CN104211817B

CN104211817B - 一种狂犬病病毒灭活蛋白疫苗、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN104211817B
Application number: CN201410469258.6A
Authority: CN
Inventors: 夏振强; 郑文文; 郑学星; 王化磊; 金宏丽
Original assignee: CHANGCHUN SR BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHANGCHUN SR BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-09-16
Filing date: 2014-09-16
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2034-09-16
Also published as: CN104211817A

Abstract

本发明提供一种新型的重组狂犬病病毒蛋白，所述重组蛋白是由融合了仿生核肽的狂犬病病毒囊膜蛋白和狂犬病病毒基质蛋白自主组装而成；所述融合了仿生核肽的狂犬病病毒囊膜蛋白是指将仿生核肽通过反向遗传技术整合到狂犬病病毒囊膜糖蛋白C端所形成的重组蛋白。本发明还提供利用杆状病毒/昆虫细胞表达***生产所述重组蛋白的方法。将所述杆状病毒/昆虫细胞表达***制备的重组狂犬病病毒蛋白灭活后，与防腐剂混合，即制备得到狂犬病病毒灭活蛋白疫苗。本发明制备的疫苗具有免疫原性好、耐热性好、安全性高、无需佐剂等优点。

Description

一种狂犬病病毒灭活蛋白疫苗、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及动物病毒学、基因工程以及动物疫苗领域，具体地说，涉及一种狂犬病病毒灭活蛋白疫苗、其制备方法及应用。

背景技术

狂犬病，民间俗称为“疯狗病”或“恐水症”，是一种极为古老的***共患传染病，该病是由狂犬病病毒(Rabies Virus，RV或RABV)感染所致，几乎所有的温血动物和人都易感，病毒侵入机体的中枢神经***，引起急性致死性脑脊髓炎，其特点是潜伏期长，一旦发病，致死率近乎100％。目前为止尚无特效的治疗药物，最为有效的办法是通过注射狂犬病疫苗进行预防。

流行病学调查的结果显示，我国人的狂犬病95％由狂犬病病犬/猫或带毒犬/猫，经抓伤、挠伤、咬伤所传染，所以控制人类狂犬病的关键是要控制住犬/猫狂犬病，综合防控，以达到消灭人间狂犬病的目的。在我国，犬/猫的饲养量大，特别是偏远农村，虽然现有狂犬疫苗能有效的保护犬猫免受狂犬病病毒的感染，但是由于疫苗价格昂贵，而且疫苗的热稳定不佳运输保存不便，导致狂犬病疫苗接种率低，因此制备耐热、价廉、高效、易接种的狂犬病疫苗是预防控制动物狂犬病的重要且可行方式。

RABV为单股不分节段负链RNA病毒，属弹状病毒科狂犬病毒属的成员。RABV粒子直径75nm，长100-300nm，结构上呈现出子弹状。RABV粒子分为外壳和核衣壳，前者为一层脂质双分子膜，是病毒复制过程中来源于宿主细胞的成分。糖蛋白(G)镶嵌于其中，形成穗状的突起，与宿主细胞受体作用，是病毒刺激机体产生中和抗体的唯一结构蛋白。基质蛋白(M)，属连接蛋白，在核衣壳和包膜间起连接作用，连接内外两部分。核衣壳是由一条核糖核酸及包裹其外的核蛋白(N)构成，N蛋白和基因组RNA构成复合物，使基因组免遭核酸酶降解，保证RNA完整性。L蛋白同P蛋白协同行使RNA依赖的RNA聚合酶功能。N、P、L蛋白同RNA互相作用构成核糖核蛋白(RNP)复合物，是基因复制和转录模板。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的耐热重组狂犬病病毒蛋白疫苗、其制备方法及应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种重组狂犬病病毒蛋白，所述重组蛋白是由融合了仿生核肽的狂犬病病毒囊膜蛋白与狂犬病病毒基质蛋白组成；所述重组了仿生核肽的狂犬病病毒囊膜蛋白是指将仿生核肽通过反向遗传技术整合到狂犬病病毒囊膜糖蛋白上所形成的重组蛋白。

其中，所述重组了仿生核肽的狂犬病病毒囊膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；所述狂犬病病毒基质蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供上述重组狂犬病病毒蛋白的制备方法，其是利用杆状病毒/昆虫细胞表达***来生产所述重组蛋白：将狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核肽的融合基因，狂犬病病毒基质蛋白基因分别按昆虫细胞偏爱密码子进行优化，将优化后的基因序列一起克隆到具有多个启动子与表达盒(例如双启动子与双表达盒)的转移表达载体中，并位于不同启动子下游，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒，用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞拯救获得重组杆状病毒(例如，待昆虫细胞的细胞汇合度达到80％以上时进行转染)，将获得的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养后收获上清，即得到狂犬病病毒重组蛋白颗粒。

