CN104178566A - 一种可用于微卫星检测的多重荧光pcr通用接头及检测方法和应用 - Google Patents

一种可用于微卫星检测的多重荧光pcr通用接头及检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头，包括4条接头，分别为接头1、接头2、接头3和接头4，接头1～4的核苷酸序列如SEQ ID：1～4中所示，该通用接头PCR扩增效率高，不互相干扰，也不会对待扩增微卫星引物产生干扰。还公开了一种利用上述可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头进行微卫星多重荧光PCR检测的方法，该方法进行多重PCR时只需合成4条活3条荧光接头即可进行引物筛选和分型实验，步骤简洁，实验时间短，实验成本低。

Description

一种可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头及检测方法和应用
技术领域
本发明属于多重荧光PCR技术领域，具体涉及一种可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头及利用其进行微卫星多重PCR检测的方法和应用。 
背景技术
微卫星(Microsatellite)又称简单序列重复(Simple Sequence Repeat，SSR)、短串联重复(Short tandem repeats)、简单序列长度多态性(Simple sequence length polymorphism)，它是DNA分子中的一个片段，以1-6bp的核苷酸序列(称为核心序列，coresequence)成首尾相连串联重复均匀地分布在整个基因组中的高度重复序列。一般长几十至几百bp。它们广泛分布在各种真核生物基因组中，且分布比较均匀。微卫星的等位基因具有突变快、多态性高、杂合度大、信息含量丰富、呈共显性等和在实验操作中材料易得且样品需要量少、操作程序简单且难度系数小、可用PCR扩增检测位点且等位基因条带易于识别等特点。微卫星标记多用来分析生物遗传多样性、群体的遗传结构及种群的亲缘关系、遗传图谱的建立和基因定位、种质资源的保护和微卫星DNA指纹库的建立等。微卫星位点的PCR扩增主要采用单对引物扩增和多重PCR扩增方式，根据检测技术的不同其引物采用普通引物或荧光标记引物。 
单对引物扩增使用普通引物，每个PCR反应体系中仅扩增一个位点，然后使用凝胶电泳的方法分离，确定扩增的等位基因，操作方法和仪器设备比较简单，但效率较低。 
多重PCR(multiplex PCR)可以将多对经过荧光标记的引物在同一反应体系中同时扩增，可以将2对以上至20对微卫星引物进行同时扩增，通过目的片段大小范围的不同和标记荧光不同区分不同位点的扩增产物。进行微卫星多重PCR的分型多利用ABI公司的遗传分析仪进行，可以进行4(FAM、JOE，NED和ROX)色或5色(FAM、VIC、PET，NED和LIZ)荧光分型(除分子量marker内标使用1色荧光，实际使用3色或4色荧光)，即除利用片段大小范围的不同进行区分外，还可以将片段大小重叠的3对或4对引物通过标记不同颜色的荧光进行区分。这样可以增加多重PCR的引物数。多重PCR需要预先对待扩增的微卫星引物进行扩增效率、组合的匹配程度进行试验，一旦确定引物组合，就可以极大的提高后续实验效率。多重PCR技术是将来微卫星标 记分型的主流技术手段，将极大的促进微卫星标记的应用。 
目前进行多重PCR都是对所有正向引物的5’端进行荧光标记。例如，对于一组同时进行10个位点扩增的多重PCR体系，需要将10对引物的正向引物分别进行荧光标记，这就需要合成10条荧光标记引物。荧光引物的合成费用比普通引物高的多，根据标记荧光不同，每条引物普遍需要300～500元/2OD，而且合成的周期也比普通引物长的多。实验过程中若合成的引物不能加入多重PCR体系，则合成的荧光引物就不能用于后续实验。确定一组多重PCR引物，一般合成的荧光标记引物只有一部分能够用于实验，造成经费和时间的浪费。 
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头，该通用接头PCR扩增效率高，不互相干扰，也不会对待扩增微卫星引物产生干扰。 
本发明的第二个目的在于提供一种利用上述可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头进行微卫星多重PCR检测的方法，该方法进行多重PCR时只需合成4条或3条荧光接头即可进行引物筛选和分型实验，步骤简洁，实验时间短，实验成本低。 
本发明的最后一个目的在于提供上述可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头在微卫星位点检测方面的应用。 
本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种多重荧光PCR通用接头，包括4条接头，分别为接头1、接头2、接头3和接头4，接头1～4的核苷酸序列如SEQID：1～4中所示。 
