GP73蛋白抗原、封闭液、酶标的GP73蛋白抗原、兔抗人GP73多克隆抗体标准品(320ng/ml)、包被缓冲液、显色液、洗涤液、终止液、稀释液。本发明试剂盒自主创新的两个试剂是GP73蛋白抗原和酶标抗原。抗原是发明人通过基因工程技术表达纯化出来，酶标抗原是自主标记。其余试剂为商品化试剂。
本发明的一些实施方案中，会提供GP73蛋白抗原的制备方法。
酶标的GP73蛋白抗原是用辣根过氧化酶标记GP73而获得的，在本发明的一些实施方案中，还提供酶标的GP73蛋白抗原的具体制备过程。
本发明的一些实施方案中，还提供了利用该抗GP73抗体的试剂盒的来检测肝癌患者血清中抗GP73抗体浓度的检测方法。
以下通过具体实施例对本发明作进一步详述。
实施例1检测血清中抗GP73抗体的试剂盒的制备方法
1、制作GP73蛋白抗原
本发明的试剂盒中的GP73蛋白抗原是由人工合成，构成GP73蛋白的氨基酸序列表如SEQIDNO:1所示。本发明中GP73蛋白抗原的制备过程如下：
(1)根据GP73蛋白抗原的基因设计引物，包括上游引物SEQIDNO:3：5'-GGAACGGTACCCACCATCATCATCATCATCAGGCTGCCCTGTCAGTGAGCCAGGAAAA-3'，下游引物SEQIDNO:4：5'-GGAACGTCGACTCAGAGTGTATGATTCCGCTTTTCACGCTGATCAAGTAAATT-3'，用RT-PCR扩增GP73基因，具体步骤是：取无菌PCR管，依次加入2×TaqMasterMix25μl，上游引物和下游引物各2μl，HepG2细胞总RNA的逆转录产物1μl，ddH2O补足至50μl；将加好的各PCR管轻微离心混匀，放至PCR仪进行反应，目的片段大小为330bp；反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃终延伸5min，反应完毕，取3μlPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定；
(2)将扩增的GP73基因和表达质粒pColdIII经过限制性内切酶后，用T4DNA连接酶构建重组质粒；
(3)重组子筛选与鉴定：重组子经蓝白斑筛选、菌落PCR、双酶切鉴定、测序。测序结果表明基因提取完全正确，证实成功构建pColdIII-GP73重组质粒；
(4)GP73目的蛋白表达及鉴定：将pColdIII-GP73重组质粒转化E.coli.BL21，最佳诱导表达条件为37℃过夜培养菌液，OD600达到0.4-0.5时，冷却到15℃并放置45min，加入终浓度0.5mM的IPTG，15℃诱导24h，SDS-PAGE鉴定发现目的蛋白主要出现在上清中，说明GP73蛋白主要以可溶性形式表达电泳结果见图1所示，显示用60mM和80mM咪唑进行洗脱时目的蛋白纯度最高。
(5)GP73目的蛋白纯化：将IPTG诱导表达的基因工程菌超声破菌，离心，收集上清过Ni-NTA亲和层析柱，电泳鉴定目的蛋白纯度可达85％；质谱鉴定证实所获得蛋白为His-GP73融合蛋白；用Bradford法进行浓度测定测得蛋白浓度为57ng/μl；
westernblot结果显示目的条带与抗His鼠源单克隆抗体和抗GP73抗体都能特异性结合(如图2所示)，表明表达纯化的GP73蛋白具有抗原性，图中还可以看出，pColdIII-GP73基因重组质粒经IPTG诱导后，有较多目的蛋白与抗GP73抗体结合。
2、制备酶标的GP73抗原
本发明优选采用辣根过氧化酶标记GP73抗原，其制作的具体过程如下：
(1)HRP标记试剂盒(商品化试剂盒，武汉三鹰公司产品，-20℃贮存)，室温条件下平衡30分钟，使反应启动液和反应终止液充分解冻后混匀；
(2)向每10μl待标记抗原溶液中加入1μl反应启动液，用移液枪反复吹打若干次以充分混匀，避免产生气泡；
(3)打开辣根过氧化酶管盖，将上述已启动抗原溶液直接加到该管中，用移液枪反复吹打若干次以充分混匀，避免产生气泡，室温放置3小时；
(4)向辣根过氧化酶反应管中加入反应终止液，比例为每10μl抗原溶液加入1ml反应终止液，充分混匀，室温放置1小时；
(5)终止完成后，加入等体积的甘油，充分混匀，置于-20℃保存。
3、试剂盒其他溶剂的配制：
兔抗人GP73多克隆抗体标准品：浓度为320ng/ml，购于武汉三鹰生物技术公司；
封闭液：0.5％牛血清白蛋白(BSA)；
包被缓冲液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)；
显色液：包括A液和B液。A液的制备：称取TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)17.2mg，加DMSO(二甲基亚砜)1ml溶解，然后加醋酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH5.5)66ml。B液的制备：取双蒸水100ml，加30％H2O2(双氧水)17微升。使用时A：B液等体积混匀即可。
洗涤液：0.02mol/LPBS(pH7.4)，0.05％Tween-20；
终止液：2mol/L硫酸溶液；
稀释液：0.01mol/lPBS。
实施例2检测血清中抗GP73抗体的试剂盒的使用方法