其中，优化后的狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核肽的融合基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示，优化后的狂犬病病毒基质蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

所述转移表达载体选自AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac toPac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII(pETL)、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX 1.1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIVVI-、pVL1391、pVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBacDual、pFastBac1、pFastBacHT A、pFastBacHT B、pFastBacHT C、pFastBacDual或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体中的至少一种。

优选地，所述转移表达载体为pFastBacDual，优化后的狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核肽的融合基因位于P₁₀启动子下游，优化后的狂犬病病毒基质蛋白基因位于P_H启动子下游，形成两个高效表达盒。

所述昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf21、Sf9、Mimic Sf9细胞系、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)Se 301细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG1细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4细胞系、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)H5细胞系、BTI-Tn-5C1细胞系、BTI-Tn-5F2细胞系、斜纹贪夜蛾(Spodoptera litura)ZSU-S1-1细胞系、IBL-SL1A细胞系和家蚕卵巢细胞系BmN等中的至少一种。

优选地，用Sf9细胞进行重组杆状病毒的拯救和滴定，用H5昆虫细胞进行重组蛋白颗粒的表达。

前述制备方法中，将获得的重组杆状病毒按MOI＝0.1接种昆虫细胞，4-5天后收获上清，即得狂犬病病毒重组蛋白颗粒。

本发明还提供所述重组狂犬病病毒蛋白在制备狂犬病病毒灭活蛋白疫苗中的应用。将所述重组蛋白辅以灭活剂、防腐剂制备狂犬病病毒灭活蛋白疫苗。所述灭活剂为二乙烯亚胺，终浓度为0.025％，所述防腐剂为叠氮钠，终浓度为0.01％。

本发明进一步提供由所述重组狂犬病病毒蛋白制备的狂犬病病毒灭活蛋白疫苗，所述疫苗为肌肉注射疫苗或口服疫苗。

本发明提出了一种能改善疫苗热稳定性和活疫苗免疫原性的组合设计方法，将仿生核肽(biomimetic nucleating peptides)通过反向遗传学技术整合到狂犬病病毒囊膜糖蛋白上，这样就能在生理条件下将磷酸钙矿化引入到疫苗表面，获得一个矿化表壳。这种方法能利用疫苗自我生物矿化(self-biomineralization)作用，提高其稳定性和免疫原性。

这种自我生生物矿化工程蛋白复合体具有独特的结构，病毒学和化学性质。与许多矿化物质相似，这种矿化外壳令封闭的疫苗产生了一些新特性，例如，自我矿化疫苗能储存在26℃下超过9天，在37℃下保存约1周的时间，依然能有效地产生抗体的作用，这也就减少了对于冷冻环境的依赖。

制备包括囊膜糖蛋白作为外壳，基质蛋白作为内壳的蛋白复合物，去掉免疫抑制P蛋白，既保有了保护性抗原，又具备一定的空间形态。嵌合的仿生核肽能够自动吸附培养基中的钙离子(生物矿化)，克服了通常纯化的蛋白并没有免疫原性，或免疫原性较弱，需要强大的佐剂来诱导免疫应答反应。此外，一些外源性抗原无法到达APCs的细胞质，因此不能够刺激CTL免疫应答反应。本发明制备的重组狂犬病病毒蛋白具有高的免疫原性，注射免疫不需要任何佐剂。

本发明提供的嵌合狂犬病病毒蛋白，是通过将空衣壳技术与生物矿化相结合从而获得的新型耐热重组狂犬病病毒蛋白，这将有助于减少目前疫苗生产过程中的成本，尤其适用于缺乏昂贵的制冷基础设施的发展中国家。

本发明基于杆状病毒/昆虫细胞表达***，在昆虫细胞生物反应器中安全、高效地生产狂犬病病毒重组蛋白颗粒，并且在培养过程中狂犬病病毒重组蛋白颗粒能自动包裹一层钙离子，使得该复合物的耐热性和免疫原性显著优于传统的狂犬病病毒抗原。本发明方法制备的狂犬病病毒重组蛋白颗粒，表达量高、耐热性好、无需佐剂、免疫原性好、易发酵，且制备方法成本低。

