CN104212775A - 一种干酪乳杆菌鼠李糖亚种的亚硝酸盐还原酶的制备方法 - Google Patents

一种干酪乳杆菌鼠李糖亚种的亚硝酸盐还原酶的制备方法 Download PDF

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刘冬梅
陈浩
周劲松
张馨月
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Abstract

本发明公开了一种干酪乳杆菌鼠李糖亚种的亚硝酸盐还原酶的制备方法，首先将干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp rhamnosus)6013进行含亚硝酸盐还原酶的诱导培养，破壁时加入酶保护剂提取亚硝酸盐还原酶粗酶，再进行真空冷冻干燥后，依次经阴离子交换层析和/或葡聚糖凝胶层析，最后制得纯亚硝酸盐还原酶，从干酪乳杆菌鼠李糖亚种中提取的NiR的活力高，NiR降解亚硝酸盐的条件简单；本发明所公开的条件可使NiR的酶活损失少，得到的NiR纯度高，NiR可以解决蔬菜发酵、肉制品和养殖水体等3个领域中含亚硝酸盐的问题。

Description

一种干酪乳杆菌鼠李糖亚种的亚硝酸盐还原酶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物制品领域，为一种干酪乳杆菌鼠李糖亚种Lactobacilluscasei subsp.rhamnosus6013(简称为LCR 6013)中亚硝酸盐还原酶的制备方法。
背景技术
亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质，在蔬菜发酵过程中极易积累，给产品带来潜在的食品安全问题，且过量摄入亚硝酸盐可诱发高铁血红蛋白症，因此严格控制食品中亚硝酸盐的含量非常重要。许多研究表明亚硝酸盐是亚硝胺的前体物，亚硝胺是一种强致癌物，可以诱发消化***中的多种癌变，如胃癌、肠癌和肝癌。鉴于食品可能存在超标亚硝酸盐污染，肉制品中含有亚硝酸盐的潜在食品安全问题，水产养殖水体亚硝酸盐超标导致潜在食品安全问题等一系列的问题，寻求有效控制或降解亚硝酸盐的方法势在必行，除了加入食用安全的微生物外，还可利用亚硝酸盐还原酶(Nitrite reductase，简称为NiR)进行亚硝酸盐的生物降解。但是，目前对如何得到大量的食用安全的NiR还没有很好的方法。NiR是一种氧化还原酶，反应过程中需要电子传递体的参与，而且受氧气的抑制。
降解亚硝酸盐的方法中微生物降解法是最常用的方法，主要有假单胞菌属[陈瑞芳，徐长安，刘丽梅，等.一株假单胞菌的亚硝酸盐降解特性及其对鱼池底泥的净化作用，研究报告，2011，35(6)：30-33]和乳酸菌(张馨月，刘冬梅，许喜林，等.LCR 6013降解亚硝酸盐的途径及其亚硝酸盐还原的初步定位，现代食品科技，2013，11(29)：2627-2632)等。由于假单胞菌用于食品降亚硝酸盐存在潜在的毒性和风险，而从食用安全的干酪乳杆菌中提取亚硝酸盐还原酶又未见报道，申请号为201110207974.3的中国发明专利公开了“一种乳酸菌亚硝酸盐还原酶的生产方法”，该法利用简单的机械破碎和离心的方法收集粗酶，由于粗酶液中含有大量的杂蛋白，使得后续的分离和纯化工作复杂，无法大量得到目标产物NiR，另外，该法中用于产酶的培养基成分含有西红柿汁，由于西红柿红色的原因，使得最终NiR中不可避免带有红色素，影响后续的纯化工作和应用。
发明内容
本发明目的在于提供一种干酪乳杆菌中NiR的制备方法，通过诱导培养出含亚硝酸盐还原酶的LCR 6013菌体，再通过一系列破壁的方法制备粗酶液，最后通过阴离子层析柱和葡聚糖凝胶层析柱层析分离纯的亚硝酸盐还原酶。
本发明可以通过以下技术方案实现：
一种干酪乳杆菌鼠李糖亚种的亚硝酸盐还原酶的制备方法，包括如下步骤和工艺条件：
(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)6013的冻干粉置于MRS培养基中，于30℃～40℃静止培养18h～36h后，制成种子液；所述的干酪乳杆菌鼠李糖亚种购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC6013；
(2)以1％～10％的体积百分比，将上述种子液接种至诱导培养基A中，于30℃～40℃静止诱导培养18h～24h，得诱导工作发酵剂；所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO25μg/mL～20μg/mL的MRS培养基；
(3)以5％～15％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于30℃～40℃静止诱导培养24h～36h，得含亚硝酸盐还原酶的培养液；所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO210μg/mL～50μg/mL的MRS培养基；
(4)将含亚硝酸盐还原酶的培养液进行离心，用生理盐水清洗后离心，得含亚硝酸盐还原酶的菌体；
(5)加入提酶缓冲液，使含亚硝酸盐还原酶的菌体浓度为150mg/mL～400mg/mL，加入溶菌酶(购自Sigma-Aldrich,Shanghai,货号：62971-50G-F，酶活：70000U/mg)10mg/L，混匀后破壁1h～5h，破壁溶液经离心后的上清液为亚硝酸盐还原酶粗酶液。
