CN104198634A - 四神片指纹图谱的建立方法 - Google Patents

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王学东
姜峰
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Abstract

四神片制剂指纹图谱的建立方法，包括制备成每ml含补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲10-100mg的对照品溶液和采用四神片去包衣后称取0.1-10g，用甲醇超声提取。过滤后得到的供试品溶液。然后精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪中，按照液相色谱法测定，得指纹图谱。色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相由乙腈和水组成的梯度洗脱液，检测波长220-360nm，柱温20-50℃，流速0.5-1.5ml/min，时间30-90min。本发明方法简单、稳定、精度高、重现性好，能快速而准确地鉴别产品的真伪优劣。

Description

四神片指纹图谱的建立方法
技术领域
本发明涉及四神片的质量控制方法，具体涉及四神片高效液相指纹图谱的构建方法和指纹图谱，属于中医药学技术领域。
背景技术
中药指纹图谱是指运用现代分析技术，对中药化学信息以图形的方式进行表征并加以描述，是某种或某几种中药材中所共有的，具有特征性的某几类成分的色谱或光谱的图谱。当前，中药指纹图谱质量控制技术作为控制中药质量稳定性和均一性的检测手段，是中药现代化的关键技术之一，这对有效地控制中药的质量有重要意义。色谱指纹图谱质量控制技术是当前中药质量研究的亮点。对于成分复杂的中药，过去那种单一有效成分作为质量控制指标的做法是不全面的，而色谱指纹图谱控制模式则以色谱分析为手段，从中获取反应中药内在质量的信息，通过对指纹特征的分析比较，评价中药内在质量的真实性、一致性和稳定性，这是现阶段综合评价中药质量的最优技术。据报道，日本汉方药主要生产企业于20世纪80年代就已经在企业内部采用液相指纹图谱控制质量，美国、德国、法国等国家也对植物草药采用指纹图谱质量控制技术。随着中医中药的推广应用，人们发现，作为中医理论的时间产物，中药尤其是复方中药，其中所含的任一种成分都不能代表其整体疗效。人们逐渐认识到，现行的参照西药质量控制模式的质量标准不能恰当的反应中药内在的质量，指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已为国际所共识。
四神片由肉豆蔻（制）、吴茱萸、补骨脂、五味子、干姜、大枣等六味药组成，具有助肾散寒，止泻消胀的功效。临床用于治疗肾虚受寒，肠鸣肚胀，五更溏泻，食物不化，久泻不止，面黄体弱。 
目前，国家和企业对四神片的质量控制是采用薄层色谱法对吴茱萸、五味子中的五味子醇甲和补骨脂中的补骨脂素、异补骨脂素进行鉴别。訾慧、方晓明等,在“中国中药杂志”2006，第6期采用HPLC法测定四神片中补骨脂素和异补骨脂素的含量；庆俊等在“吉林医药学院学报”2008,29（6）中采用RP-HPLC法测定四神片中补骨脂素和异补骨脂素的含量。
以上均是对个别成分进行的鉴别或含量测定，无法全面表征四神片的化学特征，指纹图谱作为中草药及成方制剂的质量控制方法，能够从整体上更为有效地表征中药的质量。目前，有关四神片的指纹图谱方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的，是提供一种四神片制剂指纹图谱的构建方法。即为四神片的质量控制和真伪鉴别提供一种新的方法，并由此方法得到四神片的标准指纹图谱。
本发明建立的指纹图谱方法具有良好的精密度、重复性和稳定性，能够用于四神片的质量控制。通过此方法可以保证四神片的质量稳定性、一致性和可控性，从而确保四神片的安全性和有效性。
本发明中所述的四神片由肉豆蔻189g，吴茱萸94g，补骨脂377g，五味子189g，干姜94g，大枣189g制备而成。具体制备方法为：以上六味，大枣加水煎煮二次，每次加水8倍量，煎煮1小时，合并煎液，减压浓缩成稠膏；肉豆蔻、吴茱萸、补骨脂、五味子粉碎成最粗粉，用60%乙醇作溶剂，进行渗漉。干姜药材粉碎成最粗粉，用乙醇作溶剂，进行渗漉。合并乙醇渗漉液，回收乙醇，减压浓缩成稠膏。水、醇稠膏合并，加入辅料适量，混匀，减压干燥，粉碎，加入适量辅料，按照常规方法制成相应的四神片制剂。
因此本发明的第一个目的是提供一种四神片HPLC指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：分别精密称取补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲对照品适量，用甲醇配制成每ml含补骨脂素、异补骨脂素和五味子醇甲10-100μg的溶液，即得对照品溶剂，备用。
（2）供试品溶液的制备：四神片去包衣后精密称取0.1～10g，用甲醇超声提取10～60min，提取液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
（3）采用液相色谱法测定指纹图谱：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
（4）采用液相色谱法测定指纹图谱的色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相由流动相A和流动相B组成的梯度洗脱液，流动相A为乙腈，流动相B为水；检测波长220nm～360nm；柱温20～50℃；流速0.5～1.5mL/min；时间30～90min。