其中接头1-4的核苷酸序列如下： 
接头1：CACGACGTTGTAAAACGAC 
接头2：CAGGAACTCAGTGTGACACTC 
接头3：CGACAGACAGTAAGGTCTCTG 
接头4：AGCTCGACCAGTGAGTCAG。 
本发明用到的4种荧光标记接头由ABI公司合成，也可用其他同色荧光替代，这4个接头是根据细菌的质粒序列设计的，目的是与真核生物的序列同源性最低，避免非特异性扩增干扰，其可以应用在微卫星的多重PCR检测中，也可应用于其他多重PCR中。 
4种接头可以分别标记4种荧光，荧光和接头可以任意组合，但不能重复。一旦选定，即确定接头与荧光的对应关系。若使用5色荧光***，可使用上述4条接头(对应 FAM、VIC、PET，NED四色荧光)，若使用4色荧光***，可任选其中3条接头(对应FAM、JOE，NED三色荧光)。 
本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种利用上述可用于微卫星位点检测的多重荧光PCR通用接头进行微卫星检测的方法，包括以下步骤： 
(1)选取样品，提取样品的基因组DNA； 
(2)合成多个微卫星引物的接头-正向引物、反向引物及荧光标记接头； 
(3)将每个微卫星引物的接头-正向引物与反向引物混合，再将各个微卫星引物混合，得混合引物，在混合引物中加入荧光标记接头，作为多重PCR的引物； 
(4)将多重PCR的引物加入到PCR反应体系中，进行正常多重PCR扩增，扩增产物用ABI遗传分析仪进行分析，获得样品的各微卫星位点的扩增图谱。 
多重PCR是基于扩增片断的大小范围和荧光颜色来区别不同位点，片断大小范围不重叠的可用同种荧光，有重叠的就需要用不同荧光来区分，本发明是将需要标记荧光相同的引物连接相同的接头，来避免每个引物都使用荧光标记。可按照引物扩增片段的大小确定每对引物的接头(即对应的荧光)。 
其中，步骤(1)中提取样品的基因组DNA可以采用本领域的常规技术手段提取，优选采用MicroElute Genomic DNA Kit(OMEGA，USA)试剂盒提取。 
步骤(2)中合成多对微卫星引物，这里可以针对不同的样品，根据本领域常规的技术手段来合成，优选由英潍捷基公司(广州)合成。 
本发明中若是用于以前确定的多重PCR组合，原来的荧光类型和引物的对应关系是确定的，本发明中的接头与荧光是相对应的，进而与引物对应，若是还未确定的多重PCR组合，可重新构建体系。 
4条接头根据细菌的质粒序列设计。 
荧光标记接头根据所用的荧光***合成荧光标记的接头，优选由ABI公司合成。 
步骤(2)中对于5色荧光***，所述荧光标记接头为4条荧光标记接头，所述荧光为FAM、VIC、PET和NED四色荧光，对于4色荧光***，所述荧光标记接头为3条荧光标记接头，所述荧光为FAM、JOE和NED三色荧光。 
其中各条荧光标记接头的用量以相同为佳。 
步骤(2)中在标记同一荧光的正向引物前连接同一接头，以避免每个正向引物都需要进行荧光标记。 
步骤(3)中将每个微卫星引物的接头-正向引物与反向引物按1：40的摩尔比混合。 
步骤(3)中所述荧光标记接头的摩尔用量与反向引物的摩尔用量相同。 
步骤(3)中各个微卫星的引物混合时，引物的比例可根据每个引物在多重PCR中的扩增效率来确定，扩增效率高的降低浓度，扩增效率低的提高浓度，目的是使每对引物的扩增产物浓度相近。 
步骤(4)中多重PCR的反应体系为10μL，包括AB Multiplex PCR Master Mix5μL，混合引物2μL，荧光标记接头0.2μL，去离子水1.8μL，DNA20ng。 
步骤(4)中只要是基于荧光检测的高分辨率电泳***都可，目前适用的仪器是ABI公司的遗传分析仪，ABI遗传分析仪可以采用ABI遗传分析仪310、3130、3130xl、3730等。 
本发明的最后一个目的是通过以下技术方案来实现的：上述多重荧光PCR通用接头在微卫星的多重PCR检测方面的应用，具体包括上述多重荧光PCR通用接头在多重PCR体系中等位基因扩增与分离方面的应用。 
与现有技术相比，本发明具有如下优点： 
(1)成本大幅降低，不管进行多少重多重PCR或多少个引物组合，都只需合成4条或3条荧光标记接头，进行多重PCR实验越多，节省经费越多； 
(2)节省时间，一般荧光引物的合成周期是一周(ABI专利荧光合成周期更长，达几周)，而普通引物只需2天，在筛选引物阶段，只需合成带有接头序列的普通引物进行筛选，筛选完后可以立即进行实验，免去了筛选后再合成荧光引物的时间； 
(3)通用性强，本发明的4条接头序列接头1是细菌质粒通用引物，接头2-4是根据其他通用引物序列改造后获得，与真核生物基因组同源性低，减少非特性扩增，引物序列已在鲮鱼和黄喉拟水龟中验证并成功应用。 
附图说明
图1是实施例1中使用本发明中的通用接头在鲮鱼多重PCR中等位基因扩增与分离结果； 
图2是实施例2中使用本发明中的通用接头在黄喉拟水龟多重PCR中等位基因扩增与分离结果。 