本发明还提供使用上述试剂盒检测血清中抗GP73抗体含量的检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将兔抗人GP73多克隆抗体标准品(320ng/ml)用0.01mol/lPBS稀释液稀分别释成160ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL五个浓度。
(2)制作吸光度与抗体浓度关系标准曲线：
①包被：用包被缓冲液0.5％牛血清白蛋白(BSA)将GP73蛋白抗原稀释到4ng/ml，4℃包被过夜。
②封闭：洗涤液洗板，拍干，用0.5％BSA封闭1h。
③加入标准品蛋白：洗涤液洗板，拍干，向包被板的微孔中加入上述不同稀释浓度的兔抗人GP73多克隆抗体标准品50μl，重复2孔，用封板膜封板后置37℃温育30min。
④加入酶标GP73蛋白抗原：洗涤液洗板，拍干，每孔加入酶标GP73蛋白抗原50μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育30min。
⑤显色：洗涤液洗板，拍干，每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
⑥终止：每孔加终止液50μl，终止反应。
⑦测定OD值：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
⑧绘制浓度和吸光度标准曲线:以吸光度为横坐标，GP73多抗浓度为纵坐标,绘制吸光度随GP73多抗浓度变化的标准曲线，如图2所示。
在使用试剂盒检测待测病人血清中抗GP73抗体时，将待测病人血清用稀释液稀释5倍，将上述步骤③中加入标准品蛋白换成加入待测病人血清稀释液50μl进行测试，测得吸光度值。将待测样品吸光度值代入标准曲线即可求出病人血清中抗GP73抗体浓度。
实施例3试剂盒对正常人标本，肝炎、肝硬化标本，以及肝癌标本的检测结果
发明人用该试剂盒检测了100例正常对照组，100例肝炎、肝硬化组(即良性肝病组)，127例原发性肝癌组血清的GP73抗体，结果这三组抗体浓度分别为46.36±13.18ng/ml，140.34±18.38ng/ml，259.23±86.72ng/ml，如图3所示。原发性肝癌患者血清GP73抗体浓度显著高于正常组和肝炎、肝硬化组(P＜0.05)，肝炎、肝硬化患者血清GP73抗体浓度与正常组之间也有显著的统计学差异(P＜0.05)。
以正常组作为肝癌对照组，按照正常人平均检测值加上正负3个标准差(x±3sd)界定异常血清临界值(cutoff值)，则cutoff值为85.90ng/ml；根据这一界定标准，划分出阳性血清标本，100例良性肝病组和127例原发性肝癌血清中全为阳性，100例正常人血清有0例阳性，其敏感性、特异性和准确度均为100％。
以肝炎肝硬化即肝病组作为对照组，按照肝病病人x±3sd界定肝癌血清阳性值(cutoff值)，则cutoff值为为195.48ng/ml，根据这一界定标准，127例肝癌有35例小于195.48ng/ml，92例大于195.48ng/ml。即127例肝癌患者检出率为92例，其敏感性、特异性和准确度分别为77.4％、100％、84.58％。
本试剂盒的精密度测试：
取标准品抗体160ng/ml，进行同一批次8次重复实验，计算结果分别是：161.706ng/ml、162.837ng/ml、162.278ng/ml、162.538ng/ml、163.179ng/ml、161.432ng/ml、161.789ng/ml、162.835ng/ml。
标准差SD＝0.628722
平均值X＝162.32425
变异系数＝0.628722/162.32425X100％＝0.38％
取标准品抗体160ng/ml，进行4批次实验，每批次计算平均值分别是：162.271ng/ml，162.408ng/ml，162.908ng/ml，162.312ng/ml，计算其变异系数为0.18％。
综上所述，本发明的试剂盒可以用于检测患者血清内的抗GP73抗体的浓度，能真实地反应出血清中抗GP73抗体的存在水平，可以应用于临床对原发性肝癌进行诊断，从而判断患病机体的自身免疫反应能力，对肝癌的治疗也有参考价值。本发明的试剂盒在测试血清中抗GP73抗体是，具有特异性良好，敏感性、准确性和精密度高的优点。
SEQUENCELISTING
<110>广西医科大学
<120>检测血清中抗GP73抗体的试剂盒
<160>3
<210>1
<211>99
<212>PRT
<213>来源于人类的GP73蛋白的氨基酸序列表
<400>1
GlnAlaAlaLeuSerValSerGlnGluAsnProGluMetGluGlyPro
151015
GluArgAspGlnLeuValIleProAspGlyGlnGluGluGluGlnGlu
202530
AlaAlaGlyGluGlyArgAsnGlnGlnLysLeuArgGlyGluAspAsp
354045
TyrAsnMetAspGluAsnGluAlaGluSerGluThrAspLysGlnAla
505560
AlaLeuAlaGlyAsnAspArgAsnIleAspValPheAsnValGluAsp
65707580
GlnLysArgAspThrIleAsnLeuLeuAspGlnArgGluLysArgAsn
859095
HisThrLeu
99
<210>2
<211>297
<212>DNA
<213>来源于人类的GP73蛋白的氨基酸序列表对应的核苷酸序列表
<400>2