上述步骤（2）供试品溶液的制备是：四神片去包衣后精密称取0.1-10g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10-100ml，密塞，称定重量，浸泡，超声处理后，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
上述步骤（3）测定指纹图谱是：精密吸取供试品溶液5～25μl注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
上述步骤（4）所述色谱条件是：流动相为水与乙腈组成的梯度洗脱液，水95-20%：乙腈5-80%，柱温35℃，检测波长为246nm，流速为1.0ml/min，分析时间为70min。
上述步骤（1）所述对照品溶液的制备是：精密称取补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲对照品适量至于容量瓶，用甲醇稀释至刻度，配制成每1ml含补骨脂素30μg、异补骨脂素30μg、五味子醇甲50μg的溶液，作为对照品溶液；
上述步骤（2）所述供试品溶液的制备是：四神片除去包衣后精密称取0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，浸泡，超声处理45分钟(50kHz,室温)，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
上述步骤（3）所述色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为乙腈与水组成的梯度洗脱液；柱温：35℃；检测波长246nm；流速： 1.0ml/min；分析时间：90min
上述步骤（4）所述的梯度洗脱，优选梯度洗脱程序以如下体积浓度配比进行。流动相A为乙腈，流动相B为水。
         表1.四神片指纹图谱优选梯度洗脱程序
时间 流动相A（%） 流动相B（%）
0 5 95
20 30 70
25 40 60
60 80 20
70 80 20
上述步骤（3）所述测定是精密吸取供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到四神片指纹图谱。
与现有技术相比，本发明具有以下优点；
1.本发明所提供的方法建立的四神片HPLC指纹图谱与对照图谱的相似度均大于0.9，能有效地表征其质量，有利于全面监控产品的质量；
2. 本发明建立了四神片HPLC特征指纹图谱共有模式，标定了15个共有峰，建立的指纹图谱技术含量高，避免了只测定单个化学成分进行质量控制的单一性和片面性，从整体上充分反映了四神片化学成分的信息，减少了人为处理产品质量达标的可能性；
3.本发明具有方法简便，稳定、精密度高、重现性好等优点，可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。
下面通过实施例和附图详细阐明本发明的技术方案，所列举的实施例及附图对本发明并无限制。
附图说明
图1是四神片对照品图谱。
图2是四神片样品指纹图谱。
图3是10批四神片样品指纹图谱。
图4是10批四神片样品指纹图谱匹配后谱图。
图5是四神片制剂标准指纹图谱。
图6是肉豆蔻药材的指纹图谱。
图7是吴茱萸药材的指纹图谱。
图8是补骨脂药材的指纹图谱。
图9是五味子药材的指纹图谱。
图10是大枣药材的指纹图谱。
具体实施方式
实施例1：四神片的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
 1．仪器与试药
1.1 仪器  Shimazu高效液相色谱仪，LC-20紫外检测器，Labsolution色谱工作站。
1.2试剂  补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲对照品；乙腈（色谱纯）、二次重蒸水、磷酸（分析纯）。
2 .高效液相色谱
2.1 色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，Phenomenex色谱柱：C18（250 ×4.6 mm, 5 μm）；采用梯度洗脱，流动相为乙腈与水组成的梯度洗脱液；柱温：35℃；检测波长246nm；流速： 1.0ml/min；进样量：10μL。理论塔板数按补骨脂素技术应不低于5000。
梯度洗脱程序如下表，流动相A为乙腈，流动相B为水。
表1.四神片指纹图谱优选梯度洗脱程序
时间 流动相A（%） 流动相B（%）
0 5 95
20 30 70
25 40 60
60 80 20
70 80 20
2.2对照品溶液的制备：精密称取补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲、 对照品适量至于容量瓶，用甲醇稀释至刻度，配制成每1ml含补骨脂素30μg、异补骨脂素30μg、五味子醇甲50μg的溶液，作为对照品溶液；
2.3供试品溶液的制备：四神片除去包衣后精密称取0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，浸泡，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
3 . 测定：精密吸取供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到四神片指纹图谱。见图1、图2。
实施例2  检测10批次四神片的指纹图谱
取四神片10批次，按实施例1 条件进行检测，得10批样品的HPLC图谱，如图3所示。通过10批HPLC图谱的比较，进行相似度评价，确定其特征共有峰：