附图说明

图1为本发明高效表达转移载体构建模式图。

图2为本发明重组杆状病毒基因组的PCR鉴定结果；其中，1.阴性对照，2和3.GBP目的带，4和5.M目的带，M为DNA分子量标准。

图3为本发明重组杆状病毒Bacmid杆粒转染昆虫细胞后的细胞病变情况。

图4为本发明重组杆状病毒感染昆虫细胞后间接免疫荧光检测结果。

图5为本发明包含仿生核肽的重组狂犬病病毒蛋白Western Blot检测结果。

图6为本发明重组蛋白的电镜检测结果。

图7为本发明重组蛋白的降解情况；其中，A.25℃条件，B.37℃条件。

图8为本发明包含仿生核肽的狂犬病病毒重组蛋白颗粒体外刺激小鼠脾细胞，细胞因子检测结果。

图9为本发明包含仿生核肽的重组狂犬病病毒蛋白疫苗免疫小鼠后中和抗体水平。

图10为本发明包含仿生核肽的重组狂犬病病毒蛋白疫苗免疫小鼠后，攻毒保护实验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的试验材料：

大肠杆菌株E.coli DH5α购自Promega公司；克隆载体pEASY-T3购自全式金公司；克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司；原核表达载体pET-28a+、受体菌E.coli TOP10和BL21(DE3)购自长春西诺生物科技有限公司，运载载体pFastBacDual购自Invitrogen公司；狂犬病病毒HuNPB3株、SR9株，Sf9和H5昆虫细胞、N2A细胞、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒亲本株AcMNPV由长春西诺生物科技有限公司保存。

酶与试剂：限制性内切酶和配套的缓冲液均购自Promega公司；T4 DNA Ligase及缓冲液为Promega公司产品；LA Taq聚合酶及缓冲液购自TaKaRa公司；RnaseA、dNTPs购自Sigma公司；各种规格的DNA和蛋白质分子量标准为TranGen Biotech公司产品；DEPC、M-MLV-Rtase(逆转录酶)购自Promega公司。

生化试剂：bisacrylamide、acrylamide、IPTG、X-Gal购自Promega公司；Tris、Ampicillin、Kanamycin、IPTG、SDS、尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED(N,N,N',N'-Tetramethylethylene diamine)、过硫酸铵(Ammonium Persulfate)、卡那霉素(Kanamycin)、细胞培养基TC-100购自Sigma公司；琼脂糖为Sunbiotech公司产品；酵母抽提物(Yeast Extract)、胰蛋白胨均购自英国OXOID公司；溴化乙锭(EB)、考马斯亮兰R-250购自Fluka公司；琼脂粉为日本进口分装；Proteinase K、胎牛血清购自Invitrogen公司；其它均为国产或进口分析纯试剂。引物由上海生工生物技术有限责任公司合成。

试剂盒：IFN-γ、IL-2和IL-4细胞因子检测试剂盒购自R&DSYSTEMS公司；狂犬病病毒糖蛋白定量试剂盒购自DRG公司。

培养基：大肠杆菌培养基为LB培养基；昆虫细胞培养基为Grace培养基。

实验动物：6-8周龄雌性BALB/C小鼠购自长春生物制品研究所；中华田园犬(6-8月龄，抗狂犬病病毒中和抗体滴度小于0.5IU)购自长春生物制品研究所。

狂犬病病毒灭活蛋白疫苗的动物实验在国家规定的隔离实验室中进行。

实施例1 耐热狂犬病病毒蛋白灭活疫苗、制备方法、小鼠免疫及攻毒保护试验

1实验方法

1.1有关溶液和培养基的配制

溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA。

溶液II：0.2mol/L NaOH，1％SDS(现用现配)。

溶液III：100mL体系，5mol/L醋酸钾80mL，冰乙酸12mL，ddH₂O 8mL。

TAE(50×)：242g Tris碱，57.1mL冰乙酸，100mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，无菌水定容至1000mL。

TER溶液：胰RNAse(RNAse A)溶解于10mM Tris-HCl、15mMNaCl中，配成10mg/mL的储存液-20℃冻存，用1×TE缓冲液稀释成20μg/mL的工作液4℃保存。

PPt缓冲液：异丙醇22mL；5mol/mL KAc 1mL；ddH₂O 2mL。

1×TE缓冲液：10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)，121℃高温高压蒸汽灭菌20min后储存于4℃。

溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配成浓度为10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器储存于室温即可。

6 mol/L NaI：将0.75g Na₂SO₃溶于40mL ddH₂O中，加入45g NaI并搅拌至完全溶解，4℃储存。

玻璃奶(Glassmilk)：将10g(100mg/mL，Sigma S-5631)的Silica溶于100mL PBS中，沉淀2h，弃上清，重复该步骤2～3次；2000g离心2min，将沉淀物溶于3mol/L的NaI中，终浓度为100mg/mL，4℃下避光保存。

