CN104211947A - 一种非线性聚合物及其制备和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新非线性聚合化合物，以及这种新非线性化合物的制备方法和用途。本发明利用具有分支结构的化合物构架了非线性的新聚合化合物，并用该新结构非共价键结合相关待体内筛选的有潜在治疗作用的蛋白，在体内配合动物模型快速方便地筛选有潜在治疗活性的蛋白。该含有金属离子结构的新非线性的化合物在筛选蛋白过程中的特点包括：一，快捷简便，为体内筛选活性而结合蛋白的用时少于15分钟；二，体内筛选过程不改变蛋白结构，该筛选过程与蛋白不发生共价链接反应。
Description
技术领域
本发明公开了一种新的非线性聚合物以及该聚合物的制备方法和用途。
背景技术
蛋白药物是未来非常重要的临床用药治疗手段，但是目前由于蛋白药物的稳定性，半衰期短等诸多缺点，使其在体外确定潜在有效后无法在体内有效地筛选活性。是很多很有价值的蛋白药物无法在体内得到验证。有学者用一些有保护作用的化合物共价连接蛋白后用于体内筛选或治疗，但是如此链接蛋白会使蛋白的结构发生变化，并且会耗时耗力耗财，非常麻烦，尤其是共价链接的反应时间多达数小时，甚至几天，因此严重破坏了蛋白药物的活性，曲解了蛋白药物的实际作用。本发明制备了一种含有金属离子结构的新非线性的化合物，利用具有分支结构的化合物构架了非线性的新化合物，新结构配价键即非共价键结合相关待筛选的在体外已证明有潜在治疗作用的蛋白，在体内配合动物模型快速方便地筛选有潜在治疗活性的蛋白。该含有金属离子结构的新非线性的化合物的在筛选蛋白过程中的特点包括：一，快捷简便，为体内筛选活性而结合蛋白的用时少于15分钟；二，体内筛选过程不改变蛋白结构，该筛选过程与蛋白不发生共价链接反应。
发明内容
1.其结构如下：
其中A代表金属离子，优选钙离子，镁离子，钴离子，钡离子，铂离子，镍离子，铜离子。其中聚合物中的聚乙二醇分子量为100-200000，m=1-5000之间的整数，优选m=1-2000之间的整数。该化合物的制备方法，其特征在于：
1）含有氨三乙酸-赖氨酸的结构A与化合物B在碳酸氢钠溶液中反应得到化合物C；
2）化合物C与含聚乙二醇的Y型化合物D搅拌反应后得到化合物E；其中聚合物中的聚乙二醇分子量为100-200000；
3）化合物E与金属离子化合物反应得化合物F；
化合物A；
化合物B；
化合物C；
化合物D，m=1-5000之间的整数，优选m=1-2000之间的整数；
化合物E；
终产物F，A代表金属离子。其中所述化学步骤选用溶剂选自：乙酸、甲酸、苯、甲苯、吡啶、四氢呋喃、三氟乙酸、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、甲醇、乙醇、二氯甲烷、二甲基亚砜、N, N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。
其中最优选结构为：
和
m=1-5000之间的整数，优选m=1-2000之间的整数。
本发明所述化合物在快捷简便筛选蛋白作用上的用途。该化合物在筛选过程中结合蛋白的用时少于15分钟，并且该化合物采用非共价键结合蛋白。该化合物配价键结合蛋白后可制备成适于体内筛选的肌肉，静脉或是局部给药的制剂。其可以是普通制剂、控释制剂、靶向制剂等。整个反应的其中所述化学步骤选用溶剂选自：乙酸、甲酸、苯、甲苯、吡啶、四氢呋喃、三氟乙酸、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、甲醇、乙醇、二氯甲烷、二甲基亚砜、N, N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。
本发明的制备方法具体如下：