步骤(5)所述溶菌酶的浓度为10mg/mL～50mg/mL。
步骤(5)所述提酶缓冲液中含有胰蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为2μg/mL～10μg/mL和2.0μmol/mL～20.0μmol/mL。
所述亚硝酸盐还原酶粗酶液经真空冷冻干燥，得亚硝酸盐还原酶粗酶粉；所述亚硝酸盐还原酶粗酶粉还经过如下分离纯化步骤：将粗酶粉溶于HEPES缓冲液中得粗酶粉液，再依次经过阴离子交换层析和/或葡聚糖凝胶层析纯化，最后制得纯亚硝酸盐还原酶。
所述阴离子交换层析采用高流速离子型琼脂糖凝胶(DEAE Sepharose FastFlow)阴离子交换层析柱，所述葡聚糖凝胶层析采用葡聚糖凝胶(SephadexG-150)层析柱。
所述阴离子交换层析是将于HEPES缓冲液中溶解的粗酶粉液上样至阴离子交换层析柱上，先用HEPES缓冲液将蛋白质洗至基线，再在上述的HEPES缓冲液中加入0mM～600mM的NaCl溶液进行梯度洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的亚硝酸盐还原酶酶活，合并具有亚硝酸盐还原酶的组分，并用聚乙二醇20000浓缩。
所述葡聚糖凝胶层析是将样品上样至葡聚糖凝胶层析柱上，用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的亚硝酸盐还原酶酶活，合并具有亚硝酸盐还原酶酶活的组分。
所述HEPES缓冲液浓度为20mM～80mM，pH为7.0～8.6；所述Tris-HCl缓冲液浓度为20mM～80mM，pH为7.8～8.6。
所述阴离子交换层析和葡聚糖凝胶层析中洗脱的流速分别为0.5mL/min～1.5mL/min和0.1mL/min～0.6mL/min。
所述粗酶粉液中粗酶粉的浓度为3～20mg/mL。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
(1)本发明中使用的干酪乳杆菌鼠李糖亚种Lactobacillus casei subsprhamnosus6013的产NiR稳定，所需培养基来源广泛，生产成本低，具有良好的商业前景。
(2)所制备的NiR活力高，NiR降解亚硝酸盐的条件简单，最适酶催化温度为37℃，最适pH为7.2，在含150mM/L NaCl溶液中活性最高，在30℃～40℃内具有稳定的NiR酶活。
(3)本发明所公开的方法可使NiR的酶活损失少，得到的NiR纯度高，NiR可以解决蔬菜发酵、肉制品和养殖水体等3个领域中含亚硝酸盐的问题。
附图说明
图1为LCR 6013粗酶液用阴离子交换层析柱DEAE Sepharose Fast Flow分离后的蛋白质曲线图(其中第3个峰有NiR活性)。
图2为LCR 6013粗酶液经阴离子柱分离后第3个峰的蛋白质用葡聚糖凝胶层析柱Sepharose G-150分离后的蛋白质曲线图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。
实施例1
(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于37℃静止培养24h后，制成种子液；所述的干酪乳杆菌鼠李糖亚种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC6013，命名为Lactobacillus casei subsp.rhamnosus6013(简称为LCR 6013)。
(2)以5％的体积百分比，将LCR 6013种子液接种至诱导培养基A中，于37℃静止诱导培养24h，得诱导工作发酵剂。以质量体积浓度计，所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO210μg/mL的MRS培养基。
(3)以10％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于37℃静止诱导培养36h，得含NiR的培养液。以质量体积浓度计，所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO215μg/mL的MRS培养基。
(4)将含NiR的培养液进行离心，用生理盐水清洗2次后离心，得含NiR的LCR 6013菌体并称重。
(5)加入含胰蛋白酶抑制剂2μg/mL和二硫苏糖醇5.0μmol/mL的提酶缓冲液，使LCR 6013菌体浓度为150mg/mL，加入溶菌酶(购自Sigma-Aldrich,Shanghai,货号：62971-50G-F，酶活：70000U/mg)10mg/L，混匀后破壁2h，破壁溶液经离心后的上清液为LCR 6013 NiR粗酶液，其NiR酶活为165U。
(6)将LCR 6013 NiR粗酶液进行真空冷冻干燥，得LCR 6013 NiR粗酶粉。
(7)以浓度3mg/mL将LCR 6013 NiR粗酶粉溶解于pH7.8的50mM HEPES缓冲液中，为LCR 6013粗酶粉溶液，再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAESepharose Fast Flow阴离子交换层析柱进行层析，阴离子交换层析先用相同的HEPES缓冲液平衡，然后将LCR 6013粗酶粉溶液上样至阴离子交换层析柱上，再在上述的HEPES缓冲液中加入0mM～250mM的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱速度为1.0mL/min，分部收集，测定每个洗脱峰的NiR酶活，合并具有NiR的组分，并用聚乙二醇20000浓缩；洗脱曲线如图1所示，三个峰的NaCl洗脱浓度分别为0mM、50mM、250mM，第三个峰有NiR的活性。