New Wash洗液：Tris-HCl(pH 7.4)20mmol/L；EDTA 1mmol/L；NaCl 100mmol/L；与等体积的无水乙醇配制而成。

蛋白表达诱导物IPTG为1 mol/L，超纯水配制后用0.2 mm滤器过滤除菌。

蛋白上样缓冲液(2×)：100mmol/L Tris-HCl(pH6.8)、200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、4％SDS、0.2％溴酚蓝、10％甘油。

30％丙烯酰胺溶液：29g丙烯酰胺，1g N,N′-亚甲叉丙烯酰胺，溶于100mL水，过滤。

考马斯亮蓝染液：0.24g考马斯亮蓝R250溶于90mL甲醇:水(1:1,v/v)和10mL冰乙酸中。

脱色液：90mL甲醇:水(1:1,v/v)和10mL冰乙酸。

裂解缓冲液(pH8.0)：50mmol/L Tris-Base、0.1M NaCl。

包涵体洗涤液Ⅰ(pH8.0)：20mmol/L Tris-Base、0.2M NaCl、1％TritonX-100。

包涵体洗涤液Ⅱ(pH8.0)：20mmol/L Tris-Base、0.2M NaCl、2M尿素。

包涵体蛋白溶解液(pH8.0)：20mmol/L Tris-Base、0.2M NaCl、8M尿素。

脲NTA-0缓冲液：20mM Tris-HCl pH7.9，0.5 M NaCl，10％Glycerol，8M Urea。脲NTA-500缓冲液：20mM Tris-HCl pH7.9，0.5MNaCl，10％Glycerol，8M Urea，0.5MImidazole。

Bradford试剂为Bio-Rad公司Protein Assay Dye-Reagent Concentrate。

ELISA所需试剂：包被液(pH9.6)1.59g Na₂CO₃、2.93g NaHCO₃、ddH₂O定容至1L，保存于4℃；临用前配制封闭液，BSA溶于PBS中至终浓度为1％；洗涤液为含0.05％Tween-20的PBS；底物缓冲液为1.84g Na₂PO₄·12H₂O、0.51g柠檬酸、ddH₂O定容至100mL；OPD显色液是4mg OPD溶于10 mL底物缓冲液，加15μL 30％H₂O₂，临用前配制；终止液为2 mol/L H₂SO₄。

Western Blot试剂：半干转电转膜缓冲液是14.41g甘氨酸、12.11gTris-Base、50mL甲醇、ddH₂O定容至1 L、4℃保存；1×PBS加Tween-20至终浓度为0.1％配成洗涤液；BSA溶于PBS中至终浓度为3％为封闭液；纯化的多克隆抗体用封闭液按1:1000稀释；HRP标记的羊抗兔IgG抗体用封闭液按1:1000稀释；临用前配制DAB显色液，4mg DAB溶于10 mL 100mmol/L pH7.5的Tris-Cl中，加15μL 30％H₂O₂。

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调整pH值7.0(固体培养基含1.5％琼脂)。液体培养基中加入1.5％琼脂粉，121℃高温高压蒸汽灭菌15 min，在温度低于45℃且还未凝固时，加入相应抗生素溶液，混匀后倒入平板，为LB固体培养基，4℃保存备用。

1.2狂犬病病毒糖蛋白和基质蛋白基因原始序列的获得

1.2.1狂犬病病毒SRV9株

狂犬病病毒SRV9株由中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所提供。

1.2.2 TRIzol法提取基因组RNA

(1)将狂犬病病毒放入盛有Trizol(50-100mg组织/1mL)的玻璃匀浆器中混匀，液体体积不要超过Trizol体积的10％；

(2)将匀浆液在室温下放置5min以使核蛋白质复合体完全裂解；

(3)加入氯仿(0.2mL/1ml Trizol)，盖紧管盖并漩涡剧烈震荡15sec；室温放置2-15 min；

(4)4℃，12000g离心15min。离心后，混合液被分为三相：处于下层的浅红色酚-氯仿有机相、中间相和上层无色水相。RNA存留在水相中，而DNA和蛋白质则存留于间相和有机相中，水相体积约为用于匀浆的Trizol体积的60％；

(5)将水相移入新管，加异丙醇(0.5mL/1mLTrizol)；室温放置5-10min；

(6)4-25℃，12000g离心8min，RNA沉淀在管壁或管底形成胶状的或白色的小球；

(7)弃上清，用1mL 75％乙醇清洗RNA沉淀；然后4-25℃，7500g离心5min；

(8)弃上清，干燥；沉淀重溶于20μL DEPC处理的双蒸水(ddH₂O)或去离子甲酰胺中，-70℃保存备用。若沉淀难溶，可用吸管吹打数次并55-60℃温育10-15min。