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。 
实施例1 
本实施例中采用的可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头，包括4条接头，分别为接头1、接头2、接头3和接头4，接头1～4的核苷酸序列如SEQ ID：1～4中所示。 
微卫星检测多应用于真核生物，通用接头的选择主要考虑与真核生物的DNA序列相似性最低，遂选择原核生物细菌的质粒序列来设计接头。细菌质粒中已经有通用引物用于克隆测序，本发明使用其中一条M13通用引物，即接头1。利用primer5软件检测接头1的退火温度为51.8℃，为使接头的扩增效率接近，以此为标准在质粒全序列中寻找序列设计退火温度相近的引物，通过改变引物的碱基，使其退火温度接近51.8℃，最后设计出接头2-4，其退火温度在51.7℃-52℃之间，差异很小，而4条接头序列间差异较大，减少相互干扰。 
本实施例提供的利用上述可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头进行微卫星多重荧光PCR检测方法，及利用上述4条接头组合在鲮鱼多重PCR体系中等位基因扩增与分离的应用，包括以下步骤： 
(1)取样 
剪取鲮背鳍鳍条，置于无水乙醇中浸泡，-20℃保存备用； 
(2)基因组DNA的提取 
取样本鳍条约10～20mg，用MicroElute Genomic DNA Kit(OMEGA，USA)试剂盒提取基因组DNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，DNA经NanoQTM微型分光光度计(博奥)检测浓度，并用去离子水稀释至终浓度20ng/μL,置于-20℃保存备用； 
(3)微卫星引物合成 
以鲮鱼16对条带清晰、多态性丰富、稳定性及特异性强的引物进行多重PCR体系构建，引物由英潍捷基公司(广州)合成，16对引物、添加接头的正向引物序列、反向引物序列以及荧光标记接头见表1，荧光标记的接头由ABI公司合成，PCR扩增前将每对引物上下游按照1:40(物质的量比)混合，在涡旋混合器上混匀后再按比例组成混合引物，引物的比例要根据每个引物在多重PCR中的扩增效率来确定，扩增效率高的降低浓度，扩增效率低的提高浓度，目的是使每对引物的扩增产物浓度相近； 
表1 16对鲮微卫星引物序列特征及混合比例 
本实施例采用5色荧光***，其中一色荧光被分子量marker内标占用，所以能够供标记接头就是4种荧光，分别为PET、VIC、NED和FAM。 
(4)多重PCR体系构建 
多重PCR反应体系为10μL，其中包含：AB Multiplex PCR Master Mix5μL，混合引物(含上下游)2μL，浓度为10μM，荧光标记接头0.2μL(其中每条荧光标记接头的用量相同)，浓度为100μM，去离子水1.8μL，DNA20ng； 
扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火45s，72℃延伸70s，24个循环；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，8个循环,72℃再延伸10min。 
混合引物中各引物的比例见上表1。 
(5)结果 
利用本发明的4个荧光接头成功进行多重PCR，在鲮鱼微卫星标记中同时扩增16个微卫星位点，扩增结果见图1。 
实施例2 
本实施例中采用的可用于微卫星检测的4条多重荧光PCR通用接头同实施例1。 
本实施例提供的利用上述的可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头进行多重PCR扩增的方法及其在黄喉拟水龟多重PCR体系中等位基因扩增与分离中的应用具体如下： 
(1)取样 
抽取10～20μL黄喉拟水龟血液，置于装有200μL buffer TL(MicroElute Genomic DNA Kit试剂盒，OMEGA，USA)的离心管中，冰盒保存(用于当天提取DNA)； 
(2)基因组DNA的提取 
用MicroElute Genomic DNA Kit试剂盒提取基因组DNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，DNA经NanoQTM微型分光光度计(博奥)检测浓度，并用去离子水稀释至终浓度20ng/μL,置于-20℃保存备用； 
(3)微卫星引物合成 
以黄喉拟水龟条带清晰、多态性丰富、稳定性及特异性强的10对微卫星引物进行多重PCR体系构建，引物由英潍捷基公司(广州)合成，10对引物、添加接头序列的正向引物(上游引物)、反向引物(下游引物)以及荧光标记接头见表2，荧光标记的接头由ABI公司合成，PCR扩增前将每对引物上下游按照1:40(摩尔比)混合，在涡旋混合器上混匀后再按比例组成混合引物； 
表2 10对黄喉拟水龟微卫星引物序列特征及混合比例 
本实施例采用5色荧光***，其中一色荧光被分子量marker内标占用，所以能够供标记接头就是4种荧光，分别为PET、VIC、NED和FAM。 