将化合物A（商购）10mg-10g与化合物B （商购）0.01g-5g至于溶剂中0.1-96小时，在50度-100度加热1-48小时后冷却，调节PH至2-5，减压浓缩后，在乙醇中洗涤，干燥后得化合物C，商购的含有聚乙二醇的Y型化合物D（商购）与C在磷酸盐中搅拌1-10小时，减压浓缩得化合物E，化合物E与1-5mol的金属离子化合物反应1-48小时得最终产物化合物F。F随后与等摩尔的目标蛋白简单混合1-15分钟，而后直接使用或是制成相关制剂冻干后即得的冻干制剂。
反应路线为：
化合物A
+
化合物B
生成
化合物C；
化合物C
+
化合物D
生成
化合物E；
化合物E
+
金属离子化合物
生成
化合物F
化合物F与带有组氨酸标签的蛋白简单混合15分钟得到化合物F配位结合蛋白，并将其直接使用用于体内筛选或是制备成相关制剂使用用于体内筛选。
其中化合物F与带有组氨酸标签的蛋白结合的方式见下图：
在本专利制备的终产物在体内可迅捷方便省时间地筛选在体外证明有潜在治疗作用的蛋白。
附图说明：
图1 实施例1的制备产物的核磁共振图谱。
图2 实施例2的制备产物的核磁共振图谱。
具体实施方式
下面具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明不仅局限以下实施例。
制备实施例如下：
实施例1
将化合物A（商购）500mg溶于6ml水中，与600mg碳酸氢钠以及500mg化合物B（商购）至于同一烧杯中15小时，加热70度后冷却，乙酸调节溶液PH至3，减压浓缩后，在乙醇中洗涤，结晶得化合物C，过滤乙醇再洗涤后干燥，400mg含有聚乙二醇的Y型化合物D（商购）溶解在PH7.5的磷酸缓冲液中，加入2ml甲醇，并与化合物C搅拌2小时，减压浓缩，乙醇洗涤，过滤再洗涤，真空干燥得化合物E，化合物E与2Mol的CoCl2反应得化合物F。
实施例2
将化合物A（商购）1000mg溶于6ml水中，与700mg碳酸氢钠以及1100mg化合物B（商购）至于同一烧杯中24小时，加热75度后冷却，乙酸调节溶液PH至3.3，减压浓缩后，在乙醇中洗涤，结晶得化合物C，过滤乙醇再洗涤后干燥，800mg含有聚乙二醇的Y型化合物D（商购）溶解在PH7.3的磷酸缓冲液中，加入3ml二甲基亚砜，并与化合物C搅拌2小时，减压浓缩，乙醇洗涤，过滤再洗涤，真空干燥得化合物E，化合物E与3Mol的CaCl2在少量的二氯甲烷的水溶液中应得化合物F。
效果实验如下：
举例TRAIL（TNF-related apoptosis-inducing ligand）蛋白，其制备方法参照：S. Y. Chae, T. H. Kim, K. Park, C. H. Jin, S. Son, S. Lee, Y. S. Youn, K. Kim, D. G. Jo, I. C. Kwon, X. Chen, K. C. Lee, Mol. Cancer Ther. 2010, 9, 1719-1729，用TRAIL代替体外筛选的有潜力的蛋白，用本发明的化合物去结合并比较本发明化合物在体内快捷方便筛选过程中的优势，将实施例1-2制备的样品与等摩尔量的含有组氨酸结尾的TRAIL蛋白在水溶液中简单混合15分钟。将样品分组具体为：
第一组为实施例1样品组配位TRAIL，取实施例1制备的20mgF与0.1mg/ml的TRAIL蛋白在PH7.4的磷酸缓冲液中简单混合15分钟；
第二组为实施例2样品组配位TRAIL，取实施例1制备的20mgF与0.1mg/ml的TRAIL蛋白在PH7.4的磷酸缓冲液中简单混合10分钟；
第三组为聚乙二醇共价链接组，即TRAIL-PEG，TRAIL与聚乙二醇发生共价链接(整个链接过程耗时24小时)；
第四组为聚乙二醇、金属离子与TRAIL简单混合(耗时30分钟)；
第五组为TRAIL组(裸蛋白)；
效果实验如下：
将各组样品用于治疗H22荷瘤小鼠情况进行比较。
制备H22肝癌小鼠模型，按照传统方法，将H22细胞植入小鼠腋下，制备H22核瘤小鼠模型后，分为6组，即对照组（不用药）及用药各组，