1.2.3目的基因的扩增

引物的设计：根据GenBank公布的序列AF499686，设计狂犬病病毒G基因和M基因原始序列的扩增引物为：

SRV9G上游：5'-AGGATCCAACATGGAGGGCAAAGCCCGCACAG-3'(BamHI)

SRV9G下游：5'-GAGAATTCTCAGACATAAGAAAAGCCATTG-3'(EcoR I)

SRV9M上游：5'-TTTCTCGAGATGAACTTCCTGCGCAAGATCG-3'(XhoI)

SRV9M下游：5'-TTTGCTAGCTTATTCCAGCAGCAGGGAGGAG-3'(NheI)

1.2.4 RT-PCR反应

1.2.4.1 cDNA第一链的合成

取2μLRNA(≤1μg)+2μL RHDV-RT+13.75μL DEPC处理水；70℃，5min，迅速置冰上5min；加入5μL 5×M-MLV缓冲液+1.25μL10mM dNTPs+1μL M-MLV-RT(200U)，使终体积为25μL；混匀后室温放置10min；42℃反应1h；70℃2min灭活RTase，-20℃保存备用。

1.2.4.2 PCR扩增目的基因

反应体系及反应程序见表1。

表1 反应体系及反应程序

PCR扩增结束后，取5.0μL反应产物用1.0％的TAE琼脂糖凝胶电泳，凝胶中含有0.5μg/mL溴化乙锭，电泳缓冲液为1×TAE，80-100V，大约10-20min于紫外凝胶成像***观察片段大小。

1.2.5玻璃奶纯化回收DNA片段

配制专门回收用胶(制胶器洗干净)，PCR产物或酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的DNA条带；加入3倍体积的6mol/L NaI，50℃下使凝胶充分溶解；冰上放置2min后加入8μL玻璃奶吸附DNA，混匀后室温放置5min，期间摇晃两下，使充分吸附；稍离心(10000 r/min，达到刻度即可，否则不易悬浮)，去上清；加800μL New Wash溶液(于冰上操作)，轻微震荡使沉淀重悬，再稍离心去上清，如此洗涤3次，最后一次洗涤完毕后，离心10000r/min，3min去上清；洗后在吸水纸上吸去多余水分后稍离心，放入培养箱干燥(半干即可)；干燥后用后用适量0.1×TE(10-50μL)将沉淀溶解，震荡弹起。12000 r/min离心2 min后取上清，即得到DNA溶液。将DNA保存于-20℃备用。凝胶电泳检测回收效果。

1.2.6 DNA片段与克隆载体连接

克隆载体pMD18-T连接体系：0.5μL pMD18-T载体，2.5μL目的片段，3μL连接溶液Ⅰ，16℃连接8h以上。

1.2.7 E.coli热激感受态细胞的小量制备：-70℃冻藏的E.coli TOP10或BL21甘油菌在LB平板上划线复苏；挑取单菌落，接种到4mL不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；取1/100体积的新鲜的E.coli TOP10培养过夜的菌液接种到新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h，使OD值达到0.6左右；同时将CaCl2(75mmol/L)与EP管置于冰上预冷5min以上；将1mL菌液收集到预冷好的无菌1.5mL EP管中，冰上预冷5min，4℃，4000r/min离心5min，弃上清；菌体重悬于800uL预冷的75mmol/L CaCl2溶液中，冰浴30min，每隔5min摇一摇；4℃，4000r/min离心5min，弃上清；沉淀中加入200μL含10％甘油的预冷75mmol/L CaCl2溶液，用枪头轻轻将菌体吹起，使混合均匀；冰上放3-4h后分装小管(100μL/管)，-70℃冻存备用。

1.2.8连接产物的热转化：取-70℃冻存的感受态细胞，解冻后迅速置于冰上；感受态细胞完全融化后加入连接产物5μL，轻轻混匀，冰浴30 min；42℃热激90 s，迅速置于冰上1-2min；加入1mL已温浴至37℃的LB培养基，37℃温育培养1h；5000r/min离心3min，去部分上清后(留150-200μL)涂布于含适当抗生素的LB平板上；37℃倒置培养过夜。

1.2.9重组质粒的鉴定

1.2.9.1细胞破碎法快速鉴定：分别挑取多个单菌落转化子接种于4mL含80μg/mLAmp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；取300-500μL菌液于Eppendorf管中，12,000g离心10sec，弃上清，加入30μL缓冲液(6％蔗糖，0.1％溴酚蓝)，再加入20μL酚/氯仿(1:1)，充分振荡将菌体弹起；12,000g离心5min，取上清上样电泳，观察结果。