(8)葡聚糖凝胶SephadexG-150层析柱先用pH7.8的20mM Tris-HCl缓冲液平衡，再经阴离子层析后所得的亚硝酸盐还原酶组分上样至葡聚糖凝胶层析柱后，用相同的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，洗脱速度为0.5mL/min，洗脱曲线如图2所示，分部收集，测定洗脱峰中每管的NiR酶活(12～15管有活性)，合并具有NiR酶活的组分，得到NiR纯酶液，其NiR酶活为2510U。
以亚硝酸钠为底物，采用分光光度法测定酶液的NiR酶活。具体测定和计算方法如下：用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的含量，取1mL待测样品加入到25mL比色管中，加蒸馏水定容至20mL，再分别加入2mL的0.4％对氨基苯磺酸，摇匀，静置5min，最后加入1mL的0.2％盐酸萘乙二胺，用蒸馏水定容25mL，摇匀，静置15min，用分光光度计测定其在538nm的吸光度，该吸光度代入标准曲线方程后，可计算出待测样品中的亚硝酸盐含量，单位为μg/L。
NiR反应体系(总体积为1mL)：在600μL的pH7.4的50mM HEPES缓冲溶液中，加入200μL的500μg/mL亚硝酸盐(使亚硝酸盐浓度为100μg/mL)，再加入200μL上述制备的NiR纯酶液，于30℃下静置反应20h后，灭酶，最后测定反应体系中亚硝酸盐含量。NiR的酶活单位：在反应体系每小时每毫克蛋白质降解亚硝酸钠的纳克(ng)数为一个酶活单位(U)。酶活计算公式如下：Activity(U)＝m/(M×t)，其中m为降解的亚硝酸钠的质量，单位为ng；M为反应物中酶蛋白质的质量，单位为mg；t为反应时间，单位为h。
实施例2
(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于30℃静止培养18h后，制成LCR 6013种子液；所述的干酪乳杆菌鼠李糖亚种购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC6013，命名为Lactobacillus caseisubsp.rhamnosus6013(简称为LCR 6013)。
(2)以1％的体积百分比，将LCR 6013种子液接种至诱导培养基A中，于30℃静止诱导培养18h，得诱导工作发酵剂。以质量体积浓度计，所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO25μg/mL的MRS培养基。
(3)以5％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于30℃静止诱导培养24h，得含NiR的培养液。以质量体积浓度计，所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO210μg/mL的MRS培养基。
(4)将含NiR的培养液进行离心，用生理盐水清洗2次后离心，得含NiR的LCR 6013菌体并称重。
(5)加入含胰蛋白酶抑制剂3μg/mL和二硫苏糖醇浓度2.0μmol/mL提酶缓冲液，使LCR 6013菌体浓度为250mg/mL，加入溶菌酶50mg/L，混匀后破壁1h，破壁溶液经离心后的上清液为LCR 6013 NiR粗酶液，其NiR酶活为151U。
(6)将LCR 6013粗酶液进行真空冷冻干燥，得LCR 6013 NiR粗酶粉。
(7)以浓度为8mg/mL将LCR 6013 NiR粗酶粉溶解于pH7.4的20mMHEPES缓冲液中，为LCR 6013粗酶粉溶液，再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱进行层析，阴离子交换层析柱先用相同的HEPES缓冲液平衡，然后将LCR 6013粗酶粉溶液，上样至阴离子交换层析柱上，再在上述的HEPES缓冲液中加入0mM～400mM的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱速度为0.5mL/min，分部收集，测定每个洗脱峰的NiR酶活，三个峰的NaCl洗脱浓度分别为0mM、100mM、400mM，第三个峰有NiR的活性，合并具有NiR的组分，并用聚乙二醇20000浓缩。
(8)葡聚糖凝胶SephadexG-150层析柱先用pH8.0的60mM Tris-HCl缓冲液平衡，再经阴离子层析后所得的亚硝酸盐还原酶组分上样至葡聚糖凝胶层析柱后，用相同的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，洗脱速度为0.1mL/min，分部收集，测定洗脱峰中每管的NiR酶活，合并具有NiR酶活的组分，其NiR酶活为2420U。
实施例3
(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于40℃静止培养20h后，制成种子液；所述的干酪乳杆菌鼠李糖亚种购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC6013，命名为Lactobacillus casei subsp.rhamnosus6013(简称为LCR 6013)。