指纹图谱中有15个特征共有峰，现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及占总面积比例，具体如下：
1号峰，平均保留时间RT为3.21min，RSD为0.11%，峰面积为129767，RSD为15.27%，占总峰面积的3.28%。
2号峰，平均保留时间RT为11.090min，RSD为4.09%，峰面积为229612，RSD为10.68%，占总峰面积的5.80%。
3号峰，平均保留时间RT为11.553min，RSD为3.81%，峰面积为131519，RSD为12.46%，占总峰面积的3.32%。
4号峰，平均保留时间RT为30.305min，RSD为0.22%，峰面积为895077，RSD为5.82%，占总峰面积的22.62%。
5号峰，平均保留时间RT为31.075min，RSD为0.18%，峰面积为129074，RSD为5.34%，占总峰面积的3.26%。
6号峰，平均保留时间RT为38.518min，RSD为0.18%，峰面积为129074，RSD为5.34%，占总峰面积的3.26%。
7号峰，平均保留时间RT为38.934min，RSD为0.19%，峰面积为106947，RSD为5.40%，占总峰面积的2.70%。
8号峰，平均保留时间RT为39.612min，RSD为0.18%，峰面积为57273，RSD为5.48%，占总峰面积的1.45%。
9号峰，平均保留时间RT为42.359min，RSD为0.16%，峰面积为25265，RSD为7.21%，占总峰面积的3.17%。
10号峰，平均保留时间RT为44.085min，RSD为0.17%，峰面积为89586，RSD为5.55%，占总峰面积的2.26%。
11号峰，平均保留时间RT为46.327min，RSD为0.17%，峰面积为50819，RSD为6.32%，占总峰面积的1.28%。
12号峰，平均保留时间RT为46.884min，RSD为0.16%，峰面积为63158，RSD为5.08%，占总峰面积的1.60%。
13号峰，平均保留时间RT为48.405min，RSD为0.16%，峰面积为144521，RSD为3.92%，占总峰面积的3.65%。
14号峰，平均保留时间RT为50.001min，RSD为0.15%，峰面积为86223，RSD为5.29%，占总峰面积的2.18%。
15号峰，平均保留时间RT为59.416min，RSD为0.13%，峰面积为959208，RSD为5.85%，占总峰面积的24.24%。
如上所述，四神片的指纹图谱中共含有15个特征共有峰，其中最强峰为4号峰，定为参照峰即S峰，参照峰为补骨脂素，图谱总长度为70min，其中单峰面积超总峰面积1%的峰有15个，它们是1～15号峰；其中单峰面积超总峰面积5%的峰有4个，它们是2号峰、4号峰、5号峰、15号峰；单峰面积超总峰面积10%的峰有3个，是4号峰、5号峰、15号峰。以4号峰为参照峰，各峰的相对保留时间和相对峰面积见表2、表3。
相似度评价：采用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价***软件（2004A版）对HPLC图谱进行综合评价，相似度评价结果见表4、表5，经匹配后的图谱见附图4。
 
                          表2. 10批次四神片指纹图谱中各共有峰的相对保留时间
  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A RSD(%)
1 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.13
2 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.36 0.35 0.34 0.36 0.35 0.37 4.28
3 0.40 0.40 0.39 0.39 0.39 0.37 0.36 0.36 0.37 0.37 0.38 3.99
4 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.00
5 1.03 1.03 1.03 1.03 1.03 1.03 1.03 1.03 1.03 1.03 1.03 0.00
6 1.27 1.27 1.27 1.27 1.27 1.27 1.27 1.27 1.27 1.27 1.27 0.04
7 1.29 1.29 1.29 1.28 1.28 1.28 1.28 1.28 1.28 1.28 1.28 0.03
8 1.31 1.31 1.31 1.31 1.31 1.31 1.31 1.31 1.31 1.31 1.31 0.04
9 1.40 1.40 1.40 1.40 1.40 1.40 1.40 1.40 1.40 1.40 1.40 0.06
10 1.46 1.46 1.46 1.45 1.45 1.45 1.45 1.45 1.45 1.45 1.45 0.05
11 1.53 1.53 1.53 1.53 1.53 1.53 1.53 1.53 1.53 1.53 1.53 0.05
12 1.55 1.55 1.55 1.55 1.55 1.55 1.55 1.55 1.55 1.55 1.55 0.06
13 1.60 1.60 1.60 1.60 1.60 1.60 1.60 1.60 1.60 1.60 1.60 0.06
14 1.65 1.65 1.65 1.65 1.65 1.65 1.65 1.65 1.65 1.65 1.65 0.07