1.2.9.2碱法少量快速抽提质粒DNA

取上面快速鉴定后，显示一定差别的质粒对应的菌液1.5mL于Eppendorf管内，5,000g离心5min收集菌体，弃上清；用150μL溶液Ⅰ悬浮沉淀，冰上放置5min；加300μL溶液Ⅱ和50μL氯仿，轻轻倒转混匀后冰浴5min；加450μL溶液Ⅲ，剧烈混匀后冰浴5-10min；4℃12,000g离心10min，取上清，加500μL异丙醇，混匀后于-20℃放置20min；12,000g离心10min，弃上清，沉淀溶于250μL TER(含20μg/mLRNaseA的TE)中，37℃消化20min；加入350μL PPt缓冲液，混匀后置4℃20min；12,000g离心10min，弃上清，70％乙醇洗一次，真空干燥沉淀，用40μL 0.1×TE(pH8.0)溶解，-20℃保存备用。

1.2.9.3重组质粒的酶切鉴定

鉴定体系见表2。

表2 鉴定体系

10×缓冲液D 1.5μL	重组质粒 2.0μL
		EcoRI/BamHI,XhoI/NheI 各0.5μL	ddH₂O 10.5μL

37℃酶切1-2h后，琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

1.2.9.4重组质粒的测序鉴定以及分析

将鉴定为阳性克隆(命名为pT-SRV9G和pT-SRV9M)的菌种重新加入含有Amp的LB培养液，220r/min摇培过夜后后，吸取1mL新鲜菌液至无菌的Eppendorf管中，加入少量甘油，以封口膜封好后，送至北京三博生物技术有限公司进行测序。测序结果用DNAStar、DNAMAN软件对序列进行分析。

1.3仿生核肽与狂犬病病毒糖蛋白融合基因和基质蛋白基因的优化与合成

根据昆虫细胞密码子偏好性对1.2中测得的仿生核肽(BG)序列融合至狂犬病病毒糖蛋白(SRV9G)N端形成融合基因，并将其与基质蛋白基因(SRV9M)序列进行优化，不改变氨基酸序列，优化后的序列命名为GBP和M(如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示)，原始序列中含有串联的稀有密码子，这减少了翻译序列或者甚至解除翻译装置，优化的序列CAI值由0.72提高为0.79，调整了GC含量及不宜峰以延长mRNA的半衰期，GC含量由54.9％调整为53.34％，那些影响mRNA稳定性及其与核糖体结合的茎环结构被破坏，优化后的序列无此两个酶切位点。直接合成优化后的序列SRV9G和SRV9M并克隆到载体pUC57上，两端分别带有EcoRI/BamHI或XhoI/NheI酶切位点。

1.4含狂犬病病毒糖蛋白和基质蛋白基因重组转移质粒的构建(图1)

1.4.1目的片段及载体的获得

测序鉴定过的重组质粒pUC57-GBP和载体质粒pFastBacDual用EcoRI/BamHI双酶切。酶切体系见表3。

表3 酶切体系

总体积	重组质粒	EcoR I/BamH I	缓冲液H	BSA(100x)	补水
						50μL	5μL	各1μL	5μL	0.5μL	38.5μL

37℃反应2小时，结束后于65℃灭活10分钟。

1.4.2酶切产物的回收

将pUC57-GBP经EcoR I/BamH I双酶切的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收约1.7kb大小的片段。在紫外灯下用灭菌手术刀切取含相应DNA片段的凝胶，然后用Geneclean试剂盒进行纯化。方法如下：切取凝胶片段并称重，将其放入灭菌的1.5mL离心管中，加入3倍体积的6M NaI，37℃将凝胶溶解后，加入10μL玻璃奶(Glass milk)，混匀后室温下放置5分钟，使DNA充分吸附在玻璃奶上，12000rpm离心5秒钟，再用New Wash溶液洗三次，每次均将沉淀弹起，并离心。最后将沉淀晾干后加入20μL 0.1×TE缓冲液溶解DNA，离心后去沉淀，取上清作进行下一步实验。pFastBacDual载体酶切回收方法同上。

1.4.3目的片段与双表达载体pFastBacDual连接

酶切回收的GBP片段与经EcoR I/BamH I双酶切酶切后的转移载体pFastBacDual的连接。用T4 DNA连接酶进行连接连接(16℃过夜)。连接体系见表4。

表4 连接体系

总体积	GBP	pFastBacDual	T4 DNA连接酶	缓冲液
					10μL	6μL	2μL	1μL	1μL

1.4.4重组质粒的转化与鉴定

参照1.2中的方法将连接产物转化感受态细胞，在含氨苄青霉素抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒。重组质粒经EcoR I/BamH I双酶切、菌液PCR鉴定和基因测序，鉴定正确的重组质粒命名为pFastBacDual-GBP。