(2)以3％的体积百分比，将LCR 6013种子液接种至诱导培养基A中，于40℃静止诱导培养20h，得诱导工作发酵剂。以质量体积浓度计，所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO220μg/mL的MRS培养基。
(3)以15％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于40℃静止诱导培养24h，得含NiR的培养液。以质量体积浓度计，所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO225μg/mL的MRS培养基。
(4)将含NiR的培养液进行离心，用生理盐水清洗2次后离心，得含NiR的LCR 6013菌体并称重。
(5)加入含胰蛋白酶抑制剂5μg/mL和二硫苏糖醇浓度8.0μmol/mL的提酶缓冲液，使LCR 6013菌体浓度为200mg/mL，加入溶菌酶20mg/L，混匀后破壁3h，破壁溶液经离心后的上清液为LCR 6013 NiR粗酶液，其NiR酶活为148U。
(6)将LCR 6013 NiR粗酶液进行真空冷冻干燥，得LCR 6013 NiR粗酶粉。(7)以浓度为5mg/mL将LCR 6013 NiR粗酶粉溶解于pH8.0的80mMHEPES缓冲液中，为LCR 6013粗酶粉溶液，再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱进行层析，阴离子交换层析柱先用相同的HEPES缓冲液平衡，然后将LCR 6013粗酶粉溶液，上样至阴离子交换层析柱上，再在上述的HEPES缓冲液中加入0mM～500mM的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱速度为1.5mL/min，分部收集，测定每个洗脱峰的NiR酶活，三个峰的NaCl洗脱浓度分别为0mM、150mM、500mM，第三个峰有NiR的活性，合并具有NiR的组分，并用聚乙二醇20000浓缩。
(8)葡聚糖凝胶层析柱SephadexG-150先用pH8.6的80mM Tris-HCl缓冲液平衡，再将经阴离子层析后所得的亚硝酸盐还原酶组分上样至葡聚糖凝胶层析柱后，用相同的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，洗脱速度为0.6mL/min，分部收集，测定洗脱峰中每管的NiR酶活，合并具有NiR酶活组分，其NiR酶活为2351U。
实施例4
(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于37℃静止培养36h后，制成种子液；所述的干酪乳杆菌鼠李糖亚种购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC6013，命名为Lactobacillus casei subsp.rhamnosus6013(简称为LCR 6013)。
(2)以10％的体积百分比，将LCR 6013种子液接种至诱导培养基A中，于37℃静止诱导培养22h，得诱导工作发酵剂。以质量体积浓度计，所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO215μg/mL的MRS培养基。
(3)以12％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于37℃静止诱导培养30h，得含NiR的培养液。以质量体积浓度计，所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO240μg/mL的MRS培养基。
(4)将含NiR的培养液进行离心，用生理盐水清洗2次后离心，得含NiR的LCR 6013菌体并称重。
(5)加入含胰蛋白酶抑制剂6μg/mL和二硫苏糖醇15.0μmol/mL的提酶缓冲液，使LCR 6013菌体浓度为300mg/mL，加入溶菌酶15mg/L，混匀后破壁4h，破壁溶液经离心后的上清液为LCR 6013 NiR粗酶液，其NiR酶活为132U。
(6)将LCR 6013 NiR粗酶液进行真空冷冻干燥，得LCR 6013 NiR粗酶粉。
(7)以浓度为10mg/mL将LCR 6013 NiR粗酶粉溶解于pH8.6的40mMHEPES缓冲液中，为LCR 6013粗酶粉溶液，再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱进行层析，阴离子交换层析柱先用相同的HEPES缓冲液平衡，然后将LCR 6013粗酶粉溶液，上样至阴离子交换层析柱上，再在上述的HEPES缓冲液中加入0mM～600mM的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱速度为1.2mL/min，分部收集，测定每个洗脱峰的NiR酶活，三个峰的NaCl洗脱浓度分别为0mM、125mM、600mM，第三个峰有NiR的活性，合并具有NiR的组分，并用聚乙二醇20000浓缩。