15 1.96 1.96 1.96 1.96 1.96 1.96 1.96 1.96 1.96 1.96 1.96 0.09
                        表3.10批次四神片指纹图谱中各共有峰的相对峰面积
  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A RSD(%)
1 0.12 0.16 0.13 0.13 0.13 0.17 0.15 0.17 0.15 0.14 0.14 12.58
2 0.29 0.27 0.27 0.27 0.26 0.26 0.26 0.24 0.22 0.21 0.26 8.81
3 0.13 0.15 0.14 0.15 0.15 0.14 0.13 0.16 0.16 0.17 0.15 9.04
4 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.00
5 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.84 0.84 0.85 0.61
6 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.15 0.14 0.55
7 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.60
8 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.51
9 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 1.41
10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.43
11 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 1.05
12 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 1.01
13 0.16 0.15 0.16 0.17 0.15 0.16 0.16 0.16 0.17 0.17 0.16 3.24
14 0.10 0.10 0.10 0.10 0.09 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 1.33
15 1.07 1.07 1.07 1.07 1.07 1.07 1.07 1.07 1.08 1.07 1.07 0.29
表4.10批次四神片样品相似度评价结果
  S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 对照指纹图谱
S1 1.000 0.986 0.983 0.990 0.989 0.972 0.965 0.964 0.959 0.988 0.991
S2 0.986 1.000 0.976 0.984 0.990 0.975 0.960 0.969 0.967 0.985 0.990
S3 0.983 0.976 1.000 0.986 0.981 0.959 0.946 0.956 0.965 0.977 0.985
S4 0.990 0.984 0.986 1.000 0.996 0.964 0.949 0.965 0.955 0.981 0.988
S5 0.989 0.990 0.981 0.996 1.000 0.975 0.960 0.976 0.965 0.987 0.993
S6 0.972 0.975 0.959 0.964 0.975 1.000 0.988 0.988 0.983 0.984 0.990
S7 0.965 0.960 0.946 0.949 0.960 0.988 1.000 0.984 0.980 0.974 0.982
S8 0.964 0.969 0.956 0.965 0.976 0.988 0.984 1.000 0.989 0.973 0.988
S9 0.959 0.967 0.965 0.955 0.965 0.983 0.980 0.989 1.000 0.969 0.985
S10 0.988 0.985 0.977 0.981 0.987 0.984 0.974 0.973 0.969 1.000 0.993
DZ 0.991 0.990 0.985 0.988 0.993 0.990 0.982 0.988 0.985 0.993 1.000
表5.10批样品相似度评价结果2
批号 相似度（参照） 相似度（对照）
S1 1.000 0.991
S2 0.986 0.990
S3 0.983 0.985
S4 0.990 0.988
S5 0.989 0.993
S6 0.973 0.990
S7 0.965 0.982
S8 0.964 0.988
S9 0.959 0.982
S10 0.988 0.993
实施例3 四神片标准指纹图谱及各共有峰归属
3.1标准指纹图谱的生成
取四神片10批次，按实施例1 条件进行检测，得10批样品的HPLC图谱，如图5所示。采用中药色谱指纹图谱相似度评价***软件（2004A版）进行相似度评价，方法同实施例2，并生成标准指纹图谱，见图5。
3.2指纹图谱各共有峰的归属
依法测定四神片中各药材的指纹图谱，并将其分别与四神片对照图谱导入指纹图谱相似度评价软件（中药色谱指纹图谱相似度评价***，2004A版）中，通过比较色谱峰保留时间表示其对共有峰的贡献，确定四神片样品指纹图谱在药材图谱上的归属。
3.2.1肉豆蔻药材指纹图谱
肉豆蔻药材指纹图谱色谱图见图6，共有峰归属见表6。
表6.四神片样品共有峰归属肉豆蔻药材