第一组为实施例1样品组配位TRAIL，取实施例1制备的20mgF与0.1mg/ml的TRAIL蛋白在PH7.4的磷酸缓冲液中简单混合15分钟而后冻干称出10mg溶水待用。
第二组为实施例2样品组配位TRAIL，取实施例1制备的20mgF与0.1mg/ml的TRAIL蛋白在PH7.4的磷酸缓冲液中简单混合10分钟而后冻干称出10mg溶水待用。
第三组为聚乙二醇共价链接组，即TRAIL-PEG，TRAIL与聚乙二醇发生共价链接(整个链接过程耗时24小时)，取出10mg溶解在水中待用。
第四组为聚乙二醇0.2mol/ml、金属离子CaCl20.2mol/ml与TRAIL0.2mol/ml在磷酸缓冲液中简单混合(耗时30分钟)，称出10mg溶水待用。
第五组为TRAIL组(裸蛋白)，称出10mg溶水待用。
将各组样品注射进瘤体内，每组注射50ul，浓度为1mg/ml，每组20只小鼠。试验2周后，处死小鼠，取瘤用卡尺测量体积，结果如下。
表1 瘤大小比较
表 1 肿瘤体积（单位：cm3 ）
| 组别 | 瘤大小 |
| 对照组 | 14.121.77 |
| 第一组 | 4.880.76** |
| 第二组 | 4.920.84** |
| 第三组 | 12.071.12* |
| 第四组 | 13.871.45 |
| 第五组 | 14.211.49 |
与对照组比较 *p<0.05，**p<0.01，
可从实验数据中看出，本发明的化合物可以在少于15分钟内，在不改变蛋白结构的条件下，非共价键结合蛋白并在体内筛选其活性，使原本不能在体内很好表现活性的蛋白表现出了非常好的活性，由此可看出，本方明的化合物和筛选方法可以不遗漏地将在体外表现出潜在治疗能力的蛋白很好地在动物体内筛选活性，为未来将此蛋白应用在人体的临床实验提供强进的实验基础，本技术同时将为未来的蛋白质药物制剂提供可能的选择。
Claims (10)
1.如下式所示的新化合物结构，其结构如下：
其中A代表金属离子，优选钙离子，镁离子，钴离子，钡离子，铂离子，镍离子，铜离子。
2.权利要求1的聚合物，其中聚合物中的聚乙二醇分子量为100-200000，m=1-5000之间的整数，优选m=1-2000之间的整数。
3.如权利要求1的化合物的制备方法，其特征在于：
1）含有氨三乙酸-赖氨酸的结构A与化合物B在碳酸氢钠溶液中反应得到化合物C；
2）化合物C与含聚乙二醇的Y型化合物D搅拌反应后得到化合物E；其中聚合物中的聚乙二醇分子量为100-200000；
3）化合物E与金属离子化合物反应得化合物F；
化合物A；
化合物B；
化合物C；
化合物D，m=1-5000之间的整数，优选m=1-2000之间的整数；
化合物E；
终产物F，A代表金属离子。
4.权利要求3的方法，其中所述化学步骤选用溶剂选自：乙酸、甲酸、苯、甲苯、吡啶、四氢呋喃、三氟乙酸、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、甲醇、乙醇、二氯甲烷、二甲基亚砜、N, N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。
5.权利要求1的化合物，最优选结构为
和
m=1-5000之间的整数，优选m=1-2000之间的整数。
6.权利要求1的化合物，所述化合物在快捷简便筛选蛋白作用上的用途。
7.权利要求6的用途，该化合物在筛选过程中结合蛋白的用时少于15分钟。
8.权利要求6的用途，该化合物采用非共价键结合蛋白。
9.权利要求1的化合物配价键结合蛋白后可制备成适于体内筛选的肌肉，静脉或是局部给药的制剂。
10.权利要求9的所述制剂，其可以是普通制剂、控释制剂、靶向制剂等。
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