(8)葡聚糖凝胶SephadexG-150层析柱先用pH8.4的40mM Tris-HCl缓冲液平衡，再将经阴离子层析后所得的亚硝酸盐还原酶组分上样至葡聚糖凝胶层析柱后，用相同的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，洗脱速度为0.4mL/min，分部收集，测定洗脱峰中每管的NiR酶活，合并具有NiR酶活的组分，其NiR酶活为2025U。
实施例5
(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于37℃静止培养24h后，制成种子液；所述的干酪乳杆菌鼠李糖亚种购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC6013，命名为Lactobacillus casei subsp.rhamnosus6013(简称为LCR 6013)。
(2)以5％的体积百分比，将LCR 6013种子液接种至诱导培养基A中，于37℃静止诱导培养24h，得诱导工作发酵剂。以质量体积浓度计，所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO210μg/mL的MRS培养基。
(3)以12％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于37℃静止诱导培养36h，得含NiR的培养液。以质量体积浓度计，所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO220μg/mL的MRS培养基。
(4)将含NiR的培养液进行离心，用生理盐水清洗2次后离心，得含NiR的LCR 6013菌体并称重。
(5)加入胰蛋白酶抑制剂8μg/mL和二硫苏糖醇10.0μmol/mL的提酶缓冲液，使LCR 6013菌体浓度为400mg/mL，加入溶菌酶50mg/L，混匀后破壁1h，破壁溶液经离心后的上清液为LCR 6013 NiR粗酶液，其NiR酶活为143U。
(6)将LCR 6013 NiR粗酶液进行真空冷冻干燥，得LCR 6013 NiR粗酶粉。
(7)以浓度15mg/mL将LCR 6013 NiR粗酶粉溶解于pH7.0的60mM HEPES缓冲液中，为LCR 6013粗酶粉溶液，再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAESepharose Fast Flow阴离子交换层析柱进行层析，阴离子交换层析柱先用相同的HEPES缓冲液平衡，然后将LCR 6013粗酶粉溶液，上样至阴离子交换层析柱上，再在上述的HEPES缓冲液中加入0mM～450mM的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱速度为1.5mL/min，分部收集，测定每个洗脱峰的NiR酶活，三个峰的NaCl洗脱浓度分别为0mM、200mM、450mM，第三个峰有NiR的活性，合并具有NiR的组分，并用聚乙二醇20000浓缩。
(8)葡聚糖凝胶SephadexG-150层析柱先用pH7.8的50mM Tris-HCl缓冲液平衡，再经阴离子层析后所得的亚硝酸盐还原酶组分上样至葡聚糖凝胶层析柱后，用相同的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，洗脱速度为0.3mL/min，分部收集，分部收集，测定洗脱峰中每管的NiR酶活，合并具有NiR酶活的组分，其NiR酶活为2158U。
实施例6
(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于35℃静止培养30h后，制成种子液；所述的干酪乳杆菌鼠李糖亚种购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC6013，命名为Lactobacillus casei subsp.rhamnosus6013(简称为LCR 6013)。
(2)以8％的体积百分比，将LCR 6013种子液接种至诱导培养基A中，于37℃静止诱导培养24h，得诱导工作发酵剂。以质量体积浓度计，所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO212μg/mL的MRS培养基。
(3)以8％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于37℃静止诱导培养36h，得含NiR的培养液。以质量体积浓度计，所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO250μg/mL的MRS培养基。
(4)将含NiR培养液进行离心，用生理盐水清洗2次后离心，得含NiR的LCR 6013菌体并称重。
(5)加入含胰蛋白酶抑制剂10μg/mL和二硫苏糖醇20.0μmol/mL的提酶缓冲液，使LCR 6013菌体浓度为250mg/mL，加入溶菌酶30mg/L，混匀后破壁5h，破壁溶液经离心后的上清液为LCR 6013 NiR粗酶液，其NiR酶活为159U。