(4)多重PCR体系构建 
多重PCR反应体系为10μL，其中包含：AB Multiplex PCR Master Mix5μL，混合引物(含上下游引物)2μL，荧光标记接头0.2μL，去离子水1.8μL，DNA1μL。 
扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57.5℃退火40s，72℃延伸40s，22个循环；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸30s，8个循环,72℃再延伸10min,4℃保存。 
混合引物中各引物的比例见表2。 
(5)结果 
利用本发明的4个荧光接头成功进行多重PCR，在黄喉拟水龟中同时扩增10个微卫星位点，扩增结果见图2。 
结论：本发明提供的4个通用接头可以成功应用于微卫星标记的多重PCR，接头本身不会对各引物的扩增产生干扰，接头之间也不会互相干扰，在鲮(鱼类)和黄喉拟水龟(爬行动物)中得到验证。本发明提供的接头组合和使用方法是一种扩增效率高，通用性强的微卫星扩增技术，可以在真核生物中得到广泛应用。 
目前现在大部分仪器都使用5色荧光***，4色荧光***是比较老的机型，目前已经逐步淘汰，本发明也可以采用4色荧光***来进行，此处不再一一列举。 
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。 

Claims (10)

1.一种可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头，其特征是：包括4条接头，分别为接头1、接头2、接头3和接头4，接头1～4的核苷酸序列如SEQ ID：1～4中所示。
2.根据权利要求1所述的可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头，其特征是：对于5色荧光***，选用4条接头，对于4色荧光***，选用4条接头中的3条接头即可。
3.根据权利要求2所述的可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头，其特征是：所述4条接头可与4种不同的荧光任意组合。
4.一种利用权利要求1所述的可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头进行微卫星多重荧光PCR检测方法，其特征是包括以下步骤：
(1)选取样品，提取样品的基因组DNA；
(2)合成多个微卫星引物的接头-正向引物、反向引物及荧光标记接头；
(3)将每个微卫星引物的接头-正向引物与反向引物混合，再将各个微卫星引物混合，得混合引物，在混合引物中加入荧光标记接头，作为多重PCR的引物；
(4)将多重PCR的引物加入到PCR反应体系中，进行正常多重PCR扩增，扩增产物用ABI遗传分析仪进行分析，获得样品的各微卫星位点的扩增图谱。
5.根据权利要求4所述的可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头进行微卫星多重荧光PCR检测方法，其特征是：步骤(2)中对于5色荧光***，所述荧光标记接头为4条荧光标记接头，所述荧光为FAM、VIC、PET和NED四色荧光，对于4色荧光***，所述荧光标记接头为3条荧光标记接头，所述荧光为FAM、JOE和NED三色荧光。
6.根据权利要求4所述的可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头进行微卫星多重荧光PCR检测方法，其特征是：步骤(2)中在标记同一荧光的正向引物前连接同一接头，以避免每个正向引物都需要进行荧光标记。
7.根据权利要求4所述的可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头进行微卫星多重荧光PCR检测方法，其特征是：步骤(3)中将每个微卫星引物的接头-正向引物与反向引物按1：40的摩尔比混合。
8.根据权利要求4所述的可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头进行微卫星多重荧光PCR检测方法，其特征是：步骤(3)中所述荧光标记接头的摩尔用量与反向引物的摩尔用量相同。
9.根据权利要求4所述的可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头进行微卫星多重荧光PCR检测方法，其特征是：步骤(4)中多重PCR的反应体系为10μL，包括AB Multiplex PCR Master Mix5μL，混合引物2μL，荧光标记接头0.2μL，去离子水1.8μL，DNA20ng。
10.权利要求1所述的可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头在微卫星的多重PCR检测方面的应用。
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