1.4.5重组转移载体pFastBacDua-GBP-M的构建与鉴定

将pUC57-M和pFastBacDua-GBP载体经Sph I/Xho I双酶切后，连接，方法如上述，命名为pFastBacDua-GBP-M载体。

1.5重组杆状病毒Bacmid构建和鉴定

将重组供体质粒pFastBacDua-GBP-M转化感受态E.coli DH10Bac：将1μl重组转移质粒加入到感受态E.coli DH10 Bac中，冰浴30min，42℃热激45s，迅速转移至冰水混合物中冰浴2-3min，加入1mlLB培养基，37℃、200rpm孵育4h，进行10^-1、10^-2、10^-3连续稀释，从10^-2、10^-3稀释液中各取100μl涂板培养物涂LB琼脂平板(包含终浓度50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素、100μg/ml X-gal、40μg/ml IPTG)，37℃恒温培养箱培养48h，进行蓝白班筛选，挑取白色独立的菌落进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行扩大培养，利用碱裂解法提取重组杆状病毒Bacmid。

1.6重组杆状病毒AcMNPV-GBP-M的拯救

提取重组Bacmid，转染昆虫细胞：⑴1μg重组Bacmid DNA加入100μl双无(无血清、无双抗)TC-100培养液中；⑵将6μl脂质体加入到100μl双无(无血清、无双抗)TC-100培养液中混匀；⑶将⑴和⑵溶液混合，室温放置15-45min；⑷将昆虫细胞(覆盖70-80％面积)用双无培养液系三次，脂质体和DNA混合物再加入800μl双无TC-100培养液，混合，加入Sf9细胞中，27℃，静置5h；⑸去除脂质体、DNA复合物液体，加入2ml完全(含有双抗、血清)TC-100培养液继续培养3-4d，观察细胞状态，与正常细胞相比，转染孔细胞均出现较为明显的细胞病变，细胞肿胀、变大变圆，继而出现形态不规则，细胞脱落，表明转染后成功获得重组杆状病毒(图3)。重组病毒命名为AcMNPV-GBP-M。

1.7重组杆状病毒的基因水平鉴定

利用PCR方法分析外源基因。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μl，加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μl(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。为鉴定双拷贝的VP60基因均整合正确，寡核苷酸引物为：

GBPS-5’-GGATTATTCATACCGTCCCACCA-3’

GBPX-5’-AACCTCTACAAATGTGGTATGGCTG-3’

MS-5’-CTTCCGGTATTGTCTCCTTCC-3’

MX-5’-CGGACCTTTAATTCAACCCAA-3’

取上述病毒基因组DNA 1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸5min。取15μl反应产物电泳分析，目的条带分别为2000bp和1000bp，结果证明双表达载体整合正确(图2)。

1.8重组病毒的蛋白IF及Western Blot检测

IF鉴定蛋白表达。将重组杆状病毒AcMNPV-GBP-M感染昆虫sf9细胞，72h后以80％预冷丙酮固定2h左右。PBST洗涤3次，加入150μl300倍稀释的针对G蛋白的单克隆抗体(购自PL Laboratories，PL0500130R)或M蛋白的多克隆抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，加入150μl含有0.02％的伊文斯蓝的荧光二抗(1:100倍稀释，Sigma)，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，荧光显微镜观察并记录结果(图4)。

Western Blot鉴定蛋白表达。重组病毒感染昆虫细胞后72小时(图3)，弃去上清，加入RAPIA溶液进行裂解，SDS-PAGE电泳，然后进行考马斯亮蓝染色或Western Blot染色。结果表明在重组病毒感染的昆虫细胞和上清液中可检测到60kDa/25kDa大小的特异性条带(图5)。

1.9电镜观察

重组蛋白收集与纯化后的样品用PBS稀释10倍，放上铜网，滤纸片吸干液体后用ddH₂O滴洗后再用滤纸片吸干，将铜网置于醋酸铀液滴上，滤纸片吸干液体后放入新的醋酸铀液滴上，重复3次后电镜观察(图6)，可观察到嵌合重组蛋白颗粒，大小与SRV9株大小相符，表明狂犬病病毒GBP重组蛋白和M蛋白能自主在昆虫细胞内组装成重组蛋白颗粒。并能包裹一层磷酸钙。