共有峰号 保留时间平均值 保留时间RSD%
9 42.359 0.10
10 44.085 0.19
11 46.327 0.19
3.2.2吴茱萸药材指纹图谱
吴茱萸药材指纹图谱色谱图见图7，共有峰归属见表7。
表7.四神片样品共有峰归属吴茱萸药材
共有峰号 保留时间平均值 保留时间RSD%
8 39.612 0.25
3.2.3补骨脂药材指纹图谱
补骨脂药材指纹图谱色谱图见图8，共有峰归属见表8。
表8.四神片样品共有峰归属补骨脂药材
共有峰号 保留时间平均值 保留时间RSD%
4 30.305 0.29
5 31.075 0.30
6 38.518 0.25
12 46.884 0.22
13 48.405 0.23
14 50.001 0.23
15 59.416 0.10
3.2.4五味子药材指纹图谱
五味子药材指纹图谱色谱图见图9，共有峰归属见表9。
表9.四神片样品共有峰归属五味子药材
共有峰号 保留时间平均值 保留时间RSD%
1 3.210 0.15
7 38.934 0.12
3.2.5大枣药材指纹图谱
大枣药材指纹图谱色谱图见图10，共有峰归属见表10。
表10.四神片样品共有峰归属大枣药材
共有峰号 保留时间平均值 保留时间RSD%
2 11.090 0.22
3 11.553 0.22
综上所述，四神片制剂标准图谱中15个共有峰均可以找到明确归属，处方中肉豆蔻、吴茱萸、补骨脂、五味子、大枣等5味药材的特征峰均能在四神片制剂指纹图谱中体现；方中生姜药材在该色谱条件下基本检不出特征峰。
通过将四神片制剂的HPLC色谱图与标准指纹图谱进行比较，对其相似度进行评价，可快速、有效地鉴别产品的真伪优劣。

Claims (5)

1.一种四神片制剂指纹图谱的建立方法，采用液相色谱法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：分别精密称取补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲对照品适量，用甲醇配制成10～100μg/mL的溶液，作为对照品溶液；
（2）供试品溶液的制备：四神片去包衣后精密称取0.1～10g，用甲醇超声提取，提取液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
（3）采用液相色谱法测定指纹图谱：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱；
（4）采用液相色谱法测定指纹图谱的色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相由流动相A和流动相B组成的梯度洗脱液，流动相A为乙腈，流动相B为水；检测波长220nm～360nm；柱温20～50℃；流速0.5～1.5mL/min；时间30～90min。
2.如权利要求1所述的四神片制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤（2）供试品溶液的制备是：四神片去包衣后精密称取0.1～10g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10～100ml，密塞，称定重量，浸泡，超声处理后，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
所述步骤（3）采用液相色谱法测定指纹图谱是：精密吸取供试品溶液5～25μL注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，即得指纹图谱。
3. 如权利要求1所述的四神片制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于：
所述步骤（2）供试品溶液的制备是：四神片除去包衣后精密称取0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，浸泡，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
所述步骤（4）色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为水与乙腈组成的梯度洗脱液，水（%）95～20：乙腈（%）5～80；柱温：35℃；检测波长246nm；流速： 1.0ml/min；分析时间：70min。
4. 如权利要求1所述的四神片制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤（4）中所述的梯度洗脱，梯度洗脱以如下体积浓度配置进行:
0分钟时，流动相A为5%，流动相B为95%；
20分钟时，流动相A为30%，流动相B为70%；
25分钟时，流动相A为40%，流动相B为60%；
60分钟时，流动相A为80%，流动相B为20%；
70分钟时，流动相A为80%，流动相B为20%。
5. 如权利要求1所述四神片制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于制得到的四神片制剂HPLC指纹图谱有15个共有峰，峰号为1～15，以其中特征峰（4）补骨脂素峰为参照峰，峰号；相对保留时间分别为：1（0.11）、2（0.37）、3（0.38）、4（1.00）、5（1.03）、6（1.27）、7（1.28）、8（1.31）、9（1.40）、10（1.45）、11（1.53）、12（1.55）、13（1.60）、14（1.65）、15（1.96）。
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