(6)将LCR 6013 NiR粗酶液进行真空冷冻干燥，得LCR 6013 NiR粗酶粉。(7)以浓度为20mg/mL将LCR 6013 NiR粗酶粉溶解于pH7.8的30mMHEPES缓冲液中，为LCR 6013粗酶粉溶液，再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱进行层析，阴离子交换层析柱先用相同的HEPES缓冲液平衡，然后将LCR 6013粗酶粉溶液，上样至阴离子交换层析柱上，再在上述的HEPES缓冲液中加入0mM～550mM的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱速度为1.0mL/min，分部收集，测定每个洗脱峰的NiR酶活，三个峰的NaCl洗脱浓度分别为0mM、220mM、550mM，第三个峰有NiR的活性，合并具有NiR的组分，并用聚乙二醇20000浓缩。
(8)葡聚糖凝胶SephadexG-150层析柱先用pH8.2的30mM Tris-HCl缓冲液平衡，再经阴离子层析后所得的亚硝酸盐还原酶组分上样至葡聚糖凝胶层析柱，再用相同的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，洗脱速度为0.5mL/min，分部收集，测定洗脱峰中每管的NiR酶活，合并具有NiR酶活的组分，其NiR酶活为2310U。

Claims (10)

1.一种干酪乳杆菌鼠李糖亚种的亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤和工艺条件：
(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)6013的冻干粉置于MRS培养基中，于30℃～40℃静止培养18h～36h后，制成种子液；
(2)以1％～10％的体积百分比，将上述种子液接种至诱导培养基A中，于30℃～40℃静止诱导培养18h～24h，得诱导工作发酵剂；所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO25μg/mL～20μg/mL的MRS培养基；
(3)以5％～15％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于30℃～40℃静止诱导培养24h～36h，得含亚硝酸盐还原酶的培养液；所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO210μg/mL～50μg/mL的MRS培养基；
(4)将含亚硝酸盐还原酶的培养液进行离心，用生理盐水清洗后离心，得含亚硝酸盐还原酶的菌体；
(5)加入提酶缓冲液，使含亚硝酸盐还原酶的菌体浓度为150mg/mL～400mg/mL，加入溶菌酶，混匀后破壁1h～5h，破壁溶液经离心后的上清液为亚硝酸盐还原酶粗酶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述溶菌酶的浓度为10mg/mL～50mg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述提酶缓冲液中含有胰蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为2μg/mL～10μg/mL和2.0μmol/mL～20.0μmol/mL。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述亚硝酸盐还原酶粗酶液经真空冷冻干燥，得亚硝酸盐还原酶粗酶粉；所述亚硝酸盐还原酶粗酶粉还经过如下分离纯化步骤：将粗酶粉溶于HEPES缓冲液中得粗酶粉液，再依次经阴离子交换层析和/或葡聚糖凝胶层析，最后制得纯亚硝酸盐还原酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析采用高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，所述葡聚糖凝胶层析采用葡聚糖凝胶Sephadex G-150层析柱。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析是将于HEPES缓冲液中溶解的粗酶粉液上样至阴离子交换层析柱上，先用HEPES缓冲液将蛋白质洗至基线，再在上述的HEPES缓冲液中加入0mM～600mM的NaCl溶液进行梯度洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的亚硝酸盐还原酶酶活，合并具有亚硝酸盐还原酶的组分，并用聚乙二醇20000浓缩。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述葡聚糖凝胶层析是将样品上样至葡聚糖凝胶层析柱上，用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的亚硝酸盐还原酶酶活，合并具有亚硝酸盐还原酶酶活的组分。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述HEPES缓冲液浓度为20mM～80mM，pH为7.0～8.6；所述Tris-HCl缓冲液浓度为20mM～80mM，pH为7.8～8.6。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析和葡聚糖凝胶层析中洗脱的流速分别为0.5mL/min～1.5mL/min和0.1mL/min～0.6mL/min。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述粗酶粉液中粗酶粉的浓度为3～20mg/mL。
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