caggctgccctgtcagtgagccaggaaaatccagagatggagggccctgagcgagaccag60
cttgtcatccccgacggacaggaggaggagcaggaagctgccggggaagggagaaaccag120
cagaaactgagaggagaagatgactacaacatggatgaaaatgaagcagaatctgagaca180
gacaagcaagcagccctggcagggaatgacagaaacatagatgtttttaatgttgaagat240
cagaaaagagacaccataaatttacttgatcagcgtgaaaagcggaatcatacactc297
<210>3
<211>58
<212>序列的类型（DNA或RNA）
<213>人工序列
<400>3
GGAACGGTACCCACCATCATCATCATCATCAGGCTGCCCTGTCAGTGAGCCAGGAAAA58
<210>4
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
GGAACGTCGACTCAGAGTGTATGATTCCGCTTTTCACGCTGATCAAGTAAATT53

Claims (7)

1.检测血清中抗GP73抗体的试剂盒，其特征在于：包括GP73蛋白抗原、封闭液、酶标的GP73蛋白抗原、兔抗人GP73多克隆抗体标准品、包被缓冲液、显色液、洗涤液、终止液、稀释液，其中，所述GP73蛋白抗原具有序列表SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测血清中抗GP73抗体的试剂盒，其特征在于所述GP73蛋白抗原的制备步骤如下：
(1)根据GP73蛋白抗原基因设计引物，包括上游引物5'-GGAACGGTACCCACCATCATCATCATCATCAGGCTGCCCTGTCAGTGAGCCAGGAAAA-3'，下游引物5'-GGAACGTCGACTCAGAGTGTATGATTCCGCTTTTCACGCTGATCAAGTAAATT-3'，RT-PCR扩增GP73基因，步骤是：取无菌PCR管，依次加入2×TaqMasterMix25μl，上游引物和下游引物各2μl，HepG2细胞总RNA的逆转录产物1μl，ddH2O补足至50μl；将加好的各PCR管轻微离心混匀，放至PCR仪进行反应，目的片段大小为330bp；反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃终延伸5min，反应完毕，取3μlPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定；
(2)将扩增的GP73基因和表达质粒pColdIII经过限制性内切酶后，用T4DNA连接酶构建重组质粒；
(3)重组质粒筛选与鉴定：重组质粒用蓝白斑筛选、菌落PCR、双酶切鉴定、测序后与GenBank中序列比对确认基因序列是否正确；
(4)GP73目的蛋白表达及鉴定：将pColdIII-GP73重组质粒转化E.coli.BL21，诱导表达条件为37℃过夜培养菌液，OD600达到0.4-0.5时，冷却到15℃并放置45min，加入终浓度0.5mM的IPTG，15℃诱导24h；SDS-PAGE鉴定GP73蛋白是否成功表达；
(5)GP73目的蛋白纯化：将IPTG诱导表达的基因工程菌超声破菌，离心，收集上清过Ni-NTA亲和层析柱，电泳鉴定目的蛋白纯度，Bradford法测定蛋白浓度。
3.根据权利要求1所述的检测血清中抗GP73抗体的试剂盒，其特征在于：所述酶标GP73蛋白抗原的制作过程如下：
(1)将辣根过氧化酶(HRP)标记试剂盒在室温条件下平衡30分钟，使反应启动液和反应终止液充分解冻后摇匀；
(2)向每10μl待标记GP73蛋白抗原溶液中加入1μl反应启动液，用移液枪反复吹打若干次以充分混匀，避免产生气泡；
(3)打开辣根过氧化酶反应管盖，将上述已启动GP73蛋白抗原溶液直接加到该管中，用移液枪反复吹打若干次以充分混匀，避免产生气泡，室温放置3小时；
(4)向辣根过氧化酶反应管中加入反应终止液，比例为每10μl抗原溶液加入1ml反应终止液，充分混匀，室温放置1小时；
(5)终止完成后，加入与反应管内反应液等体积的甘油，充分混匀，置于-20℃保存。
4.根据权利要求2所述的检测血清中抗GP73抗体的试剂盒，其特征在于：所述包被缓冲液为pH9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液。
5.根据权利要求2所述的检测血清中抗GP73抗体的试剂盒，其特征在于：所述显色液包括A液和B液，A液是称取3,3',5,5'-四甲基联苯胺17.2mg，加二甲基亚砜1ml溶解，然后加0.1mol/L，pH5.5的醋酸钠缓冲液66ml制得，B液是取双蒸水100ml，加30％H2O217微升制得。
6.根据权利要求2所述的检测血清中抗GP73抗体的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液包含0.02mol/LpH7.4的PBS，0.05％Tween-20。
7.根据权利要求2所述的检测血清中抗GP73抗体的试剂盒，其特征在于：所述稀释液为0.01mol/lPBS。
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