1.10重组蛋白颗粒降解实验

将重组蛋白颗粒的PBS溶液存放于25℃和37℃金属浴中，分别于1天、2天、3天、5天、9天或14天后取出。将疫苗液梯度稀释，进行抗原含量测定。疫苗液的抗原损失＝-Ln(疫苗液热处理后的含量/疫苗液热处理前的含量)。实验结果表明钙化的重组蛋白颗粒能有效延长保存时间(图7)。

1.11小鼠免疫及攻毒保护试验

1.11.1小鼠免疫试验。分别以终浓度0.025％的BEI(二乙烯亚胺)和0.01％的叠氮钠灭活的SRV9病毒和重组蛋白颗粒作为免疫原，将雌性BALB/C小鼠(16g/只左右)随机分为5组，每组10只，其中A和B组进行肌肉注射免疫，10μg/只，一免后14天进行一次加强免疫，C和D组进行口服免疫，20μg/只，一免后7天和14天各进行一次加强免疫，E组为正常对照组。

1.11.2细胞因子检测。免疫后14天，无菌取脾脏，使用含10％胎牛血清的改良型1640培养基研磨脾脏，按1×10⁶脾细胞密度铺96孔板，超离纯化后的病毒样颗粒刺激脾细胞，37℃培养48h后，取培养上清进行IFN-γ、IL-2和IL-4细胞因子的检测。

结果显示，与对照组相比，肌肉注射组与口服组小鼠脾细胞在收到病毒样颗粒刺激后，细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4的分泌水平明显升高，且无论是肌注还是口服重组蛋白颗粒组的细胞因子分水平要高于SRV9组(图8)，该结果表明，包含有仿生核肽的嵌合重组蛋白颗粒免疫小鼠后，能同时诱导机体的体液免疫和细胞免疫。

1.11.3中和抗体检测。加强免疫后14天对免疫小鼠进行眼球静脉丛采血，血样于37℃温箱静止1h，然后10000rpm离心5min，小心吸取血清，56℃灭活血清30min，利用FAVN法检测免疫小鼠的血清内抗RABV中和抗体水平。

结果显示(图9)，对照组小鼠体内抗狂犬病病毒中和抗体滴度为0，无论是肌注还是口服重组蛋白颗粒组抗体效价明显高于SRV9灭活组，该结果表明包含有仿生核肽的嵌合重组蛋白颗粒通过肌肉注射和口服免疫可诱导机体产生较高水平的中和抗体滴度。

1.11.4攻毒保护试验。加强免疫后28天对实验小鼠进行攻毒，前肢肌肉注射100LD₅₀的RABV街毒株HuNPB3，连续观察21天，记录发病及死亡情况。

结果显示(图10)，对照组小鼠在攻毒后第5天开始陆续出现狂犬病的临床症状第6天出现死亡小鼠，第8天小鼠全部死亡，死亡率为100％；口服组在攻毒后第14天，个别小鼠出现临床症状，第15天出现死亡病例，嵌合重组蛋白颗粒保护率为70％，灭活SRV9组保护率为20％；肌注组在攻毒后第14天，个别小鼠出现临床症状，第15天出现死亡病例，嵌合重组蛋白颗粒保护率为90％，灭活SRV9组保护率为70％。结果表明包含有仿生核肽的嵌合重组蛋白颗粒诱导机体产生的中和抗体能够抵抗致死性RABV的攻击，而且无需佐剂，可作为一种疫苗应用于抗RABV的预防性免疫。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.重组狂犬病病毒蛋白复合物的制备方法，其特征在于，其是利用杆状病毒/昆虫细胞表达***来生产所述重组狂犬病病毒蛋白复合物：将狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核肽的融合基因，狂犬病病毒基质蛋白基因分别按昆虫细胞偏爱密码子进行优化，将优化后的基因序列一起克隆到具有多个启动子与表达盒的转移表达载体中，并位于不同启动子下游，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒，用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞拯救获得重组杆状病毒，将获得的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养后收获上清，即得到重组狂犬病病毒蛋白复合物；

其中，优化后的狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核肽的融合基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，优化后的狂犬病病毒基质蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转移表达载体选自AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX 1.1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBacDual、pFastBac1、pFastBacHT A、pFastBacHT B、pFastBacHT C、pFastBacDual或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转移表达载体为pFastBacDual，优化后的狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核肽的融合基因位于P₁₀启动子下游，优化后的狂犬病病毒基质蛋白基因位于P_H启动子下游。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf21、Sf9、Mimic Sf9细胞系、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)Se301细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG1细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4细胞系、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)H5细胞系、BTI-Tn-5C1细胞系、BTI-Tn-5F2细胞系、斜纹贪夜蛾(Spodoptera litura)ZSU-S1-1细胞系、IBL-SL1A细胞系和家蚕卵巢细胞系BmN中的至少一种。